Name: Belirli Fonksiyonel İçsel Sinyal birleştiren tarafından neokorteks Mikro-etki ve İki foton Görüntüleme nöronlar Hedefli Etiketleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-12T11:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Keşfedin neokorteksteki belirli fonksiyonel mikro-etki alanlarında yüksek çözünürlüklü nöron görüntüleme yöntemini. İçsel sinyal optik görüntüleme ve iki foton mikroskopi kullanarak sinirbilim araştırmalarında hassas hedefleme yapın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Şekil 5A gösterilen dendritler izlemek için Grace Dion;; Bu eser Biz de cerrahi işlemler için yardım Matthew Petrella teşekkür Ulusal Göz Enstitüsü R01EY017925 ve R21EY020985 ve Dana &amp; Whitehall Kuruluşlar PK fonlarından hibe tarafından desteklenen ve Pratik Chhatbar için yazması üzerine yorumlar.

1. Cerrahi Hazırlık <ol><li> Anestezi øndükle ve sürekli kalp atışlarının izlenmesi, tidal CO 2, EEG, ve sıcaklık bitirmek. Tüm prosedürler Güney Carolina Tıp Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmış ve biz daha önce 9,15 yayınlanan bu esas alındı. </li><li> Bistüri ile cilt keserek kafatasının dorsal yüzeyi Açığa. Bir Brudon küret kullanarak kemiği örten bağ dokuları diseke. Pamuk uçlu aplikatörler ve pamuklu gazlı bez kullanılarak kemik temizleyin. Küçük elçisi damarlar yoluyla zaman zaman kanamayı durdurmak için, kafatası kemik balmumu (gerektiği gibi) uygulayın. </li><li> Siyah boya (Malzeme bakınız) ile karıştırılır diş çimento kullanılarak kafatası (kraniotomi yapılacağı ilgi bölge üzerinde) bir titanyum veya paslanmaz çelik kafa plakası takın. Kafa plakasının merkezinde bir dikdörtgen açılması kranyotomi için erişim sağlar ve optik görüntüleme. Baş levha üstüne bir metal haznesi takın. Bu haznesi suya daldırma objektif lens ile görüntüleme için bir sıvı rezervuar olarak hizmet verecek. </li><li> Metal mesajları kullanarak bir xy aşamasına Baş levha sabitleyin. </li><li> Bir diş matkap kullanılarak headplate dikdörtgen şeklindeki açılış içinde kemik geniş bir alanda ince. Inceltilmesi alan iyi planlanmış kraniotomi sınırlarının ötesine genişletmek gerekir. Kraniotomi yerinde, kemik kalınlığı coverglass ve neokortikal yüzeyi arasındaki agaroz kalınlığı dikte edecek, çünkü yüksek çözünürlüklü görüntüler neokorteks elde edilmesi halinde kemirgen olmayan memeli kalın kafatası (aşağıya bakınız) inceltilmiş olmalıdır . </li><li> Kraniotomi için kemik bir 2 x 2 mm kare anahat delin. Kemik kırıkları kaldırmak ve altta yatan kortekse ısı dağılımını en aza indirmek için yeni yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) ile periyodik odası durulayın. Gerektiği gibi zaman zaman kanamayı durdurmak için, kemik mum uygulayın. </li><li> Lift # 3 forseps ile kemik flep. </li><li> Tüm ama bir ince forseps (# 5CO) ve Vannas yay makas kullanılarak dura alt katmanı kaldırın. Kemirgen olmayan memelilerde, dura kalın, opak, fakat ayrı tabakalar halinde çıkarılabilir. Kanama nadir, ancak Gelfoam ile durdurulabilir ve her kan kalıntı yavaşça dura forseps kullanılarak ve ACSF ile durulama kalan tabaka kaldırılması gerekir. Dura son kat şeffaf ve pial damarları aracılığıyla açıkça görünür olmalıdır. Intrinsik sinyal görüntüleme sırasında dura bu son tabaka intakt bırakılması (Tartışma bakın) deney sonraki iki-foton görüntüleme aşaması için floresan kalsiyum göstergelerin toplu yükleme başarı oranını artıracaktır. </li><li> Sıcak% 2&#39;lik agaroz (ACSF çözünmüş) bir damla uygulayın ve hemen kraniotomi üzerinde coverglass yerleştirin. Solunum ve kardiyovasküler pulsasyonu cerrahi bir mikroskop veya bir oküler ile en az olmasını sağlamak için kontrol kranyotomi ikiAydınlık-alan modu foton mikroskop. </li></ol> 2. İçsel Sinyal Optik Görüntüleme <ol><li> Intrinsik sinyal görüntüleme sırasında kurumasını önlemek için agaroz coverglass dış çevresinde ACSF ile ıslatılmış jel köpüğü ekleyin. </li><li> Iki foton mikroskobu (Şekil 1) üstüne standart C-mount noktasına intrinsik sinyal görüntüleme CCD kamera takın. Xy aşamada (Şekil 1A) yakınındaki hava masaya aydınlatıcı ışık kaynağı yerleştirin. Konumu ve kraniotomi ve headplate / odası (Şekil 1B) üzerinde ışık kılavuzları sabitleyin. Içsel sinyalleri için gerekli olan yansıyan kırmızı ışık, CCD kamera (Şekil 1 C-D) göre kranyotomi doğrudan geçecek şekilde ana renk değişikliği ve C montaj noktası aşağıda ayna çekin. 