Name: Bireysel Renal Hücreli Kanserlerde içinde Protein Ekspresyonu Varyasyon kaynakları için Ters Faz Protein Diziler (RPPA) ve Kullanımı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 22 s
Description: Keşfedin, böbrek hücreli kanserinde proteomik ekspresyon varyasyonlarını RPPA ile analiz etmeyi. Bu yöntem, tedavi yanıtı için biyobelirteçleri belirlemeye ve tümör heterojenliğini anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ETM37 ve Birleşik Krallık Kanser Araştırma Deneysel Kanser Tıp Merkezi tarafından desteklenen: Baş Bilim Ofisi, hibe sayısına göre finanse edilmektedir Yukarıdaki yazarların FCO, DF, JN, DJH ve GDS çalışması bahsettiniz. AL çalışmaları Edinburgh Robertson Güven, bakım ve kanser ve Tıbbi Araştırma Konseyi tedavi için Melville Trust Cerrahlar Kraliyet Koleji tarafından finanse edilmektedir. IO Marie Curie Eylemleri ve İngiltere&#39;de Tıbbi Araştırma Konseyi tarafından cofunded Edinburgh İskoç Hükümeti Bursu Royal Society tarafından desteklenmektedir. Yazarlar bu çalışmada tartışılan konulardan bazıları üzerinde yararlı tartışmalar için SCOTRRCC ortak başvuru ve işbirlikçileri teşekkür etmek istiyorum.

