Belirli Fonksiyonel İçsel Sinyal birleştiren tarafından neokorteks Mikro-etki ve İki foton Görüntüleme nöronlar Hedefli Etiketleme

Bu prosedürün genel amacı, nöronların yapısını ve işlevini yüksek çözünürlükte incelemek için işlevsel bir haritadaki mikro alanları hassas bir şekilde hedeflemektir. Bu, ilgilenilen uyaran özelliğinin bir haritasını elde etmek için önce geniş bir korteks alanı üzerinde içsel sinyal görüntüleme gerçekleştirilerek gerçekleştirilir. İkinci adım, yüksek çözünürlüklü foton görüntüleme için hedeflenecek olan haritadaki kesin konumu belirlemektir.

Daha sonra, floresan boya ile yüklenen pipeti dikkatlice yerleştirdikten sonra, nöronlar floresan işaretleyici ile etiketlenir. Son olarak, nöronal tepkilerin veya yapıların foton görüntülerine yüksek çözünürlüklü toplanır. Sonuç olarak, içsel bir sinyal özellik haritası, daha sonra tek nöron çözünürlüğünde çalışma için hedeflenebilecek bir oryantasyon fırıldak tekilliği gibi bir ilgi alanını bulmak için kullanılabilir.

Bu protokolün ana avantajı, sistemde sadece birkaç hızlı ayarlama ile aynı mikroskop kurulumunu kullanarak korteksi farklı uzamsal ölçeklerde görüntüleyebilmesidir. Bu, yüksek çözünürlüklü görüntüleme için floresan problarla etiketlenecek bir nöron bölgesini seçmek için bir kılavuz olarak rota çözünürlüklü içsel sinyal haritasını kullanmak için bu tekniklerin birleştirilmesine izin verir. Hayvan, kurumsal hayvan bakımı indüklenen komite onaylı protokole göre anestezi altına alındı ve kafatası açıkta bırakıldı ve temizlendi.

Dental çimento karışımı, ortasında dikdörtgen bir açıklık bulunan paslanmaz çelik bir kafa plakasını kafatasına tutturmak için kullanılmıştır. Kafa plakasının üstündeki metal bir oda, suya daldırma objektif lensi ile görüntüleme için bir rezervuar görevi görür. Kafa plakası, metal direkler kullanılarak bir XY aşamasına sabitlenmiştir.

Kafa plakasının dikdörtgen açıklığı içindeki geniş bir kemik alanını inceltmek için bir diş matkabı kullanın. Ara sıra kanamayı durdurmak için gerekli kemik mumlarını uygulamak. İnce alan, planlanan kraniyotominin sınırlarının ötesine uzanmalıdır.

Daha sonra kraniyotomi için kemikte ikiye iki milimetre karelik bir taslak delin. Kemik parçalarını çıkarmak ve alttaki kortekse ısı dağılımını en aza indirmek için hazneyi periyodik olarak taze yapay beyin omurilik sıvısı ile durulayın. Şimdi, kemiği üç numaralı forseps ile kaldırın.

Dura'nın üst katmanlarını çıkarmak için beş numaralı forseps ve Vana yaylı makas kullanın ve alt katmanı sağlam bırakın. Dura'nın son tabakası şeffaftır ve soyma kapları içinden açıkça görülebilmelidir. A CS'de çözülmüş bir damla ılık% 2 aeros uygulayın ve hemen kraniyotominin üzerine bir kapak camı yerleştirin.

İlk olarak, içsel sinyal görüntüleme sırasında agrosların kurumasını önlemek için kapak camının dışına A BOS ile ıslatılmış bir jel köpük. Ardından, içsel sinyal görüntüleme CCG kamerasını iki fotomikroskobun üstündeki standart C montaj bağlantı noktasına takın ve XY sahne konumuna yakın hava tablasına aydınlatıcı bir ışık kaynağı yerleştirin ve ışık kılavuzunu kraniyotomi üzerine sabitleyin. Birincil dikroik ve aynayı deniz dağı portunun altına geri çekin, böylece içsel sinyaller için gereken yansıyan kırmızı ışık doğrudan kraniyotomiden CCD kameraya geçecektir.

