Citrobacter rodentium Mouse Model: Bulaşıcı Kolit için çalışılması Patojen ve Host Katılımlar

Bu prosedürün genel amacı, fareleri gram negatif aynalayıcı patojen olan citrobacter kemirgeni ile enfekte ederek koliti indüklemek ve gastrointestinal sistemdeki patojen ve konakçı etkileşimlerinin incelenmesine izin vermektir. Bu, bir gecede sıfır itfa kültürü olan ilk aşılama ile gerçekleştirilir. İkinci adımda, fareler gece boyunca yapılan aşılama ile oral gavaj ile enfekte edilir.

Enfeksiyondan sonraki yedinci günde, son adımda çekum, kolon ve luminal içerik toplanır. Dokular kaplanır, bakteri kolonileri sayılır ve dokular, ilgilenilen konakçı proteinler için immün boyalıdır. Sonuç olarak, patojen yükü, bariyer fonksiyonu, histolojik hasar ve konak yanıtındaki değişiklikler immünohistokimya ile değerlendirilebilir.

Bu yöntem, konakçı patojen etkileşimlerinin ve bağışıklık tepkilerinin incelenmesine izin veren sağlam bir enfeksiyöz kolit modeli sunsa da, bakteriyel enfeksiyonun kolon kanseri riski üzerindeki etkilerini incelemek için de uyarlanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan bireylerde, farelerin bakteriyel enfeksiyonu ile doğal olarak mücadele eder, ya da ya da gage ile. Donmuş bir gliserol stoğundan bir LB elektrolizle üzerine canlı C itfasını sağlamak için steril bir aşılama halkası kullanarak başlayın.

37 santigrat derecede gece boyunca inkübattan sonra, kolonileri LB plakasından üç mililitre steril lb et suyuna aktarmak için bir aşılama halkası kullanın. Daha sonra, ERO Dunum kültürünü aerobik olarak bir tezgah üstü inkübasyon çalkalayıcıda gece boyunca 200 santigrat derecede 37 RPM'de inkübe edin. Ertesi sabah, aşılanmış lb suyu bulanık görünmelidir.

Bakteri hücre kültürünü eşit şekilde dağıtmak için kültürü hafifçe çalkalayın ve ardından bir mililitrelik şırıngayı et suyu ile doldurun ve bir mide gavaj iğnesine takın. Boynundaki ve sırtındaki gevşek deriyi fem ve parmaklarınızla sıkıca kavrayarak gavaj için bir fare seçin. Daha sonra, hayvanın kafasını hareketsiz hale getirmek için hayvanın kafasını işaret parmağınızla geri çekin ve yemek borusunu yerleştirmek için düzeltin.

Fareyi dik konumda tutarak, mide gavaj iğnesinin ampul ucunu hayvanın ağzının kenarı boyunca ve dilinin üzerine yönlendirin. İğneyi hayvanın ağzının çatısı boyunca nazikçe geçirin ve iğneyi yemek borusundan aşağı doğru ilerletin. Son olarak, 100 mikrolitre bakteri aşısını yavaşça enjekte etmek için şırıngayı kullanın ve ardından gavaj iğnesini nazikçe çıkarın.

Farenin solunum hızını ve davranışını geri getirdikten sonra, tahlil gününde kafesi izleyin, fareyi az önce gösterildiği gibi tırnayın ve ardından hayvanı 150 mikrolitre taze hazırlanmış fitzy dekstrin ile gavajlayın. Bu sırada, gavajdan dört saat sonra kafesten yiyecek çekin ve ardından hayvanın sedasyonundan yararlanın. Anestezi uygulanmış hayvandan mümkün olduğunca fazla kan toplamak için kardiyak ponksiyon kullanın.

Pıhtılaşmayı caydırmak için kanı bir mikro santrifüj tüpünde %3 asit sitrat dekstrozun son konsantrasyonuna ekleyin. Daha sonra, kan örneklerini 1000 peynirde ve dört santigrat derecede 12 dakika döndürün. Daha sonra serumu toplayın ve her numunenin 100 mikrolitresinde PBS'de bir ila 10 ve bir ila 100'e kadar eşleştirin.