1. Morfolojik ve Moleküler Tümör heterojenliği tanımlanması <ol><li> Tümörler -80 ° C derin dondurucu kaldırıldı ve kuru buz üzerinde tutulmalıdır. </li><li> Yaklaşık 1 cm 3 bölüme tümörleri bölün. Her bir tümör, birbirlerine göre göreceli bölüm ve bir benzersiz ismi ile etiket ilk konumuna Harita. Mağaza örnekleri -80 bireysel kriyotüplerin ° C Kullanıma hazır oluncaya dek. </li><li> Coat örnekleri OCT ve -22 ° C&#39;de kriyostat kesilmiş </li><li> Örnekleri Hematoksilen-Eozin counterstaining yöntemi kullanılarak boyandı. </li><li> Dondurulmuş kesitlerin Mikroskopi analizi onlar ccRCC doğa, canlı tümör ve dereceleme (frozen Fuhrman sınıflarda 1 ila 4 ayırt etmek zor düşük dereceli, yüksek dereceli veya karışık yüksek / düşük dereceli,) için vardır sağlamak. Şekil 1 a ve b (H &amp; E boyama yüksek, düşük ve karma sınıf). </li><li> Protein ekstraksiyonu için her tümör içindeki her morfolojik farklı bölgeden 4 örnekleri kadar seçin. </li></ol> 2. Tümör Örneklerinde Protein Ekstraksiyonu <ol><li> OCT tümör örneği kesin. </li><li> Lizis tamponu, 990 ul ile 2 ml&#39;lik tüp içine doku il 50-75 mg [50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 5 mM EGTA (pH 8.5), 150 mM NaCl] aprotinin (Sigma A6279) (10 mg ile desteklenir / ml), fosfataz inhibitörü kokteyl 2 (Sigma P5716), fosfataz inhibitörü kokteyl 3 (Sigma P0044) ve bir proteaz inhibitörü kokteyl (Roche, 11836153001). </li><li> Her bir tüp için tek bir 5 mm çelik top ekleyin ve iki kez her 5 dk süre sonra, bir TissueLyser kullanılarak homojenizasyon seviyesini kontrol 5 dk için 50Hz&#39;de homojenize. </li><li> Arkasında çelik topu bırakarak pipet kullanarak yeni 2 ml tüp homojenize örnek aktarın. </li><li> 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca 13,000 x g&#39;de santrifüj önce her bir numune için Triton X-100, 10 ul ekle </li><li> Taze mikrosantrifüj tüpleri için süpernatan aktarın. </li><li> BCA assay (Şekil 2) kullanarak protein konsantrasyonu tayin edilir. </li><li>1 mg / ml protein konsantrasyonu normalize edilir. </li></ol> 3. Antikor Doğrulama <ol><li> Western blot için protein örneklerinin (uygun hücre hatları veya doku çıkarılır) hazırlayın ve% 10&#39;luk SDS-PAGE jel üzerinde çalıştırın. </li><li> 4 gecede nitroselüloz membran üzerinde örnekleri aktarın ° C. </li><li> Oda sıcaklığında 1 saat boyunca Li-Cor Odyssey engelleme tamponu (PBS içerisinde seyreltilmiş, 50:50) içinde membran engelleme. </li><li> Üreticileri de Li-Cor Odyssey Engelleme Tampon birincil antikorlar (PBS 50:50 seyreltilmiş) seyreltin seyreltme 1,000 tipik 1 önerilir. </li><li> 4 ° C&#39;de gece boyunca birincil antikor olarak zar inkübe </li><li> % 0.1 PBS-Tween20 (; 1 ml Tween20 / 1L PBS PBS-T) Makyaj. </li><li> 5 dakika (x3) ile, oda sıcaklığında PBS-T içinde zar yıkayın. </li><li> Odyssey Engelleme Tamponu (PBS 50:50 seyreltilmiş) 0.01% 1:10,000 dilusyondaki SDS (1.5 μl/15 ml) sekonder antikor floresan etiketli seyreltin. </li><li> Ikincil membran inkübehafif sallama ile 45 dakika için oda sıcaklığında antikorları - bu şekilde sonunda taranmıştır zamana kadar, ışıktan korumak için zar önemlidir. </li><li> Karanlıkta zar tutma 5 dk (x3) ile, oda sıcaklığında PBS-T içinde zar yıkayın. </li><li> Yine karanlıkta zar tutma kalıntı Tween20 kaldırmak için 5 dak (x3), oda sıcaklığında PBS içinde zar yıkayın. </li><li> Karanlıkta filtre kağıt parçası düz membran yatın ve kurumaya bırakın - kuru membran sinyal geliştirmek ve arka plan azaltmak ancak sıyırma ve yeniden tarama için işe yaramaz hale gelebilir sağlar. </li><li> Licor Odyssey tarayıcının membran tarayın. Bu tarandıktan gibi zamana kadar karanlıkta membran tutun. </li><li> Sadece doğru moleküler ağırlık tek bir bant oluşturmak baskın antikorları seçmek. Şekil 3 RPPA ile kullanım için kabul edilebilir ve kabul edilemez antikorların örnekleri gösterilmektedir. </li></ol> 4. RPPA Printing <ol><li> Protein lizatları bir MicroGrid II robotik gözcü kullanarak nitroselüloz kaplı cam slaytlar (Fastslides-whatman) üzerine tespit edildi. Kullanılan slaytlar örnekleri tespit edildiği üzerine 2 pedleri içeriyordu. Her ped Bu durumda 100 örnekleri, özdeş örnekleri ile fark edildi. Diğer kullanılabilir biçimler 1, 8 ve 16 ped slaytları içerir. Pedleri sayısı arttıkça daha küçük her biri üzerine tespit edilebilir numune sayısıdır. </li><li> Beş 2 kat dilüsyonlarının bir dizi her örnekten yapılmış ve her sonra (örnek başına 15 noktalar toplam sonuçlanan) üç nüsha olarak görüldü. </li></ol> 5. RPPA Protein Algılama <ol><li> Aşırı Licor Engelleme Tampon Islak slaytlar (PBS 50:50 seyreltilmiş). Bir sallanan platform üzerinde 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Istenen konsantrasyonlarda Licor Engelleme Tamponu (PBS 50:50 seyreltilmiş) primer antikor 800 ul hazırlayın ve buz üzerinde tutmak. </li><li> Ya (i) tek bir kare Chip Klip slaytlar monteveya (ii) &#39;FastFrame&#39; dört