Korteksin ısınmasını önlemek için ışık yoluna bir kızılötesi filtre yerleştirin. Ardından yeşil ışığı geçen bir filtre yerleştirin ve kortikal yüzey kan damarlarının dijital referans görüntüsünü kaydedin. Ardından, Z odağını kortikal yüzeyin 500 mikron altına getirin.

İçsel sinyalleri ölçmek için korteksi aydınlatmak için yeşil filtreyi kırmızı bir filtreyle değiştirin. Korteksin eşit şekilde aydınlatıldığından emin olun. Kraniotomiyi görsel uyaran ekranı tarafından üretilen ışıktan koruyun ve bir dizi görsel uyaran sunun ve bir oryantasyon haritası oluşturmak için yansıtma veri görüntülerini kaydedin 10 dakika içinde, dört oryantasyon ve her oryantasyon için iki yön ile sekiz uyaran dizisinin dört tekrarına karşılık gelen verileri toplayın.

Şimdi, burada görüldüğü gibi yanlış bir yönlendirme renk haritası oluşturmak için içsel sinyal verilerini analiz edin. Ardından, nöronların iki foton etiketlemesi için potansiyel hedef bölgeleri seçin. Örneğin, oryantasyon fırıldak tekillikleri haritada tüm tercih edilen yönlerin birleştiği noktaları gösterir.

Daha sonra, oryantasyon haritasını ve kortikal yüzey damar sisteminin görüntüsünü kaplayın ve büyük kan damarları ve arterlerin bulunduğu yerlerden kaçınarak bir hedef seçmek için fonksiyonel alanların düzenini ve büyük yüzey damarlarının konumunu kullanın. Floresan D çözeltilerini hazırlayın ve yazılı protokoldeki talimatlara göre uzun bir konik pipet çekin. Pipete beş mikrolitre boya karışımı yükleyin.

Ardından, pipetin yerleştirilmesini kolaylaştırmak ve bu şemada gösterildiği gibi en yüksek kalitede iki foton görüntüsü elde etmek için son dura katmanını çıkarın. Pipet, hazne ile objektif arasından geçmek için kortekse 30 derecelik bir açıyla sürülmelidir. Bu nedenle, pipet giriş konumunun kortikal yüzey konumu, doğrudan hedeflenen ilgi alanı üzerinde olmayacaktır.

Örneğin, kortikal yüzeyin 200 mikron altındaki bir hedef bölgeyi etiketlemek için, kortikal yüzeydeki pipet giriş konumu, hedef konumun yaklaşık 350 mikron yanal olacaktır. 20 x veya 40 x objektifin altındaki kortikal yüzey giriş konumunu ortalamak için XY aşamasını hareket ettirin. Giriş konumu hedefin altında ortalandıktan sonra, hedefin Z konumunu iki milimetre yükseltin.

Ardından yeşil epi floresan ışığını açın ve pipetteki kırmızı Alexa boyasını görselleştirin ve pipeti uç kortikal yüzey giriş konumunun üzerine gelene kadar hareket ettirin. Pipet ucunu parlak alan aydınlatmalı mikroskobun oküler kısmından görüntülerken, uç kortikal yüzey üzerinde istenen giriş konumuna ulaşana kadar pipeti indirin. Ardından, hedefi çıkarın ve fazla beyin omurilik sıvısını kraniyotomiden uzaklaştırmak ve bitişik kemiği kurutmak için tüy bırakmayan absorpsiyon mızrakları kullanın.

Daha sonra korteksi stabilize etmek için A CS'de çözülmüş bir damla ılık% 3 arose uygulayın. Aros katılaştıktan sonra, 40 x'lik bir objektif yerleştirin ve hazneyi bir BOS ile yeniden doldurun. Ardından, uç kortekste istenen derinliğe ulaşana kadar pipeti hareket ettirmek için mikro manipülatörün çapraz eksenini kullanın.