4x hava nesnel (0.13 NA, 17 mm WD), Görüş 2 x 2 mm alanını kullanarak intrinsik sinyal görüntüleme için kullanılabilir. </li><li> L&#39;de bir ısı filtre eklemeısıtma korteks önlemek için kilo yolu. Yeşil ışık (546 nm merkezi λ) ve kortikal yüzey kan damarlarının bir dijital referans görüntü kaydetmek geçer bir filtre kullanın. </li><li> Kortikal yüzey altında 500 um z odağı taşıyın. Içsel sinyalleri ölçmek için korteks aydınlatmak için kırmızı bir filtre (630 nm merkezi λ) kullanın. Kortikal yüzey düzgün yandığını tür ışık kılavuzları yerleştirin. Görsel görüntüleme uyarıcı tarafından üretilen ışık kranyotomi koruyun. Görsel uyaranlara ve kayıt yansıma verileri görüntüler bir dizi sunun. 10 dakika içinde bir oryantasyon haritası oluşturmak için, 8 uyaranlara (Her yön için 4 yönelimleri ve iki yönde) bir dizi 4 tekrarlar karşılık gelen veri toplamak. </li><li> Yanlış bir renk yönelim haritasını oluşturmak için intrinsik sinyal verilerini analiz edin. Nöronların iki foton etiketleme, örneğin, oryantasyon fırıldak tekilliklerin için potansiyel hedef bölge seçin - harita noktaları neredeTüm tercih yönelimleri (Şekil 2A) birleşir. Yönelim harita ve kortikal yüzey damar (Şekil 2B-C) görüntü bindirmesi. Büyük kan damarları ve arteriyoller 15 olan yerlerde kaçınarak, bir hedef seçmek için fonksiyonel alanları ve geniş yüzey damarlarının konumu düzenini kullanın. </li></ol> 3. Floresan Kalsiyum Göstergeler Toplu Yükleme <ol><li> 5 ul DMSO içinde 1 g Pluronic eklenmesi ile% 20 Pluronic / DMSO çözeltisi hazırlayın. Pluronic tamamen çözünmesi için 10 dakika boyunca 60 ° C&#39;de karışım ısıtılır. Karışım, oda sıcaklığına soğumaya bırakın. Floresan kalsiyum gösterge Oregon Green 488 Bapta-1:00 (AM OGB-1), 50 ug şişeye Pluronic / DMSO karışımına 4 ul ekle. Sonra bir kırmızı boya (Alexa Fluor 594, 2 mM stok çözeltisi) ve 1 ul OGB-01:00 1 mM nihai konsantrasyon için pipet çözelti 35 ul (Malzeme bakın). ½ saat için çözelti sonikasyonsoğutulmuş bir su banyosu ve ardından kirleri çıkarmak için filtreyi bir 0.45 mikron ile santrifüjlenir. </li><li> 2.0-2.5 mikron dış uç çapı ile uzun konik pipet çekin. Pipet içine boya karışımı 5 ul yerleştirin. </li><li> Pipet ekleme kolaylaştırmak ve yüksek kalitede iki foton görüntü elde etmek için dura son katmanı kaldırın. </li><li> Pipet kortikal katman 2/3 &#39;hedefine ulaşmak amacıyla oturtulması gerektiği kortikal yüzey üzerinde yerini belirleyin. Bizim önceden kortikal hedef yönlendirmesi harita (Şekil 2) bir fırıldak tekillik olduğunu. Pipet odasının duvar ve nesnel arasındaki geçmek için bir 30 ° açıyla korteksin içine yönlendirilmesi gerekir. Böylece, 200 mikron kortikal yüzeyin altında hedef bölge etiketlemek için, kortikal yüzey üzerinde pipet giriş pozisyonuna hedef pozisyon (Şekil 3 AB) yanal yaklaşık 350 mikron olacaktır. </li><li> (Xy sahne üzerinde hareket ettirin hayvan ve pipette mikromanipülatör merkezi objektif (Şekil 3C) altında kortikal yüzey giriş pozisyonuna) yerleştirilir. Pipet kolayca kraniotomi duvar boyunca nesnel veya kemik dokunmadan korteks girecek olmasını sağlamak için en az 3 mm (Malzeme bakınız) bir çalışma mesafesi (WD) ile 20x veya 40x objektif kullanın. Giriş pozisyonuna hedefi altında ortalanmış sonra, 2 mm (Şekil 3B) tarafından objektif Z konumunu yükseltmek. Yeşil epi-floresan ışık pipet içinde kırmızı Alexa boya görselleştirmek açıkken, (ucu merkezli kadar doğrudan kortikal yüzey giriş pozisyonuna yukarıda hedefi altında (ve odaklanmış) pipet hareket mikromanipülatör ve çapraz eksen kullanın Şekil 3E). </li><li> Sürekli ocu aracılığıyla pipet izlerken pipet, kortikal yüzey (Şekil 3F) ulaşana kadar pipet dikey (z ekseni