defne slayt tutucu yüzden sıkı bir mühür slayt ve inkübasyon odası arasında oluşan olduğunu. </li><li> Kuyulardan rezidüel tamponu çıkarın ve ilgili kuyulara 600 ul primer antikor ekleyin. </li><li> 4 gecede platformu sallanan bir kapalı ıslak kutu ve inkübe içine slayt ve odasına yerleştirin ° C </li><li> % 0.1 PBS-Tween20 (; 100 ul Tween 20/100 ml PBS PBS-T) Makyaj. </li><li> Soğuk oda slaytları çıkarın ve dikkatle her kuyudan primer antikorlar çıkarın. </li><li> PBS-T 600 ul ekleyin ve 5 dakika (X3) için RT platformu sallanan ilgili slaytlar yıkayın. </li><li> Odyssey Engelleme Tamponu (PBS 50:50 seyreltilmiş) 0.01% ilk etapta 1:2,000 seyreltme (1 ul / 2 ml) SDS içinde seyreltilmesi ile floresan etiketli sekonder antikor hazırlayın. </li><li> Kuyulardan tamponu çıkarın ve ilgili kuyulara 600 ul floresan etiketli sekonder antikor ekleyin. Hafif sallama ile 45 dakika için oda sıcaklığında sekonder antikor inkübe - buNihayet tarandı zamana kadar, ışıktan korumak için zar önemlidir. </li><li> Oda sıcaklığında 600 ul PBS-T iyi ve kısaca yıkama (x3) ikincil antikorlar çıkarın. Taşıyıcı slayt çıkarın ve uygun bir kaba aktarın ve karanlıkta membran tutarak, 15 dakika boyunca aşırı PBS-T yıkayın. </li><li> Yine karanlıkta zar tutarak, kalıntı Tween-20 çıkarmak için PBS-T ile 15 dakika süreyle oda sıcaklığında PBS ile yıkayın daha fazla zar çıkarın. </li><li> 10 dakika için 50 ° C fırın içinde Fastslide kurutun ve sonra Li-Cor Odyssey tarayıcı üzerinde tarama. Tarandiktan kadar karanlıkta slayt tutun. </li><li> Sekonder antikor / kullanılan antikorlara bağlı 680 nm ve / veya 800 nm&#39;de slayt tarayın. İki renk algılama için daima çapraz reaksiyon en aza indirmek için yüksek çapraz adsorbe sekonder antikorlar kullanır. Primer ve sekonder antikor dikkatli seçilmesi iki renk algılama için gereklidir. Birincil öneme seçimidiriki primer antikorları için farklı konak türler (örneğin tavşan ve fare). Bu kolayca ayırt emisyon spektrumları ile boya etiketli anti-tavşan ve anti-fare sekonder antikor tarafından ayrımcılık sağlar. </li><li> Resim dosyaları. Tiff dosyası olarak kaydedilir. Şekil 4 (taranan dosyaların görüntü). </li></ol> 6. Veri Analizi <ol><li> MicroVigene Yazılım (VigeneTech, Carlisle, MA, ABD) başlatın. </li><li> Açın. RPPA slayt tarama içeren tiff görüntü dosyası. </li><li> RPPA slayt görüntü üzerinde bindirmek için bir kılavuz olacak bir önceden tanımlanmış şablon dosyası seçin. </li><li> Click Izgara getirmek için, faiz getirisi (ROI) düğmesinin Bölgeleri tanımlayın. </li><li> RPPA noktalar üzerinde Izgara konumlandırın. Şekil 6a (resmin üzerine ızgara görüntüsü). </li><li> Tüm ROI vurgulamak için Tümünü Seç düğmesini tıklatın. </li><li> Tümünü Bul&#39;u tıklatın. MicroVigene autom olacakatically ROI bulmak noktalar bulmak, plan çıkarma, herhangi bir toz kaldırmak ve noktalar ölçmek. </li><li> RPPA Slayttaki tüm örnekler için sonuçlar getirmek için Görünüm Seyreltme Eğri düğmesini tıklatın. </li><li> Seyreltme Veri Kaydet&#39;i tıklatın. </li><li> Her numune 5 seyreltme noktalar üzerinde yazdırılır olarak üç nüsha halinde, her analiz için 15 puan, hata riskini azaltır ve eğri uydurma kalitesini artırır vardır. MicroVigene antijen-antikor bağlanma kinetik bir Sigmoid eğrisi üretmek için tüm noktalar içeren bir 4-parametreli lojistik-log modeli &quot;Supercurve&quot; algoritması (Şekil 6b), üretir. Varsayım aynı antikor-antijen bağlanma kinetik ortak bir yanıt eğrisi sığdırmak için bir dizi tüm noktalar alarak böylece, hatta farklı örneklerdeki, her numune noktada gerçekleşiyor eğri uydurma 10,11 güvenini artırabilir olduğunu Y = a + ((ba) / (1 + e (c * d-ln (x))) x dilutio olduğuK faktörü ve Y sinyal yoğunluğudur. Numuneler nispeten analizimize supercurve üzerine bu eşleme sonra x değerlerinin orta noktasından y değeri karşılık y0 değeri kullanılarak analiz edilebilir. </li><li> Şekil 7&#39;deki gibi Microsoft Excel ve arsa y0 verileri aktarın. </li><li> İntratümöral protein varyans bir ANOVA çerçevede işlenmemiş ve işlenmiş hastalar için ayrı ayrı hesaplanmıştır. Tüm analiz proteinlerden gelen verilerin birleştirilmesi Varyans dağıtımları Mann-Whitney testi (MWT) ile karşılaştırıldı. Yanlış keşif hızı (FDR) düzeltme 12 uygulandı; bireysel proteinlerin İntratümöral varyansları normallik ve homoscedasticity varsayımları Lillefours ve Fligner testleri kullanılarak sırasıyla, ölçme-değerlendirmeye düzenlenen bir F-testi ile karşılaştırıldı. Işlenmemiş ve işlenmiş hasta numuneleri arasındaki Diferansiyel protein ekspresyonu student t-testi kullanılarak her protein için test nerede normallik ve homoscedasticity varsayımlar aksi MWT yapıldı karşılandı; FDR kombine t-testi ve MWT değerler üzerinde 12 uygulandı. Proteinler için protein ekspresyonu ve varyans Pearson korelasyon Önemi standart bir yaklaşım kullanılarak hesaplanmıştır [R referans] ve FDR 12 uygulanır. </li></ol>

