Bireysel Renal Hücreli Kanserlerde içinde Protein Ekspresyonu Varyasyon kaynakları için Ters Faz Protein Diziler (RPPA) ve Kullanımı

Bu prosedürün amacı, ters faz protein dizileri veya RPPA kullanarak renal hücreli kanserde proteomik ekspresyon varyasyonunu incelemektir. Bu, önce tek tek tümörlerin heterojen alanlarının haritalanması ve seçilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, numunelerden proteinleri çıkarmaktır.

Daha sonra, proteinler normalize edilir ve RPPA slaytlarına basılır. Son adım, ilgilenilen proteinlere karşı antikorlar kullanarak slaytları analiz etmektir. Sonuç olarak, RPPA, renal hücreli kanserin iki tedavi grubunda diferansiyel proteomik ekspresyon varyasyonunu göstermek için kullanılır.

Bu yöntem, renal hücreli kanser alanındaki bazı önemli soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Büyük protein heterojenliği için mevcuttur. Bu tekniğin çıkarımları, hedefe yönelik tedavilerle tedavi edilen renal hücreli kanserli hastaların tedavisini olumlu yönde etkileyebileceğidir.

Bunun nedeni, doku örneklerinde hem tedavi öncesi hem de tedavi sonrası heterojenliği araştırabilmemiz ve bu nedenle bu tedavilere karşı kazanılmış direnç geliştiren hastalar için yeni ilaçlanabilir hedefler belirleyebilmemizdir. Kriyostat ve H diz prosedürünü gösteren araştırma laboratuvarı yöneticisi Helen Caldwell, protein ekstraksiyon tekniğini gösteren grubumuzdan araştırma teknisyeni Jo Nanda olacak. Ameliyathane PPA baskısını göstermek, St.Andrews'den meslektaşımız Peter Mullen olacak.

Bu işleme başlamak için, tümörleri eksi 80 santigrat derece dondurucudan çıkarın ve kuru buz üzerinde tutun. Tümörleri yaklaşık bir santimetre küplük bölümlere ayırın. Her tümör bölümünün orijinal konumunu birbirine göre haritalayın ve benzersiz bir adla etiketleyin.

Numuneleri OCT'de kaplayın ve numuneler lekelendikten sonra eksi 22 santigrat derecelik bir kriyostatta kesin. Hemat, toin ve DSN sayaçları boyama yöntemini kullanarak, donmuş bölümleri mikroskopi ile analiz edin. Kesitlerin berrak hücreli renal hücreli karsinomun canlı bir tümörü olduğundan emin olun ve bunları yüksek dereceli, düşük dereceli veya karışık düşük ve yüksek dereceli olarak derecelendirin.

Protein ekstraksiyonu için her tümör içindeki morfolojik olarak farklı bölgelerden en fazla dört numune seçin, bu da tümör örneklerinden protein ekstrakte etmek için daha sonra gösterilecektir. 50 ila 75 miligram doku yerleştirin. Bir CT'den iki mililitrelik tüplere kesin.

Bir protein ve fosfataz ve proteaz inhibitörleri ile desteklenmiş 990 mikrolitre lizis tamponu ekleyin. Her tüpe tek bir beş milimetre çelik bilye ekleyin ve beş dakika boyunca 50 hertz'de homojenize edin. Bir doku lazeri kullanarak.

Homojenizasyon seviyesini kontrol edin ve ardından beş dakika daha homojenize edin. Bir pipet kullanarak homojenize numuneyi iki mililitrelik yeni bir tüpe aktarın, çelik bilyeyi her numuneye 10 mikrolitre Triton X 100'ün arkasında bırakın ve ardından dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 13.000 kez G'de santrifüjleyin. S süpernatantlarını taze mikro santrifüj tüplerine aktarın ve BCA testini kullanarak protein konsantrasyonunu belirleyin.

PPA baskımızdan önce mililitre başına bir miligrama normalleştirilmiş protein konsantrasyonları. Her numuneden beş adet iki katlı seyreltme serisi yapılır. Bu prosedürün en çok zaman alan yönlerinden biri, slaytları yazdırmadan önce iki kez kontrol edilerek yüzlerce seyreltmenin başarılı bir şekilde elde edilmesidir.

Daha sonra nitroselüloz kaplı cam slaytlar üzerindeki protein lizatlarını tespit etmek için bir mikro ızgara iki robotik gözcü kullanılır. Her numune üç nüsha halinde lekelenir ve numune başına toplam 15 nokta elde edilir. Bu deneyde kullanılan slaytlar, numunelerin lekelendiği iki ped içeriyordu.

Her ped aynı numunelerle, bu durumda 100 numunelerle tespit edildi. Diğer mevcut formatlar arasında bir, sekiz ve 16 ped slaytı bulunur. Ped sayısı ne kadar yüksek olursa, her birinin üzerine gelebilecek numune sayısı o kadar az olur.

Protein tespiti prosedürüne başlamak için ıslak slaytlar, aşırı bir bloke edici tampon ve inkübe oda sıcaklığında Sallanan bir platformda bir saat boyunca, istenen konsantrasyonlarda bloke edici tamponda 800 mikrolitre primer antikor hazırlayın ve buz üzerinde tutun. Bir saatlik inkübasyondan sonra. Blokajda, tampon kızaklarını tek çerçeveli talaş klipsine veya hızlı çerçeveli dört tabanlı kayar tutucuya monte edin, böylece sürgü ile inkübasyon odası arasında sıkı bir sızdırmazlık oluşur.