boyunca) indirinmikroskop lars. Aydınlık alan aydınlatma kullanarak, kortikal yüzey kan damarları ve kalan meningeal membran (pia ve araknoid) pipet kortikal yüzey yaklaşırken kolayca görülebilir. Pipet istenilen giriş pozisyonuna ulaşamazsa, pipet yükseltmek ve kortikal yüzeyde vasküler görülecek dayalı hedefleme recalibrate. </li><li> Nesnel çıkarın, kraniotomi gelen aşırı beyin omurilik sıvısı fitil ve tiftiksiz emilim spears kullanarak komşu kemikte kurulayın. Kraniotomi (Şekil 3G) aracılığıyla görünür korteks dengelemek için ılık% 3 agaroz (ACSF çözünmüş) bir damla uygulayın. Kemirgen olmayan,% 3 agaroz nöronlar tarafından floresan boyalar başarılı bir şekilde alımı için pulsasyonu kırmak için gereklidir. % 2 agaroz ve coverglass kombinasyonu gerekli stabilite sağladığından intrinsik sinyal optik görüntüleme için sadece% 2&#39;lik agaroz gereklidir. Burada, herhangi bir coverglass% 3 agaroz böylece boya yükleme adımı için, malzemenin,gereklidir. Agaroz katılaşmış sonra ACSF ile odası, 40x objektif takın (0.8 NA, 3,3 mm WD) ve yeniden doldurun. </li><li> Parlak alanında iki foton görüntüleme geçin ve pipet bulun. Ucu korteks (Şekil 3H), istenen derinliğe ulaşıncaya kadar mikromanipülatör bir çapraz eksen kullanarak, pipet hareket eder. Boya karışımı (bir kaç psi her darbenin 0.1 sn) Arasıra basınçlı ejeksiyon ponponları tıkanmasını pipet önlemeye yardımcı olacaktır. KGB-1 yalnızca hücre girdikten sonra görünür hale AM ​​Çünkü, kırmızı Alexa boya korteks içindeki pipet ucu görselleştirme için kritik öneme sahiptir. </li><li> Pipet derinliği onaylamak için kortikal yüzey üzerinde yeniden odaklanmak, boyanın tam doz ile objektif kortikal katman 2/3 nöronların yüklemek ve ucu düzeni esas hedef konumda olduğundan emin olmak için çalışmadan önce yüzey kan damarları. Pipet katman 2/3 &#39;de ise, boya karışımının küçük Puffs yanmalıdırekstrasellüler boşluğa ve koyu gölgeler gibi dairesel hücre gövdeleri yoğun bir derleme ortaya koymaktadır. </li><li> Korteks 300-600 mikron çaplı bir küre nöronal hücre gövdeleri yüklenmesi için, 30-90 bakliyat, her nabız 1.0 sn, 2-10 psi kullanarak ekstrasellüler boşluğa boya karışımı enjekte. Basınç sinyalleri doku taşınacak şekilde güçlü olmamalıdır. Enjeksiyon işlemi tamamlandıktan sonra, bir kaç dakika bekleyin, daha sonra, pipet ve objektif çıkarın. KGB-1 nöronlar tarafından tamamen alınan-up yapılacak AM izin 1 saat bekleyin. </li><li> Boya yükleme için kullanılan agaroz çıkarın ve kayıt oda durulama. Yüzey üzerinde% 2-3 agaroz küçük bir damla koyun ve hızlı bir kranyotomi üzerinde bir coverglass yerleştirin. Floresan boyalar ışığa duyarlı olduğundan, parlak alan veya epi-floresan ışık korteks fazla maruz bırakmaktan kaçının. Xy sahne kullanarak hedefi altında objektif sahibi ve yeniden merkezi etiketli kortikal bölgeye yüksek NA (1.0) 20x objektif yerleştirin. Eski En kraniotomi koruyuntraneous ışık kaynakları, örneğin, görsel uyaran ekran karartma malzemenin çoklu katmanlar kullanarak. </li></ol> 4. Floresan Boyalar Tek hücreli Elektroporasyon <ol><li> Dendritik morfoloji eğitim için 100 mcM Alexa Fluor 594 (2 mM Alexa Fluor 594 stoklar ACSF olarak 01:20 seyreltme) bir solüsyon hazırlanır. Dendritlerin işlevsel görüntüleme için bir OGB tuz 16,17 kullanılabilir. </li><li> 1 mikron bir ipucu boyutu ile uzun konik pipet çekin ve pipet içine boya 5 ul yükleyin. Fonksiyonel bir etki hedefleyen diğer tüm adımları toplu yükleme yöntemi (Şekil 1-3) ile aynıdır. Bir nöron hücre gövdesi zarı bitişik pipet yerleştirmek için, empedans artışı izlemek ve ekstrasellüler alanı aydınlatmak ve iki-foton görüntüleme sırasında gölgeler gibi hücre gövdeleri görmek için boya basınç ponponları uygulayın. </li><li> Pipet, bir nöronal hücre gövdesi zarı bitişik olduğunda, uygulamak için Axoporator 800A kullanın1-3 bakliyat (-8 -10 V, 10 msn nabız). Boya ile nöronun hemen dolgu iki foton mikroskopi ile kolayca görüntülenmiştir. Pipet çıkarın ve in vivo olarak dendrit ve akson yüksek çözünürlüklü görüntüler toplamak. </li></ol>