<ol><li>Stewart, G. D., O'Mahony, F. C., Powles, T., Riddick, A. C., Harrison, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+can+molecular+pathology+contribute+to+the+management+of+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Urol%22%5BJournal%5D)">What can molecular pathology contribute to the management of renal cell carcinoma.</a> Nat. Rev. Urol. 8, 255-265 (2011).</li>
<li>Rini, B. I., Michaelson, M. D., Rosenberg, J. E., Bukowski, R. M., Sosman, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitumor+activity+and+biomarker+analysis+of+sunitinib+in+patients+with+bevacizumab-refractory+metastatic+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Antitumor activity and biomarker analysis of sunitinib in patients with bevacizumab-refractory metastatic renal cell carcinoma.</a> J. Clin. Oncol. 26, 3743-3748 (2008).</li>
<li>Swanton, C., Larkin, J. M., Gerlinger, M., Eklund, A. C., Howell, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictive+biomarker+discovery+through+the+parallel+integration+of+clinical+trial+and+functional+genomics+datasets%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Med%22%5BJournal%5D)">Predictive biomarker discovery through the parallel integration of clinical trial and functional genomics datasets.</a> Genome Med. 2, 52(2010).</li>
<li>Cortes, J., Jabbour, E., Kantarjian, H., Yin, C. C., Shan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+BCR-ABL+kinase+domain+mutations+in+chronic+myeloid+leukemia+after+sequential+treatment+with+multiple+tyrosine+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Dynamics of BCR-ABL kinase domain mutations in chronic myeloid leukemia after sequential treatment with multiple tyrosine kinase inhibitors.</a> Blood. 110, 4005-4011 (2007).</li>
<li>Gerlinger, M., Rowan, A. J., Horswell, S., Larkin, J., Endesfelder, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumor+heterogeneity+and+branched+evolution+revealed+by+multiregion+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing.</a> N. Engl. J. Med. 366, 883-892 (2012).</li>
<li>Fisher, R., Larkin, J., Swanton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inter+and+intratumour+heterogeneity%3A+a+barrier+to+individualized+medical+therapy+in+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Inter and intratumour heterogeneity: a barrier to individualized medical therapy in renal cell carcinoma.</a> Front. Oncol. 2, 49(2012).</li>
<li>Yachida, S., Jones, S., Bozic, I., Antal, T., Leary, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distant+metastasis+occurs+late+during+the+genetic+evolution+of+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer.</a> Nature. 467, 1114-1117 (2010).</li>
<li>O'Mahony, F. C., Faratian, D., Varley, J., Nanda, J., Theodoulou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+automated+quantitative+analysis+to+evaluate+epithelial-to-mesenchymal+transition+associated+proteins+in+clear+cell+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The use of automated quantitative analysis to evaluate epithelial-to-mesenchymal transition associated proteins in clear cell renal cell carcinoma.</a> PLoS One. 7, e31557(2012).</li>
<li>Spurrier, B., Ramalingam, S., Nishizuka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse-phase+protein+lysate+microarrays+for+cell+signaling+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Reverse-phase protein lysate microarrays for cell signaling analysis.</a> Nat. Protoc. 3, 1796-1808 (2008).</li>
<li>Hu, J., He, X., Baggerly, K. A., Coombes, K. R., Hennessy, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-parametric+quantification+of+protein+lysate+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Non-parametric quantification of protein lysate arrays.</a> Bioinformatics. 23, 1986-1994 (2007).</li>
<li>Wang, X., Dong, Y., Jiwani, A. J., Zou, Y., Pastor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+protein+arrays+for+quantitative+systems+analysis+of+the+dynamics+of+signaling+pathway+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proteome+Sci%22%5BJournal%5D)">Improved protein arrays for quantitative systems analysis of the dynamics of signaling pathway interactions.</a> Proteome Sci. 9, 53(2011).</li>
<li>Benjamini, Y., Hochberg, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+the+False+Discovery+Rate%3A+A+Practical+and+Powerful+Approach+to+Multiple+Testing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Statistical+Society+Series+B+%28Methodological%29%22%5BJournal%5D)">Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing.</a> Journal of the Royal Statistical Society Series B (Methodological). 57, 289-300 (1995).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada sunulan RPPA yöntemi protein analizleri yaygın olarak kullanılan ancak nispeten düşük verim western blot için yüksek kapasiteli bir alternatif temsil eder. Yöntem örnekleri yüzlerce analiz edilmiş ve aynı anda hücre hatları ve doku örnekleri geniş bir yelpazede yer alan önemli proteinlerinin doğrudan karşılaştırma için izin karşılaştırıldığında yarı kantitatif olmasına imkan verir. Farklı antikor türleri ile Multiplexing daha çok antikor aynı anda kullanılmasına izin tekniğin gücünü artırır. Burada sunulan örnek ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Aprotinin </td><td> Sigma </td><td> A6279 </td></tr><tr><td> fosfataz inhibitörü kokteyli 2 </td><td> Sigma </td><td> P5726 </td></tr><tr><td> fosfataz inhibitörü kokteyli 3 </td><td> Sigma </td><td> P0044 </td></tr><tr><td> proteaz inhibitörü kokteyl </td><td> Roche </td><td> 11836153001 </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Triton-X </td><td> T8787 </td></tr><tr><td> Li-Cor Odyssey Tampon Engelleme </td><td> Li-Cor </td><td> 927-40000 </td></tr><tr><td> TissueLyser </td><td> Qiagen </td><td> 85600 </td></tr><tr><td> MicroGrid II robotik gözcü </td><td> Biorobotics </td><td></td></tr><tr><td> FastFrame &#39;dört defne slayt tutucu </td><td> Whatman </td><td> 10486001 </td></tr><tr><td> FAST Slayt - 2-Pad </td><td> Whatman </td><td> 10485317 </td></tr><tr><td> IRDye 680LT keçi anti-fare IgG </td><td> Licor </td><td> 926-68020 </td></tr><tr><td> IRDye 800CW keçi anti-tavşan IgG </td><td> Licor </td><td> 926-32211 </td></tr></tbody></table>