Bu iki seyreltmede, iki kopya halinde 96 oyuklu bir plakaya yapılır. Standart eğriyi hazırlamak için, orijinal 80 miligramın 100 mikrolitrelik örneklerini mililitre başına seyreltin. Fitz Dextrin, PBS'deki fareleri karanlık mikro santrifüj tüplerinde gavaj yapmak için kullanılır.

Daha sonra standart numuneleri üç nüsha halinde 96 oyuklu bir plakaya ekleyin. Ardından, her bir numunenin floresansını ölçmek ve aseptik teknik kullanarak FXI dekstrin konsantrasyonunu belirlemek için bir florimetre kullanın, bu adıma bir mililitre steril PBS ve bir otoklav metal boncuk ekleyerek başlayın. Ardından her bir tüpü tartın.

Daha sonra, seum ve kolonu fareden çıkardıktan sonra, seumu kolondan ayırın ve uzunlamasına açın. Luminal içeriği forseps ile toplayın ve içeriği bir PBS tüpüne ekleyin. Sekel ve kolon dokularını ayrı tüplere yerleştirmeden önce steril PBS ile yıkayın.

Şimdi doku tüplerini tartın ve numuneleri altı dakika boyunca bir boncuk çırpıcı kullanarak homojenize edin. 30 hertz'de, 96 oyuklu bir plakaya oyuk başına 180 mikrolitre steril PBS ekleyin. Daha sonra her bir homojenize numuneden 20 mikrolitre her sıradaki ilk oyuğa ekleyin ve iyice karıştırın.

İlk kuyucukta 10'dan eksi bire kadar 10'dan eksi altıya kadar seyreltme elde etmek için önceki her bir oyuktan 20 mikrolitre ekleyerek numuneleri seri olarak seyreltin. Daha sonra, 37 santigrat derecede gece boyunca inkübe edildikten sonra ızgaralı kare tabanlı bir LB plakası üzerine her numuneden her bir seyreltmeden 10 mikrolitre plaka ekleyin. Koloni oluşturan birimleri bir plaka üzerinde sayın.

Her numune için üç nüshanın ortalamasını alın ve ardından her numunenin sayıldığı seyreltmeyi kaydedin. Ortalama CFU'yu 50 ile ve numunenin sayıldığı seyreltme faktörü ile çarpın, bu da mililitre başına CFU ile sonuçlanır. Son olarak, daha önce kaydedilmiş 0.5 santimetre kolon ve secum bölümünün gece boyunca, resmi ve fiksasyonundan sonra gram başına CFU'ları belirlemek için doku ağırlığına bölün.

Ertesi sabah, dokuları% 70 etanol ile yıkayın ve parafine gömülmek üzere bir histoloji tesisine göndermek ve dokuları ayırmak için hematin ve eozin ile boyanmak üzere bir kasete koyun. Slaytları 10 dakika boyunca 65 santigrat derece su banyosunda bir coplan boyama kavanozuna yerleştirin. Şimdi, slaytları iki dakikalık dört yıkama için ksilene yerleştirin.

Her biri, slaytları iki beş dakikalık yıkama ve% 100 etanol ile yeniden sulandırın, ardından aşağıdakilerin her birinde beş dakikalık bir yıkama yapın. %95 etanol, %75 etanol ve damıtılmış su. Yıkanmış slaytları önceden ısıtılmış sodyum sitrat tamponlu bir coplan kavanozuna yerleştirin ve ardından kavanozu 30 dakika daha oda sıcaklığında beklettikten sonra 30 dakika buharlı pişiriciye koyun, slaytları PBS Zied ile beş dakika boyunca üç kez yıkayın.

Slaytlar kuruduğunda, dokunun etrafındaki alanı bir pap kalemle işaretleyin. Daha sonra dokuyu oda sıcaklığında immün boyama yapan bir nem odasında bloke edici tampon ile bloke edin. Bir saat sonra, bloke edici tamponu boşaltın ve dokuları gece boyunca dört santigrat derecede 50 ila 100 mikrolitre primer antikor içinde inkübe edin.

