Cerrahi Örnekler kaynaktan İnsan pankreas adacıklarının Lazer Diseksiyon için Geliştirilmiş Protokolü

Merhaba, Benim adım Dorte, Reen Laser Teknoloji Üniversitesi'ndeki Thea Hands Enstitüsü'nden. Mikrodiseksiyon, çok az miktarda ana tümörden özel bir hücre popülasyonu elde etmeyi sağlayan bir tekniktir. Kesilen hücreler transkriptomik ve proteomik çalışmalar, DNA değerlendirmesi veya kromozom analizi için kullanılabilir.

Burada, transkriptomik çalışmalar için kullanılmak üzere cerrahi örneklerden insan pankreas meta hücrelerinin elde edilmesi için protokolümüzü sunuyoruz. Pankreas dokusunu küçük parçalar halinde kesin. Bir kriyo kalıbının ortasına bir parça yerleştirin ve Soğutulmuş gömme bileşiği ile kaplayın.

Dokuyu hemen dondurun Soğutulmuş iki malzeme ile Bhutan ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. 40 yapışkan slaytı bölme etiketi ve bunları Mesih Odasının içinde önceden soğutun. Kriyo bloğunu kestikten sonra donmuş dokuyu OCT bileşiği ile numune tutucuya sabitleyin.

40 adet 10 mikrometre kalınlığında kesitler kesin. Slaytın arka tarafına parmağınızla dokunarak bir bölümü bir slayta aktarın ve sadece üzerine bölümü yerleştirme konumunu ısıtın.Bölümleri kriyo ölüsünün içinde iki ila üç dakika deneyin ve daha sonra eksi 80 santigrat derecede saklayın, Ation reaktiflerini hazırlayın ve selin hariç tüm sıvıları buz üzerinde soğutun. Bu, mikro diseksiyondan önce pet hücrelerinin içsel otofloresansını artıracaktır.

Her seferinde dört bölümün değeri düşürülecektir. Aynı anda iki bölümü işleyin. Önce 30 saniye boyunca% 70 etanol içinde sabitleyin.

Ardından bölümleri beş ila altı hızlı daldırmayla yıkayın. Bundan sonra DPC ile arıtılmış suda. Dokuyu bir dakika% 100 etanolde kurutun ve bu adımı tekrarlayın, slaytları dört dakika boyunca selin içinde inkübe edin.

Bu arada, başka bir bölüm çiftinin dehidrasyonunu başlatın. Son olarak, slaytları karanlıkta üç ila beş dakika havayla kurutun. İki slaytı arka arkaya bir folyoya yerleştirerek dokuyu nemden ve otofloresansın ağartılmasından koruyun 50 ml'lik Tüpü sarın Bölümden önce, mikroskobu RNA'larla temizleyin ve yapışkan kapağı robo Mover'a

Slaytı sahne alanına yerleştirin ve kapağı dokunmadan bölümün üzerinde yakından hareket ettirin. Otofloresan daha iyi hücre alanlarını belirleyerek halkaları lokalize edin. İnsan daha iyi hücrelerinin içsel otofloresansı kurulumda sarı görünürken, pankreas kanalları parlak yeşil otofloresan gösterir.

Serbest el seçim aracıyla daha iyi hücre alanlarını seçin ve lazeri başlatarak bunları mikro inceleyin. Dört değeri düşürülmüş kriyo bölümünün deliklerini 40 ila 60 dakika içinde tek bir yapışkan kapağa inceleyin. İstenirse, kapağı Mikroskobun kontrol noktasına hareket ettirerek yakalanan dokuyu kontrol edin.

Robo hareket ettiricinin kapağını çıkarın ve sıkın. Hücre bozulması için kapağın kapağına 10 mikrolitre ekstraksiyon tamponu. Kapağı 30 dakika boyunca 42 santigrat derecede baş aşağı inkübe edin.

Lizatı aşağı doğru döndürün, tüpü etiketleyin ve RNA ekstraksiyonu gerçekleşene kadar eksi 80 azaltılmış Santigrat derecede saklayın. 40 kriyo diseksiyonun tümü ile Ation lazer, mikro diseksiyon ve lizis gerçekleştirin. Daha sonra, 10 lizatı birleştirin ve 11 mikrolitre RNA elde etmek için verilen protokolü takip ederek UR PU RNA izolasyon kitini kullanarak RNA izolasyonuna devam edin.

Genel olarak, mikrodiseksiyon dokusu miktarı ile RNA verimi arasında doğrudan bir ilişki bulamadık Cerrahlar tarafından hasat edilmesi ile pankreas örneğinin patolog tarafından incelendikten sonra dondurulması arasındaki zaman aralığındaki farklılıklar, kısmen geri kazanılan RNA'nın therial kalitesi ve miktarını açıklayabilir. Dikkate alınması gereken diğer önemli faktörler, daha yüksek RNA bütünlüğü kullanılarak daha düşük enerjili mikro diseksiyon için uygulanan lazer enerjisinin yanı sıra lazer odağı ve lazer basınçlı kesici işaretleme noktalarının mesafesidir. Ek olarak, yapışkan kapak ile kapak arasındaki mesafe mümkün olduğunca düşük tutularak RNA miktarı optimize edilebilir.

Lazer mikro diseksiyon mikroskobunun mevcut olması şartıyla, yakalama işlemi sırasında mikro diseke doku kaybını önleyin. Bu prosedür, kısmi pankreas ektomisi yapan herhangi bir araştırma kurumunda uygulanabilir, böylece hem diyabetik olmayan hem de diyabetik deneklerden insan göz kapağı materyaline erişimi artırabilir.