bireysel renal hücreli kanserlerde içinde protein ekspresyonu varyasyon kaynakları için ters faz protein diziler (rppa) ve kullanımı

The Use of Reverse Phase Protein Arrays (RPPA) to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

Bulunduğu metastatik şeffaf hücreli renal hücreli kanser için hiçbir iyileştirici tedavi, hastalığın yaygın varyantı vardır. Bu tedaviye direnç önemli bir faktör hastalığı 1 moleküler karmaşıklığı olduğu düşünülmektedir. Gibi tirozin kinaz inhibitörü (TKİ)-sunitinib olarak Hedefli tedavi kullanılmıştır, ancak hastaların sadece% 40 1 yıl 2 içinde relaps bu hastaların büyük çoğunluğu ile cevap verecektir. Renal hücreli kanser hastalarında içsel ve kazanılmış direnç gibi soru 3 derece alakalı olduğu gibi. Etkili, kişiselleştirilmiş tedavilerin geliştirilmesi nihai hedefi ile, TKI direnç incelemek için, hedeflenmiş tedavinin belirli bir süre sonra sıralı dokusu, kronik myeloid lösemi 4 başarılı olduğunu kanıtlamıştı bir yaklaşım gereklidir. Ancak renal hücreli karsinom, böyle bir stratejinin uygulama b yüksek düzeyde nedeniyle karmaşıklaşırrenal hücre karsinomu 5,6 yanı sıra diğer katı tümörler içinde bir 7 özelliği oth arası ve intratumoral heterojen. Transkriptomik ve genetik farklılıklar nedeniyle Intertumoral heterojenite iyi bile benzer sunum, evre ve tümör derecesi olan hastalarda kurulmuştur. Buna ek olarak daha büyük moleküler heterojenite temsil etmek olasıdır BİK büyük morfolojik (intratümöral) heterojenite, var olduğu açıktır. Kombine morfolojik analiz ve Fuhrman derecelendirme ile BİK tümörlerin detaylı haritalama ve kategorizasyon proteomik analiz için temsili alanların seçimini sağlar. BİK 8 Protein temelli analiz nedeniyle patoloji laboratuvarlarında yaygın durumuna cazip olmakla birlikte, uygulama spesifik antikorlar 9 sınırlı durumu nedeniyle sorunlu olabilir. Ters Faz Protein Dizilerin dot blot doğa (RPPA), antikor zorunluluktur Borçlar be ön doğrulanmış; kullanılan antikorların böyle sıkı kalite kontrol olarak büyük önem taşımaktadır. Bu kısıtlamaya rağmen dot blot biçimi tek bir nitroselüloz slayda örnekleri yüzlerce baskı sağlayan, tahlil minyatür izin vermiyor. Baskılı slaytlar sonra çoğullama sağlayan, hedefe özgü primer antikor ve fluoresan etiketli ikincil antikoru kullanılarak Batı analizi ile benzer bir şekilde analiz edilebilir. Slayttaki tüm örneklerin genelinde Diferansiyel protein ekspresyonu sonra bir daha maliyet-etkin ve yüksek-throughput şekilde floresans göreli düzeyi karşılaştırılarak aynı anda analiz edilebilir.

Taranan RPPA kayar bir örnek 680 ile gösterilen kanallar 800 nm her ikisi de, Şekil 4 (i) &#39;de görülebilir. Dalga boyu, Şekil 4 (ii) ile görüntü ayırma analiz edilmesi için RPPA kayar ve Şekil 4, (iii) tespit bireysel protein ekspresyonu üzerindeki her bir yastık sağlar. Şekil 4&#39;te görüldüğü gibi (iii) örnek üzerinde tek proteinlerin ekspresyonu gelsolin çok daha düşük bir protein ifade vardır cMYC göre slaydı üzerinde ifade yüks...

RPPA floresan etiketli antikorlar kullanılarak, aynı anda sorgulanmak üzere nitroselüloz slaytlar basılı örnekleri yüzlerce, protein ekspresyonu sağlar. Bu teknik, şeffaf hücreli böbrek karsinomu olan ilaç tedavisi heterojenliğin etkisini araştırmak için uygulanmıştır.

Bireysel Renal Hücreli Kanserlerde içinde Protein Ekspresyonu Varyasyon kaynakları için Ters Faz Protein Diziler (RPPA) ve Kullanımı

Currently there is no curative treatment for metastatic clear cell renal cell cancer, the commonest variant of the disease. A key factor in this treatment ...