<ol><li>Blasdel, G. G., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-sensitive+dyes+reveal+a+modular+organization+in+monkey+striate+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Voltage-sensitive dyes reveal a modular organization in monkey striate cortex.</a> Nature. 321, 579-585 (1986).</li>
<li>Grinvald, A., Lieke, E., Frostig, R. D., Gilbert, C. D., Wiesel, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+architecture+of+cortex+revealed+by+optical+imaging+of+intrinsic+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional architecture of cortex revealed by optical imaging of intrinsic signals.</a> Nature. 324, 361-364 (1986).</li>
<li>Bonhoeffer, T., Grinvald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iso-orientation+domains+in+cat+visual+cortex+are+arranged+in+pinwheel-like+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Iso-orientation domains in cat visual cortex are arranged in pinwheel-like patterns.</a> Nature. 353, 429-431 (1991).</li>
<li>Ohki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+ordered+arrangement+of+single+neurons+in+orientation+pinwheels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Highly ordered arrangement of single neurons in orientation pinwheels.</a> Nature. 442, 925-928 (2006).</li>
<li>Shmuel, A., Grinvald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+organization+for+direction+of+motion+and+its+relationship+to+orientation+maps+in+cat+area+18%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional organization for direction of motion and its relationship to orientation maps in cat area 18.</a> J. Neurosci. 16, 6945-6964 (1996).</li>
<li>Ohki, K., Chung, S., Ch'ng, Y. H., Kara, P., Reid, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+imaging+with+cellular+resolution+reveals+precise+micro-architecture+in+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional imaging with cellular resolution reveals precise micro-architecture in visual cortex.</a> Nature. 433, 597-603 (2005).</li>
<li>Li, Y., Van Hooser, S. D., Mazurek, M., White, L. E., Fitzpatrick, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience+with+moving+visual+stimuli+drives+the+early+development+of+cortical+direction+selectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Experience with moving visual stimuli drives the early development of cortical direction selectivity.</a> Nature. 456, 952-956 (2008).</li>
<li>Bonhoeffer, T., Kim, D. S., Malonek, D., Shoham, D., Grinvald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+the+layout+of+functional+domains+in+area+17+and+across+the+area+17%2F18+border+in+cat+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of the layout of functional domains in area 17 and across the area 17/18 border in cat visual cortex.</a> Eur. J. Neurosci. 7, 1973-1988 (1995).</li>
<li>Kara, P., Boyd, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+micro-architecture+for+binocular+disparity+and+ocular+dominance+in+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A micro-architecture for binocular disparity and ocular dominance in visual cortex.</a> Nature. 458, 627-631 (2009).</li>
<li>da Costa, N. M., Martin, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whose+Cortical+Column+Would+that+Be%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Whose Cortical Column Would that Be.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 4, 16(2010).</li>
<li>Kaschube, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universality+in+the+evolution+of+orientation+columns+in+the+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Universality in the evolution of orientation columns in the visual cortex.</a> Science. 330, 1113-1116 (2010).</li>
<li>Villeneuve, M. Y., Vanni, M. P., Casanova, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+organization+in+area+21a+of+the+cat+revealed+by+optical+imaging%3A+comparison+with+the+primary+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modular organization in area 21a of the cat revealed by optical imaging: comparison with the primary visual cortex.</a> Neuroscience. 164, 1320-1333 (2009).</li>
<li>Chen, X., Leischner, U., Rochefort, N. L., Nelken, I., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+mapping+of+single+spines+in+cortical+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional mapping of single spines in cortical neurons in vivo.</a> Nature. 475, 501-505 (2011).</li>
<li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 7319-7324 (2003).</li>
<li>Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O'Herron, P., Kara, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+artery-specific+fluorescent+dye+for+studying+neurovascular+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling.</a> Nat. Methods. 9, 273-276 (2012).</li>