DI karışımının ara sıra basınç fırlatma ponponları pipet ucu tıkanma olasılığını azaltacaktır, pipet ikinci katmana ulaştığında, DI karışımının üç küçük pufu ekstra hücresel alanı aydınlatacak ve nöronal cisimleri yüklemek için koyu gölgeler olarak dairesel hücre gövdelerinin yoğun bir montajını ortaya çıkaracaktır. Dix karışımını 30 ila 90 darbe kullanarak hücre dışı boşluğa enjekte edin. Her darbe bir saniye, iki ila 10 PSI.

Enjeksiyon tamamlandıktan sonra birkaç dakika bekleyin, ardından pipeti ve objektifi çıkarın. Floresan kalsiyum göstergesi bir saat içinde nöronlar tarafından tamamen alınacaktır. Son olarak, indirme için kullanılan aroları çıkarın ve kayıt odasını durulayın.

Yüzeye %iki ila %3'lük küçük bir damla damlatın ve kraniyotominin üzerine hızlıca bir kapak camı yerleştirin. Objektif tutucuya yüksek bir NA 20 x objektif yerleştirin ve etiketli kortikal bölgeyi objektifin altında yeniden ortalayın. XY aşamasını kullanarak, kraniyotomiyi yabancı ışık kaynaklarından koruyun ve etiketli nöronların in vivo olarak yüksek çözünürlüklü görüntülerini toplayın.

Alternatif olarak, tek hücreli elektroporasyon, dendritik morfolojiyi veya dendritlerin fonksiyonel görüntülemesini incelemek için kullanılabilir. Bu metodolojide DI, yazılı protokole göre hazırlanır. Daha sonra prosedürün uygun noktasında, pipet ucu bir nöronal hücre gövdesi zarına bitişik olarak konumlandırılır ve bir ila üç darbe uygulamak için bir axo kullanılır.

Nöronun boya ile hemen doldurulması, iki foton mikroskobu ile kolayca görselleştirilir. Bu görüntü, görsel korteks katmanı iki üçte floresan kalsiyum göstergesi OGB 1:00 ile etiketlenmiş hücre gövdelerini gösteren iki fotonlu bir alanı göstermektedir, ölçek çubuğu 100 mikronu temsil eder. Bu görüntü, önceki görüntüde gösterilen aynı bölgeden bireysel nöronal hücre gövdelerinin oryantasyon tercihini göstermektedir.

Tercih edilen uyaran yöneliminin organize bir haritası, görüntülenen bölgede merkezlenmiş fırıldak tekilliği etrafında görülür. Burada içsel sinyal görüntüleme ile elde edilen oryantasyon haritasını görüyoruz. Siyah kare, önceki iki foton görüntüsünde gösterilen bölgeye karşılık gelir.

Bu görüntü, oryantasyon haritası ile kaplanmış tek bir nöronun dendritlerini ve hücre gövdesini göstermektedir. Nöron, iki foton rehberliğinde Alexa kat 5 94 ile elektroporasyona tabi tutuldu. Z yığını in vivo olarak toplandı ve dendritik süreçler yazılım olarak nöro berrak kullanılarak çevrimdışı olarak izlendi.

Oryantasyon haritası, tek hücreli elektroporasyon öncesi içsel sinyal görüntüleme kullanılarak elde edildi. Ölçek çubuğu 100 mikronu temsil eder. Kortikal birinci tabakadan gelen bu 10 mikron Z projeksiyonu apikal dendritleri gösterir.

Kırmızı oklar dendritler boyunca dikenleri gösterirken, kortikal ikinci üç katmandan gelen bu 10 mikron Z çıkıntıları, kırmızı oklarla gösterilen dikenler ve beyaz oklarla gösterilen aksonlar ile bazal dendritleri göstermektedir. Bu yöntem, korteksteki işlevsel haritaları farklı uzamsal ölçeklerde incelemek ve belirli bir ilgi alanındaki nöronları kesin olarak hedeflemek için kullanışlıdır. Harita içinde, oryantasyon seçici haritalarını incelemek için yöntemin uygulanmasını gösterdik, ancak retina, toppy, oküler baskınlık ve yön gibi diğer görsel özellik haritalarına veya somato duyumunu veya işitmeyi kodlayanlar gibi işlevsel olarak organize edilmiş haritalara sahip diğer duyusal modalitelere genişletilebilir.