Bu prosedürün amacı, ters faz protein dizileri veya RPPA kullanarak renal hücreli kanserde proteomik ekspresyon varyasyonunu incelemektir. Bu, önce tek tek tümörlerin heterojen alanlarının haritalanması ve seçilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, numunelerden proteinleri çıkarmaktır.Daha sonra, proteinler normalize edilir ve RPPA slaytlarına basılır. Son adım, ilgilenilen proteinlere karşı antikorlar kullanarak slaytları analiz etmektir. Sonuç olarak, RPPA, renal hücreli kanserin iki tedavi grubunda diferansiyel proteomik ekspresyon varyasyonunu göstermek için kullanılır.Bu yöntem, renal hücreli kanser alanındaki bazı önemli soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Büyük protein heterojenliği için mevcuttur. Bu tekniğin çıkarımları, hedefe yönelik tedavilerle tedavi edilen renal hücreli kanserli hastaların tedavisini olumlu yönde etkileyebileceğidir.Bunun nedeni, doku örneklerinde hem tedavi öncesi hem de tedavi sonrası heterojenliği araştırabilmemiz ve bu nedenle bu tedavilere karşı kazanılmış direnç geliştiren hastalar için yeni ilaçlanabilir hedefler belirleyebilmemizdir. Kriyostat ve H diz prosedürünü gösteren araştırma laboratuvarı yöneticisi Helen Caldwell, protein ekstraksiyon tekniğini gösteren grubumuzdan araştırma teknisyeni Jo Nanda olacak. Ameliyathane PPA baskısını göstermek, St.Andrews'den meslektaşımız Peter Mullen olacak.Bu işleme başlamak için, tümörleri eksi 80 santigrat derece dondurucudan çıkarın ve kuru buz üzerinde tutun. Tümörleri yaklaşık bir santimetre küplük bölümlere ayırın. Her tümör bölümünün orijinal konumunu birbirine göre haritalayın ve benzersiz bir adla etiketleyin.Numuneleri OCT'de kaplayın ve numuneler lekelendikten sonra eksi 22 santigrat derecelik bir kriyostatta kesin. Hemat, toin ve DSN sayaçları boyama yöntemini kullanarak, donmuş bölümleri mikroskopi ile analiz edin. Kesitlerin berrak hücreli renal hücreli karsinomun canlı bir tümörü olduğundan emin olun ve bunları yüksek dereceli, düşük dereceli veya karışık düşük ve yüksek dereceli olarak derecelendirin.Protein ekstraksiyonu için her tümör içindeki morfolojik olarak farklı bölgelerden en fazla dört numune seçin, bu da tümör örneklerinden protein ekstrakte etmek için daha sonra gösterilecektir. 50 ila 75 miligram doku yerleştirin. Bir CT'den iki mililitrelik tüplere kesin.Bir protein ve fosfataz ve proteaz inhibitörleri ile desteklenmiş 990 mikrolitre lizis tamponu ekleyin. Her tüpe tek bir beş milimetre çelik bilye ekleyin ve beş dakika boyunca 50 hertz'de homojenize edin. Bir doku lazeri kullanarak.Homojenizasyon seviyesini kontrol edin ve ardından beş dakika daha homojenize edin. Bir pipet kullanarak homojenize numuneyi iki mililitrelik yeni bir tüpe aktarın, çelik bilyeyi her numuneye 10 mikrolitre Triton X 100'ün arkasında bırakın ve ardından dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 13.000 kez G'de santrifüjleyin. S süpernatantlarını taze mikro santrifüj tüplerine aktarın ve BCA testini kullanarak protein konsantrasyonunu belirleyin.PPA baskımızdan önce mililitre başına bir miligrama normalleştirilmiş protein konsantrasyonları. Her numuneden beş adet iki katlı seyreltme serisi yapılır. Bu prosedürün en çok zaman alan yönlerinden biri, slaytları yazdırmadan önce iki kez kontrol edilerek yüzlerce seyreltmenin başarılı bir şekilde elde edilmesidir.Daha sonra nitroselüloz kaplı cam slaytlar üzerindeki protein lizatlarını tespit etmek için bir mikro ızgara iki robotik gözcü kullanılır. Her numune üç nüsha halinde lekelenir ve numune başına toplam 15 nokta elde edilir. Bu deneyde kullanılan slaytlar, numunelerin lekelendiği iki ped içeriyordu.Her ped aynı numunelerle, bu durumda 100 numunelerle tespit edildi. Diğer mevcut formatlar arasında bir, sekiz ve 16 ped slaytı bulunur. Ped sayısı ne kadar yüksek olursa, her birinin üzerine gelebilecek numune sayısı o kadar az olur.Protein tespiti prosedürüne başlamak için ıslak slaytlar, aşırı bir bloke edici tampon ve inkübe oda sıcaklığında Sallanan bir platformda bir saat boyunca, istenen konsantrasyonlarda bloke edici tamponda 800 mikrolitre primer antikor hazırlayın ve buz üzerinde tutun. Bir saatlik inkübasyondan sonra. Blokajda, tampon kızaklarını tek çerçeveli talaş klipsine veya hızlı çerçeveli dört tabanlı kayar tutucuya monte edin, böylece sürgü ile inkübasyon odası arasında sıkı bir sızdırmazlık oluşur.Artık tamponu kuyulardan çıkarın ve ilgili kuyucuklara 600 mikrolitre primer antikor ekleyin. Slaytları ve hazneyi kapalı bir ıslak kutuya yerleştirin ve ertesi sabah gece boyunca dört santigrat derecede sallanan bir platformda inkübe edin. Slaytları soğuk odadan çıkarın.Birincil antikorları her birinden dikkatlice çıkarın. 