<li>Nevian, T., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+indicator+loading+of+neurons+using+single-cell+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv%22%5BJournal%5D)">Calcium indicator loading of neurons using single-cell electroporation.</a> Pflugers Archiv. 454, 675-688 (2007).</li>
<li>Kitamura, K., Judkewitz, B., Kano, M., Denk, W., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+patch-clamp+recordings+and+single-cell+electroporation+of+unlabeled+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Targeted patch-clamp recordings and single-cell electroporation of unlabeled neurons in vivo.</a> Nat. Methods. 5, 61-67 (2008).</li>
<li>Pohl-Guimaraes, F., Krahe, T. E., Medina, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+valproic+acid+exposure+alters+functional+organization+in+the+primary+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Early valproic acid exposure alters functional organization in the primary visual cortex.</a> Exp. Neurol. 228, 138-148 (2011).</li>
<li>Bock, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+anatomy+and+in+vivo+physiology+of+visual+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Network anatomy and in vivo physiology of visual cortical neurons.</a> Nature. 471, 177-182 (2011).</li>
<li>Rochefort, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+direction+selectivity+in+mouse+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Development of direction selectivity in mouse cortical neurons.</a> Neuron. 71, 425-432 (2011).</li>
<li>Mrsic-Flogel, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostatic+regulation+of+eye-specific+responses+in+visual+cortex+during+ocular+dominance+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Homeostatic regulation of eye-specific responses in visual cortex during ocular dominance plasticity.</a> Neuron. 54, 961-972 (2007).</li>
<li>Bonhoeffer, T., Grinvald, A. Optical Imaging Based on Intrinsic Signals. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBonhoeffer%2C+T+%22Brain+mapping%3A+The+Methods%22">Brain mapping: The Methods</a>. Toga, A. W., Mazziotta, J. C. , Academic Press. San Diego. 55-97 (1996).</li>
<li>Kerr, J. N., Greenberg, D., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+input+and+output+of+neocortical+networks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Imaging input and output of neocortical networks in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 14063-14068 (2005).</li>
<li>Hofer, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+connectivity+and+response+dynamics+of+excitatory+and+inhibitory+neurons+in+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential connectivity and response dynamics of excitatory and inhibitory neurons in visual cortex.</a> Nat. Neurosci. 14, 1045-1052 (2011).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Biz neokorteks önceden belirlenmiş fonksiyonel mikro alanlarda nöronal hücre gövdeleri (ya da dendrit ve akson) ve etiketleme hedeflemek için bir yöntem mevcut. Iki foton mikroskopi ile intrinsik sinyal optik görüntüleme birleştirme sinapslar ve hücrelerin herhangi bir fonksiyonel haritanın mikro-etki katkıda belirleme imkanı sunuyor, ister işlevsel haritası nöronun konumu ve nöronal devre ile nöronal seçicilik korele bileşenleri görsel deneyim 7 veya klinik tedavi edici ilaçlar 18 uygulaması ile b...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif / Malzeme Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 1. Yaşam destek / deney hazırlık </td></tr><tr><td> İzofluran </td><td> Webster Vet </td><td> NDC 57319-474-05 </td><td></td></tr><tr><td> İzofluran buharlaştırıcı </td><td> Midmark </td><td> VIP 3000 </td><td></td></tr><tr><td> Görüşleri düzenlenmiş ısıtma battaniyesi </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 50-7079F </td><td></td></tr><tr><td> EKG monitörü </td><td> Digicare Biyomedikal </td><td> LifeWindow Lite </td><td></td></tr><tr><td> EEG amplifikatör </td><td> AM Sistemleri </td><td> 1800 </td><td></td></tr><tr><td> EEG ekran monitör </td&gt; <td> Hewlett Packard </td><td> 78304A </td><td></td></tr><tr><td> Tidal CO 2 monitör End </td><td> Respironics </td><td> Novametrix Capnoguard 1265 </td><td> Havalandırma optimize </td></tr><tr><td> Kemik sondaj için Karbür matkap çapaklar </td><td> Henry Schein </td><td> ince (0.5 mm uç) ve iri (1.25 mm uç) </td><td></td></tr><tr><td> Headplate / odası için çimento </td><td> Dentsply </td><td> 675.571, 675.572 </td><td></td></tr><tr><td> Siyah Pudra Tempera Boya </td><td> Sargent Sanat A.