Kuluçka süresinden sonra, dokuları beş dakika boyunca PBS Azi ile üç kez yıkayın. Daha sonra slaytları 50 ila 100 mikrolitre ikincil antikor içinde karanlıkta bir saat sonra oda sıcaklığında inkübe edin, slaytları üç kez beş dakika boyunca damıtılmış suyla yıkayın. Son olarak, dokuları kurutun, slaytları dpi, uzun süreli altın montaj ortamı ile kaplayın ve ardından slaytları bir floresan mikroskobu altında görüntüleyen bir kapak kayması uygulayın.

Bu ilk şekil, C 57 siyah altı farenin serumunda ölçülen Fitz dekstrinini ve ayrıca daha önce sağlam bir bağırsak epitel bariyeri bariyeri varlığında enfeksiyon sırasında bozulmuş epitel bariyeri bütünlüğü sergilediği tespit edilen toll benzeri reseptörden nakavt farelere kadar olan Fitz dekstrinini göstermektedir. ZI dekstrin bu tabaka boyunca zayıf geçirgendir. Bu nedenle, serumdaki artan Fitz dekstrin seviyeleri, enfeksiyon sırasında bağırsak epitel bariyeri bütünlüğünün bozulduğunu ve bu molekülün enfekte olmamış farelerde kontrol serumu seviyeleri olarak sızmasına izin verdiğini gösterir.

Fitz dekstrin ile gavaj da sunulmaktadır. Assent, bağırsak epitel hücrelerine yakından yapışabilen bir luminal patojendir. Luminal içerik, sekel ve kolon dokularındaki bakteri yükleri yedinci günde olabilir. Enfeksiyon sonrası.

Kolondaki bakteri yüklerinin gram başına 10 ila dokuzuncu CFU civarında zirve yaptığı bulunmuştur. C 57 PL altı farede C DUM enfeksiyonu sırasında gözlenen patolojinin çoğu, enfeksiyondan sonraki yedinci günde makroskopik olarak kolonun distal, iki santimetresinde meydana gelir. Enfeksiyon sırasında normal olarak kolon mukozasında kalınlaşmanın yanı sıra kolonun kısalması ve uzunluğunda bir azalma görülür.

C 57 PL altı fare, histolojik olarak immün hücre infiltrasyonu, kolonik kriptlerin uzaması ve coit hücre tükenmesi ile karakterize edildiği gibi sadece orta derecede inflamasyon ve patolojiye maruz kalır. Sıfır itfa ile enfeksiyon sırasında oluşan konakçının tepkilerini daha fazla karakterize etmek için, immünofloresan boyama, proliferasyon belirteçleri gibi ilgilenilen proteinlerdeki değişiklikleri incelemek veya enfekte doku içindeki lokalizasyonu gibi bakteriyel yanıtın yönlerini incelemek için kullanılabilir. Bu boyama tekniğinin bir örneği, enfeksiyondan sonraki 12. günde bakteri lokalizasyonunu incelemek için kırmızı renkte görünen hücre proliferasyonu için bir belirteç olan konakçı protein KI 67'yi ve yeşil renkte görünen sıfır de protein yırtılmasını inceleyen bu şekilde gösterilmektedir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa dakikalar içinde gerçekleştirilebilir. Bu prosedürü denerken, farelerin enfekte olduğundan ve enfeksiyon süresince hayvanın sağlığının izlendiğinden emin olmak için ölçme tekniğinin uygun şekilde uygulanması önemlidir. Son 10 ila 15 yıldır, citrobacter rodent modeli, epec gibi karşı karşıya kalan bakteriyel patojenlerin halt halinde bağlanması çalışmaları için altın standart haline gelmiştir.

Ayrıca, bağırsakta TH 17 yanıtlarının gelişimi gibi bakterilere karşı mukozal bağışıklık tepkilerinin incelenmesi için iyi tanınan bir model haline gelmiştir.