20 veya PBST arasında% 0.1'lik 600 mikro salım ekleyin ve slaytları oda sıcaklığında sallanan bir platformda beş dakika yıkayın. PBST'yi bu şekilde yeni PBST ile değiştirin.Slaytları toplam üç kez yıkayın. Tamponu kuyucuklardan çıkarın ve ilgili kuyucuklara uygun seyreltmede 600 mikrolitre floresan etiketli ikincil antikor ekleyin. İkincil antikorlarla oda sıcaklığında 45 dakika boyunca hafifçe çalkalayarak inkübe edin, zarı taranana kadar ışıktan korumak önemlidir.45 dakika sonra, ikincil antikorları kuyucuklardan çıkarın ve oda sıcaklığında 600 mikrolitre PBST'de üç kez kısaca yıkayın. Slaytları taşıyıcıdan çıkarın, uygun bir kaba aktarın ve fazla PBST'yi 15 dakika boyunca yıkayın. Membranı karanlıkta tutmak.PBST'yi çıkarın ve zarı oda sıcaklığında 15 dakika boyunca PBS ile yıkayın, böylece kalan arayı 20 tekrar çıkarın ve zarı karanlıkta tutun. Hızlı slaytları 50 derece fırında 10 dakika deneyin. Son olarak, kullanılan ikincil antikorlara bağlı olarak slaytları 680 nanometre ve/veya 800 nanometre olarak tarayın.Slaytları taranana kadar karanlıkta tuttuğunuzdan emin olun. Görüntüleri T dosyaları olarak kaydedin. Taranmış bir RPPA slaytı örneği, hem 680 hem de 800 nanometre kanalların gösterildiği bu şekilde görülebilir.Görüntülerin dalga boyuna göre ayrılması, RPPA slaytındaki her bir pedin analiz edilmesini ve burada gösterildiği gibi bireysel protein ekspresyonunun belirlenmesini sağlar. Numuneler boyunca tek tek proteinlerin ekspresyonu, çok daha düşük bir protein ekspresyonuna sahip olan, ancak yine de test edilen tüm numunelerde evrensel olarak ifade edilen cmic'ye kıyasla slayt boyunca yüksek bir ekspresyon seviyesine sahip olan jel tabanı ile benzersizdir. Buna karşılık, CD 10, diğer örneklerin çok az veya hiç ekspresyon tespit edilememesine rağmen, yüksek düzeyde ekspresyon veren belirli numunelerle değişken ekspresyon verdi.Son olarak, p JK iki, arka plan seviyesinin üzerinde herhangi bir saptanabilir protein ekspresyonu üretemedi. Bu sonraki şekil, ikincil antikorlar ile başka bir türün birincil antikorları arasındaki çapraz reaktivite eksikliğini vurgulamaktadır. Sol alttaki resim, 680 nanometrenin doğru dalga boyunda taranan ikincil antikorlar kullanılarak protein ekspresyonunun tespitini göstermektedir.Sağdaki resimde protein ekspresyonu tespit edilmedi, 800 nanometre yanlış dalga boyunda tarandı. RPPA slaytındaki tüm örneklerin karşılaştırmalı analizi için kullanılan süper eğrinin bir örneği burada gösterilmektedir. Yeşil noktalar kabul edilebilir noktaları, kırmızı noktalar ise analiz yazılımında önceden tanımlanmış limitlere dayalı aykırı değerleri temsil eder.Süper eğri, bağıl protein bazlı ekspresyon verileri üretmek için kullanılır. Bu şekil, RPPA'nın tedavi edilmiş ve edilmemiş numuneler arasındaki farkları nasıl tespit edebileceğini vurgulayan üç RPPA slaytından birinde temsili bir protein mlh'nin ekspresyon seviyelerini göstermektedir. Buradaki her örnek bir tümör alt bölgesine karşılık gelir.Bu sonraki şekil, numuneler tedaviye göre gruplandırıldıktan sonra mlh bir için diferansiyel protein ekspresyonunu göstermektedir. Tedavi öncesi ve sonrası örnekler arasında mlh bir ekspresyon intratümöral varyans hesaplandığında tedavi öncesi grupta daha yüksek MLH bir ekspresyon bulundu. Örnekler tedaviye göre gruplandırıldıktan sonra, tedavi sonrası örneklerde daha yüksek bir varyans gözlenmiştir.Bu videoyu izledikten sonra, protein heterojenliği çalışması için PPA'nın nasıl kullanılacağını veya PPA'yı iyi anlamış olmalısınız.