Ş. </td><td> 22-7185 </td><td> Işık koruyucu geliştirmek için çimento ve yansımaları azaltmak için ekle </td></tr><tr><td> Agaroz - Tip III-A </td><td> Sigma </td><td> A9793 </td><td> Intrinsik sinyal ve iki-foton görüntüleme sırasında titreşimler en aza indirgemek için </td></tr><tr><td> Coverglass: 5 veya 8 mm çapında, 0.17 mm kalınlık </td><td> Yılında Dünya Precisionstruments </td><td> 502.040, 502.041 </td><td> Görüntüleme sırasında titreşimler en aza indirmek için, coverglass gerektiği gibi kesilebilir </td></tr><tr><td> Brudon küretler </td><td> George Tiemann </td><td> 105-715-0, 105-715-3 </td><td> Kafatası yüzeyi temizleme </td></tr><tr><td> Kemik balmumu </td><td> Ethicon </td><td> W31G </td><td> Hızla kanamayı durdurmak </td></tr><tr><td> Pamuk Aplikatör Yatırılan </td><td> Elektron Mikroskopi Bilimleri </td><td> 72308-05 </td><td> Temiz ve kuru kemik yüzeyi </td></tr><tr><td> Dumont # 5CO Forseps </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 11295-20 </td><td> Dura ya pia bulunan bireysel katmanların tut </td></tr><tr><td> Vannas Bahar Makas </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 15000-03 </td><td> Kesim dura </td></tr><tr><td> Gelfoam </td><td> Pfizer </td><td> 09-0396-05 </td><td> Dura üzerine kanamayı durdurmak için </td></tr><tr><td> Emilim mızraklar</td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 18105-01 </td><td> BOS Ultra-hızlı ve lifsiz esneklik </td></tr><tr><td> Blackout malzemesi </td><td> Thorlabs </td><td> BK5 </td><td> Kalkanı kraniotomi </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 2. Hazırlık / enjeksiyon Boya </td></tr><tr><td> DMSO (DMSO) </td><td> Sigma </td><td> D2650 </td><td></td></tr><tr><td> Pluronic </td><td> Sigma </td><td> P2443 </td><td></td></tr><tr><td> Oregon Yeşil 488 Bapta-01:00 </td><td> Invitrogen </td><td> O6807 </td><td> Kalsiyum göstergesi </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 594 </td><td> Invitrogen </td><td> A10438 </td><td></td></tr><tr><td> Santrifüj filtre (0.45 mikron gözenek boyutu) </td><td> Millipore </td><td> UFC30HV00 </td><td> Enjeksiyondan önce kirleri çıkarmak için </td></tr><tr><td> Cam pipet çektirmesi </td><td> Sutter Aletleri </td><td> P97 </td><td></td></tr><tr><td> Borosilikat cam (1.5 mm dış çapı) kılcal filamented </td><td> Dünya Hassas Aletler </td><td> 1B150F-4 </td><td> Boya ejeksiyon pipet </td></tr><tr><td> Microloader </td><td> Eppendorf </td><td> 5242 956 003 </td><td> Pipeti içine boya yükleme için </td></tr><tr><td> Mikromanipülatör </td><td> Sutter Aletleri </td><td> MP-285 </td><td> Pipet konumlandırmak için </td></tr><tr><td> Basınç darbe kontrolörü </td><td> Parker Hannifin </td><td> PicoSpritzer III </td><td> Boya basınçlı enjeksiyon için </td></tr><tr><td> Tek hücre Elektroporatör </td><td> Molecular Devices </td><td> Axoporator 800A </td><td> Boya elektroporasyon için </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 3. İçsel imaging </td></tr><tr><td> 4x Amaç (0.13 NA, 17 mm WD) </td><td> Olimpos </td><td> UPLFLN4X </td><td></td></tr><tr><td> İçsel donanım / yazılım </td><td> Optik Imaging Inc </td><td> Imager 3001 / VDAQ </td><td> VDAQ yazılım epizodik görüntüleme için kullanılır </td></tr><tr><td> CCD Kamera </td><td> Adimec </td><td> Adimec-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Işık kaynağı güç kaynağı </td><td> KEPCO </td><td> 15-15M ATE </td><td></td></tr><tr><td> Işık kaynağı </td><td> Optik Imaging Inc </td><td> HAL 100 </td><td> Kortikal yüzeyde Işık yoğunluğu 3-5 mW </td></tr><tr><td> Yeşil filtre (vasküler görüntü için) </td><td> Optik Imaging Inc </td><td> λ = 546 nm (bant geçiren 30 nm) </td><td> Yüzey vaskülatürün referans görüntü için </td></tr><tr><td> Kırmızı filtre (intrinsik sinyal için) </td><td> Optik Hayaling A.Ş. </td><td> λ = 630 nm (bant geçiren 30 nm) </td><td> Içsel sinyalleri toplamak için </td></tr><tr><td> Isı filtresi </td><td> Optik Imaging Inc </td><td> KG-1 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 4. İki foton kulesi / görüntüleme </td></tr><tr><td> İki foton mikroskop ve yazılım </td><td> Prairie Teknolojileri </td><td></td><td> Işık yolu, filtreler ve lazer güç için Shen ve ark. 2012 bakın </td></tr><tr><td> Ti: Safir Lazer </td><td> Spectra-Fizik </td><td> Mai Tai XF </td><td></td></tr><tr><td> 20x (0.5 NA; 3,5 mm WD) </td><td> Olimpos </td><td> UMPLFLN20X </td><td> 0.5 NA objektif (değil iki foton görüntüleme için) kraniotomi üzerinde pipet hizalamak için yalnızca kullanılır </td></tr><tr><td> 20x (1.0 NA; 2,0 mm WD) </td><td> Olimpos </td><td> XLUMPLFLN20X </td><td></td></tr><tr><td> 40x (0.8 NA; 3,3 mm WD) </td><td> Olimpos </td><td> LUMPLFLN40X/IR </td><td></td></tr><tr><td> Hava tablosu </td><td> Newport </td><td> ST-200 </td><td> Dış titreşimlerden hazırlık tecridi </td></tr><tr><td> xy sahne </td><td> Mike&#39;ın Machine Co (Attleboro, MA) </td><td></td><td> Xy sahnede konumlandırılmış Deneysel konu ve Sutter mikromanipülatör </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Tarifler </td></tr><tr><td> Yapay beyin omurilik sıvısına </td><td> NaCl (135 mM), KCI (5.4 mM), MgCl2 (1.0 mM), CaCl2 (1.8 mM), HEPES (5 mM), pH 7.4 </td></tr><tr><td> Pipet Çözümü 14 </td><td> NaCl (150 mM), KCI (2.5 mM), HEPES (10 mM), pH 7.4 </td></tr></tbody>
			</table>
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