Artık tamponu kuyulardan çıkarın ve ilgili kuyucuklara 600 mikrolitre primer antikor ekleyin. Slaytları ve hazneyi kapalı bir ıslak kutuya yerleştirin ve ertesi sabah gece boyunca dört santigrat derecede sallanan bir platformda inkübe edin. Slaytları soğuk odadan çıkarın.

Birincil antikorları her birinden dikkatlice çıkarın. 20 veya PBST arasında% 0.1'lik 600 mikro salım ekleyin ve slaytları oda sıcaklığında sallanan bir platformda beş dakika yıkayın. PBST'yi bu şekilde yeni PBST ile değiştirin.

Slaytları toplam üç kez yıkayın. Tamponu kuyucuklardan çıkarın ve ilgili kuyucuklara uygun seyreltmede 600 mikrolitre floresan etiketli ikincil antikor ekleyin. İkincil antikorlarla oda sıcaklığında 45 dakika boyunca hafifçe çalkalayarak inkübe edin, zarı taranana kadar ışıktan korumak önemlidir.

45 dakika sonra, ikincil antikorları kuyucuklardan çıkarın ve oda sıcaklığında 600 mikrolitre PBST'de üç kez kısaca yıkayın. Slaytları taşıyıcıdan çıkarın, uygun bir kaba aktarın ve fazla PBST'yi 15 dakika boyunca yıkayın. Membranı karanlıkta tutmak.

PBST'yi çıkarın ve zarı oda sıcaklığında 15 dakika boyunca PBS ile yıkayın, böylece kalan arayı 20 tekrar çıkarın ve zarı karanlıkta tutun. Hızlı slaytları 50 derece fırında 10 dakika deneyin. Son olarak, kullanılan ikincil antikorlara bağlı olarak slaytları 680 nanometre ve/veya 800 nanometre olarak tarayın.

Slaytları taranana kadar karanlıkta tuttuğunuzdan emin olun. Görüntüleri T dosyaları olarak kaydedin. Taranmış bir RPPA slaytı örneği, hem 680 hem de 800 nanometre kanalların gösterildiği bu şekilde görülebilir.

Görüntülerin dalga boyuna göre ayrılması, RPPA slaytındaki her bir pedin analiz edilmesini ve burada gösterildiği gibi bireysel protein ekspresyonunun belirlenmesini sağlar. Numuneler boyunca tek tek proteinlerin ekspresyonu, çok daha düşük bir protein ekspresyonuna sahip olan, ancak yine de test edilen tüm numunelerde evrensel olarak ifade edilen cmic'ye kıyasla slayt boyunca yüksek bir ekspresyon seviyesine sahip olan jel tabanı ile benzersizdir. Buna karşılık, CD 10, diğer örneklerin çok az veya hiç ekspresyon tespit edilememesine rağmen, yüksek düzeyde ekspresyon veren belirli numunelerle değişken ekspresyon verdi.

Son olarak, p JK iki, arka plan seviyesinin üzerinde herhangi bir saptanabilir protein ekspresyonu üretemedi. Bu sonraki şekil, ikincil antikorlar ile başka bir türün birincil antikorları arasındaki çapraz reaktivite eksikliğini vurgulamaktadır. Sol alttaki resim, 680 nanometrenin doğru dalga boyunda taranan ikincil antikorlar kullanılarak protein ekspresyonunun tespitini göstermektedir.

Sağdaki resimde protein ekspresyonu tespit edilmedi, 800 nanometre yanlış dalga boyunda tarandı. RPPA slaytındaki tüm örneklerin karşılaştırmalı analizi için kullanılan süper eğrinin bir örneği burada gösterilmektedir. Yeşil noktalar kabul edilebilir noktaları, kırmızı noktalar ise analiz yazılımında önceden tanımlanmış limitlere dayalı aykırı değerleri temsil eder.

Süper eğri, bağıl protein bazlı ekspresyon verileri üretmek için kullanılır. Bu şekil, RPPA'nın tedavi edilmiş ve edilmemiş numuneler arasındaki farkları nasıl tespit edebileceğini vurgulayan üç RPPA slaytından birinde temsili bir protein mlh'nin ekspresyon seviyelerini göstermektedir. Buradaki her örnek bir tümör alt bölgesine karşılık gelir.

Bu sonraki şekil, numuneler tedaviye göre gruplandırıldıktan sonra mlh bir için diferansiyel protein ekspresyonunu göstermektedir. Tedavi öncesi ve sonrası örnekler arasında mlh bir ekspresyon intratümöral varyans hesaplandığında tedavi öncesi grupta daha yüksek MLH bir ekspresyon bulundu. Örnekler tedaviye göre gruplandırıldıktan sonra, tedavi sonrası örneklerde daha yüksek bir varyans gözlenmiştir.

Bu videoyu izledikten sonra, protein heterojenliği çalışması için PPA'nın nasıl kullanılacağını veya PPA'yı iyi anlamış olmalısınız.