the-use-reverse-phase-protein-arrays-rppa-to-explore-protein

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Thermo Scientific Matrix çok kanallı pipet ile el gibi bir robot kullanarak qPCR için 96-iyi dizileri Biz ön microRNA kurulum ve analiz gösterecektir.

Kantitatif Gerçek-zamanlı PCR (qPCR) Diziler kullanarak Pre-mikro RNA&#39;lar ve microRNA, Profilleme

Bu video, hücre lizatından protein ekspresyon modellerini incelemek için Ters Faz Protein Dizileri (RPPA) gerçekleştirme metodolojisini gösterir. RPPA'da, proteinlerin bir karışımını içeren lizat, nitroselüloz slaytlar üzerine basılır ve ilgilenilen proteinler, floresan etiketli antikorlar kullanılarak analiz edilir.

Ters Fazlı Protein Dizileri Tabanlı Protein Ekspresyon Analizi: Hücre Lizatından Çoklu Proteinlerin Ekspresyonunun Eş Zamanlı Miktar Tayini İçin Bir Prosedür

İmünokompetan farelerde böbrek hücreli karsinom ortotopik bir model uygulanması Araştırmacı aynı hayvanda bir primer böbrek tümörü, akciğer metastazların varlığı ile tanımlanan bir klinik açıdan ilgili bir sistem elde edilir. Bu sistem, klinik öncesi, in vivo olarak tedaviler çeşitli test etmek için de kullanılabilir.

Preklinik Tedaviler Nicel ve Boyuna Değerlendirme A sinjeneik Fare Modeli Yapmış Bir Renal Hücreli Karsinom

Bu el yazması kopya numarası varyasyon analizi serum veya plazma DNA gerçek zamanlı PCR yaklaşımı kullanarak gerçekleştirilen açıklar. Bu yöntem için tahmin kastrasyon dayanıklı prostat kanseri hastalarda ilaç direnci uygundur, ama aynı zamanda diğer hastalıklar için bilgilendirici olabilir.

Serum ve plazma kopya sayı algılama gerçek zamanlı PCR kullanarak

Burada, bir protokol sinyal yolları çeşitli hücresel modellerinde değişiklikler tanımlamak antikor diziler için mevcut. Uyuşturucu/hipoksi/ultra-violet ışık/radyasyon, veya overexpression/downregülasyon/altını gizleme, neden bu değişiklikleri çeşitli hastalık modelleri için önemlidir ve bir tedavi etkili olacak veya mekanizmaları ilaçların belirleyebilirsiniz olup olmadığını gösterir direnç.

Direnç Tirozin kinaz inhibitörleri sinyal iletim yollarının antikor dizileri tarafından bir sorgulama tarafından değerlendirilmesi

Kiaz inhibitörlerinin taranması için kendi kendine biraraya getirilen insan proteinmikrodizilerinin üretimi için ayrıntılı bir protokol sunulmuştur.

Kendi kendine monte Edilen İnsan Protein Mikrodizilerinde Kiaz Inhibitörü Taraması

Metastatik berrak hücreli renal hücreli karsinom kapsamlı bir klinik öncesi araştırma için kapsamlı bir hayvan modeli olmayan bir hastalıktır. Bu protokol hastalık için iki yeni hayvan modelini göstermektedir: ortonik olarak implante edilmiş fare modeli ve tavuk koryoallantoik membran modeli, her ikisi de klinik olgulara benzeyen akciğer metastazı göstermektedir.

Fare Böbreği ve Tavuk Koryoallantoik Membranda Kurulan Metastatik Berrak Hücreli Renal Hücreli Karsinom Modelinin Karşılaştırılması

Burada, mikrofizyolojik bir sistemde kollajen ve kollajen-agaroz matrisleri kullanarak 3D hücre kültürlerinin uygulanması için talimatları detaylandıran protokoller sunuyoruz. Bu protokoller, renal proksimal tübül ve renal hücreli karsinom sferoidlerinin ko-kültürünü destekleyerek in vivo koşulları simüle eder ve böbrek kanseri hücre etkileşimlerinin ileri düzeyde araştırılmasını sağlar.

Böbrek Kanseri İlerlemesini Modellemek için Renal Sağlıklı ve Tümör Epitelinin Mikroakışkan Ko-kültürü

Kütle spektrometresi tabanlı proteomik veriler açık veritabanlarında mevcuttur ve ücretsiz araçlar kullanılarak erişilebilir. Veritabanı aramalarının ve açıklamalarının karmaşıklığı göz önüne alındığında, birçok biyolog bu veri kümelerini kullanma bilgisinden yoksundur. Burada, temel proteomik veri aramaları için ücretsiz araçların kullanımına ilişkin bir kılavuz sunuyoruz.

Ücretsiz Hesaplama Araçlarını Kullanarak Kütle Spektrometresi Tabanlı Proteomik Verilerde Gezinme

Iskemi nedeniyle akut böbrek hasarı için kesin bir fare modeli (AKI), akut böbrek hasarı incelemek ve muhtemelen böbrek hasarı tedavi etmek için tedavi araçları bulmak için önemli bir araçtır. Asılı ağırlık sistemi, böbrek tıkanıklığı neden olmadan, hızlı ve güvenilir renal arter oklüzyonu ve reperfüzyon bir araç sunuyor.

İzole Renal Arter Tıkanıklığı Asılı ağırlık Sistemi

Keşfedin, böbrek hücreli kanserinde proteomik ekspresyon varyasyonlarını RPPA ile analiz etmeyi. Bu yöntem, tedavi yanıtı için biyobelirteçleri belirlemeye ve tümör heterojenliğini anlamaya yardımcı olur.

Bireysel Renal Hücreli Kanserlerde içinde Protein Ekspresyonu Varyasyon kaynakları için Ters Faz Protein Diziler (RPPA) ve Kullanımı (Video) | JoVE Journal

Bireysel Renal Hücreli Kanserlerde içinde Protein Ekspresyonu Varyasyon kaynakları için Ters Faz Protein Diziler (RPPA) ve Kullanımı

Daha fazla video keşfet