belirli fonksiyonel İçsel sinyal birleştiren tarafından neokorteks mikro-etki ve İki foton görüntüleme nöronlar hedefli etiketleme

Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging

Kemirgen olmayan memeli primer görsel korteks, nöronların böyle bir yönelim 1-4, yön 5-7, baskın göz 8,9 ve binoküler eşitsizlik 9 olarak uyarıcı özellikler için kendi tercihinize göre kümelenmiş. Oryantasyon seçiciliği en çok çalışılan bir özelliktir ve tercihli yönelim için bir yarı-periyodik düzeni ile sürekli bir harita tüm primer görsel korteks 10,11 genelinde mevcuttur. Bu işlevsel haritaları uyarıcı seçici yanıtları yol, sinaptik hücresel ve ağ katkıları entegre milimetre mekansal ölçekler için alt-mikron yayılan görüntüleme tekniklerinin hibridizasyon gerektirir. Konvansiyonel intrinsik sinyal optik görüntüleme ile, görsel korteksin tüm yüzeyi boyunca işlevsel haritaların genel düzenini 12 tespit edilebilir. Kalsiyuma duyarlı boyalar kullanılarak in vivo olarak iki-fotonlu mikroskobu gelişme synapt belirlemek için bir olanakic giriş bireysel nöronal hücre gövdeleri 6,14 yüzlerce aynı anda bireysel dendritik dikenler az 13 veya kayıt aktivite gelen. Sonuç olarak, iki foton mikroskopi mikronaltı uzaysal çözünürlüğü ile intrinsik sinyal görüntüleme birleştirerek dendritik segmentleri ve hücrelerin neokorteks herhangi bir fonksiyonel haritanın mikro-etki katkıda bulunduğunu tam olarak belirleme olanağı sunuyor. Burada hızlı bir kortikal yönelim haritasını elde etmek ve bir kemirgen olmayan memeli floresan boyalar ile nöronlar etiketlenmesi için bu işlevsel harita belirli bir mikro-etki hedefleme için yüksek verim yöntemi göstermektedir. Iki foton görüntüleme için kullanılan aynı mikroskop ile önce intrinsik sinyal optik görüntüleme kullanarak bir yönelim haritasını oluşturur. Sonra da etikete boya ile yüklü bir mikropipet kullanarak ilgi bir mikro-etki hedef göstermek nöronal hücre gövdeleri veya etiket dendrit dikenleri ve aksonlar görülebilir böyle bir nöronun bir nüfusavivo. Önceki yöntemler üzerinde Bizim ayrıntılandırmaları neokortikal fonksiyonel mimarisi çerçevesinde alt-hücresel çözünürlük ile nöronal yapı-işlev ilişkilerinin incelenmesi kolaylaştıracaktır.

Bizim boya etiketleme yöntemleri hassasiyeti göstermek için, biz kemirgen olmayan neokorteks bilinen herhangi bir fonksiyonel haritanın küçük mikro-etki hedeflenmiş. Seyrek tekilliklerin olan birincil görsel korteks yönelim harita boyunca noktaladı. Bunların hepsi tercih yönelimleri gibi yakınsama noktalarda meydana geldiğini tercihli yönelim, &quot;fırıldak&quot; (Şekil 2A-B) gibi tekillik göz çevresindeki bölgelerin sahte renk haritalarında. Kraniotomi başına bir fırıldak özellikle 15 büyük...

Bir yöntem olup, önceden belirlenmiş neokorteks fonksiyonel mikro etki floresan boyalar ile nöronlar etiketleme için açıklanmıştır. İlk olarak, iç sinyal optik görüntüleme fonksiyonel bir harita elde etmek için kullanılır. Sonra iki foton mikroskopi haritanın bir mikro-etki alanı içindeki etiket ve resim nöronlar için kullanılır.

Belirli Fonksiyonel İçsel Sinyal birleştiren tarafından neokorteks Mikro-etki ve İki foton Görüntüleme nöronlar Hedefli Etiketleme

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, ...

Bu prosedürün genel amacı, nöronların yapısını ve işlevini yüksek çözünürlükte incelemek için işlevsel bir haritadaki mikro alanları hassas bir şekilde hedeflemektir. Bu, ilgilenilen uyaran özelliğinin bir haritasını elde etmek için önce geniş bir korteks alanı üzerinde içsel sinyal görüntüleme gerçekleştirilerek gerçekleştirilir. İkinci adım, yüksek çözünürlüklü foton görüntüleme için hedeflenecek olan haritadaki kesin konumu belirlemektir.Daha sonra, floresan boya ile yüklenen pipeti dikkatlice yerleştirdikten sonra, nöronlar floresan işaretleyici ile etiketlenir. Son olarak, nöronal tepkilerin veya yapıların foton görüntülerine yüksek çözünürlüklü toplanır. Sonuç olarak, içsel bir sinyal özellik haritası, daha sonra tek nöron çözünürlüğünde çalışma için hedeflenebilecek bir oryantasyon fırıldak tekilliği gibi bir ilgi alanını bulmak için kullanılabilir.Bu protokolün ana avantajı, sistemde sadece birkaç hızlı ayarlama ile aynı mikroskop kurulumunu kullanarak korteksi farklı uzamsal ölçeklerde görüntüleyebilmesidir. Bu, yüksek çözünürlüklü görüntüleme için floresan problarla etiketlenecek bir nöron bölgesini seçmek için bir kılavuz olarak rota çözünürlüklü içsel sinyal haritasını

targeted-labeling-neurons-specific-functional-micro-domain-neocortex

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Neokorteks mikrodevreler ağ dinamiklerini anlamak için, aynı anda çok sayıda nöron aktivitesini kaydetmek için esastır. In vivo iki foton kalsiyum görüntüleme, bir tek hücre çözünürlük ile yoğun bir nöronal nüfusun faaliyet kaydetmenize olanak sağlayan tek yöntem.

Katman In Vivo 2-Foton Kalsiyum Görüntüleme Fare 2 / 3

Bu kağıt sınırlı inhibitör nöron toplulukları GFP ifade transgenik farelerin tüm hücre kayıtları ile photostimulation lazer tarama birleştiren bir yaklaşım getirmektedir. Tekniği spesifik inhibitör kortikal nöronların yerel sinaptik devrelerin kapsamlı haritalama ve kantitatif analiz için izin verir.

Lazer Tarama Photostimulation tarafından inhibitör nöronal devreler Haritalama

Floresan boya retrograd taşıma anatomik projeksiyona dayalı nöronların bir alt-nüfus etiketler. Etiketli akson görsel olarak...

Retrograd Floresan Etiketleme Belirlenen Nöronlar gelen Hedefli Hücre dışı Tek ünitesi Kayıt izin verir<em&gt; In vivo</em

Nöronlarda deneyim-bağımlı moleküler değişiklikler davranışsal sorunlara yanıt olarak adapte beyin yeteneği için gereklidir.

Kortikal Nöronlar In Vivo İki foton Of Görüntüleme Deneyimi bağımlı Moleküler Değişiklikler

Canlı hayvanda hızlandırılmış görüntüleme, sağlam beyindeki yapısal yeniden yapılanma hakkında değerli bilgiler sağlar. Burada, canlı fare korteksindeki floresan etiketli sinaptik yapıların iki foton mikroskobu ile transkraniyal görüntülenmesine izin veren inceltilmiş bir kafatası preparatını tanıtıyoruz.

İki-Foton<em&gt; In vivo</em&gt; Bir inceltilmiş-kafatası Hazırlık kullanarak Fare Cortex dendritik dikenler Görüntüleme

Bu tam hücre patch-kelepçesi ve fare beyin, akut doku dilimleri dendrit ve hipokampal nöronlar dikenler Hücre içi sodyum transient çoklu foton görüntüleme ile, nöro-aktif bileşiklerin fokal UV uyarımlı foto-aktivasyon kombinasyonunu tarif eder.

Çoklu foton İntrasellüler Sodyum Görüntüleme CA1 piramidal Nöronlar Glutamatın UV-aracılı Odak uncaging ile birlikte

Bu video, Thy1-GFP transgenik hattında in vivo iki foton mikroskobu kullanılarak fare retrosplenial korteksindeki nöronların kronik olarak görüntülenmesine izin veren kraniyotomi prosedürünü göstermektedir. Bu yaklaşım, mCherry eksprese eden adeno ilişkili virüsün dorsal hipokampusa enjeksiyonu ile birleştirilir. Bu teknikler, RSC'de deneyime bağlı yapısal plastisitenin uzun süreli izlenmesine izin verir.

Eşzamanlı İki foton<em&gt; İn Vivo</em&gt; Fare Retrosplenial kortekste sinaptik Girişlerin Görüntüleme ve postsinaptik Hedefler

Biz bütün hücreli yama-kelepçe kayıtları ve Ca2 + geçişler akut beyin dilimleri içinde nöronal dendrites kaydetmek için iki fotonlu Imaging birleştiren bir yöntem mevcut.

Nöronal Dendrites beyin dilimleri içinde iki fotonlu kalsiyum görüntüleme

Burada biz bir doku takas, floresan etiketleme ve büyük ölçekli görüntüleme sağlayan, böylece, görselleştirme yeni korteksimiz hücre tiplerinin üç boyutlu kuruluşun fare beyin dokusunun açıklayınız.

Hücresel Örgütü fare yeni korteksimiz yılında büyük ölçekli üç boyutlu görüntüleme

Bir kafa plakası ve hem tek hem de iki fotonlu mikroskoplarla uyumlu bir optik tasarımla entegre edildiğinde, mikroprizma mercek, kafa sabit durumlarda iyi kontrol edilen deneyler veya serbestçe hareket eden hayvanlarda doğal davranışsal görevler dahil olmak üzere çeşitli koşullar altında dikey bir sütundaki nöral tepkileri ölçmede önemli bir avantaj sunar.

Serbest Hareket Eden ve Kafası Sabit Hayvanlarda Mikroprizmalar Kullanılarak Tanımlanmış Nöral Popülasyonların Uzun Süreli Görüntülenmesi

Bu protokol, birden fazla hafıza ile ilgili beyin bölgesinde nöronlardan ve astrositlerden gelen kalsiyum sinyallerinin eşzamanlı kaydı için kapsamlı bir yöntem tanımı sunar ve öğrenme ve hafıza davranışı paradigmasında uygulanmasını gösterir.

Öğrenme ve Hafıza Davranışları sırasında Astrosit-Nöron Aktivitesini Birden Fazla Beyin Bölgesinde KaydEtmek İçin İki Renkli Lif Fotometri Yöntemi

Keşfedin neokorteksteki belirli fonksiyonel mikro-etki alanlarında yüksek çözünürlüklü nöron görüntüleme yöntemini. İçsel sinyal optik görüntüleme ve iki foton mikroskopi kullanarak sinirbilim araştırmalarında hassas hedefleme yapın.

Belirli Fonksiyonel İçsel Sinyal birleştiren tarafından neokorteks Mikro-etki ve İki foton Görüntüleme nöronlar Hedefli Etiketleme (Video) | JoVE Journal

Belirli Fonksiyonel İçsel Sinyal birleştiren tarafından neokorteks Mikro-etki ve İki foton Görüntüleme nöronlar Hedefli Etiketleme

Daha fazla video keşfet