Cerrahi Örnekler kaynaktan İnsan pankreas adacıklarının Lazer Diseksiyon için Geliştirilmiş Protokolü
6 Ocak 2013
Lazer mikrodisseksiyon parankiminde dakika miktarlarda seçili hücrelerin iyileşme sağlayan bir tekniktir. Burada Transkriptomik çalışmaları için kullanılacak cerrahi yöntemlerle alınan insan pankreas adacık elde etmek için bir protokol açıklar. Tüm protokol böylece toplama kolaylaştırılması insan beta hücrelerinin içsel otofloresansı, geliştirir.
Merhaba, Benim adım Dorte, Reen Laser Teknoloji Üniversitesi'ndeki Thea Hands Enstitüsü'nden. Mikrodiseksiyon, çok az miktarda ana tümörden özel bir hücre popülasyonu elde etmeyi sağlayan bir tekniktir. Kesilen hücreler transkriptomik ve proteomik çalışmalar, DNA değerlendirmesi veya kromozom analizi için kullanılabilir.
Burada, transkriptomik çalışmalar için kullanılmak üzere cerrahi örneklerden insan pankreas meta hücrelerinin elde edilmesi için protokolümüzü sunuyoruz. Pankreas dokusunu küçük parçalar halinde kesin. Bir kriyo kalıbının ortasına bir parça yerleştirin ve Soğutulmuş gömme bileşiği ile kaplayın.
Dokuyu hemen dondurun Soğutulmuş iki malzeme ile Bhutan ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. 40 yapışkan slaytı bölme etiketi ve bunları Mesih Odasının içinde önceden soğutun. Kriyo bloğunu kestikten sonra donmuş dokuyu OCT bileşiği ile numune tutucuya sabitleyin.
40 adet 10 mikrometre kalınlığında kesitler kesin. Slaytın arka tarafına parmağınızla dokunarak bir bölümü bir slayta aktarın ve sadece üzerine bölümü yerleştirme konumunu ısıtın.Bölümleri kriyo ölüsünün içinde iki ila üç dakika deneyin ve daha sonra eksi 80 santigrat derecede saklayın, Ation reaktiflerini hazırlayın ve selin hariç tüm sıvıları buz üzerinde soğutun. Bu, mikro diseksiyondan önce pet hücrelerinin içsel otofloresansını artıracaktır.
Her seferinde dört bölümün değeri düşürülecektir. Aynı anda iki bölümü işleyin. Önce 30 saniye boyunca% 70 etanol içinde sabitleyin.
Ardından bölümleri beş ila altı hızlı daldırmayla yıkayın. Bundan sonra DPC ile arıtılmış suda. Dokuyu bir dakika% 100 etanolde kurutun ve bu adımı tekrarlayın, slaytları dört dakika boyunca selin içinde inkübe edin.
Bu arada, başka bir bölüm çiftinin dehidrasyonunu başlatın. Son olarak, slaytları karanlıkta üç ila beş dakika havayla kurutun. İki slaytı arka arkaya bir folyoya yerleştirerek dokuyu nemden ve otofloresansın ağartılmasından koruyun 50 ml'lik Tüpü sarın Bölümden önce, mikroskobu RNA'larla temizleyin ve yapışkan kapağı robo Mover'a
sıkıştırın.Slaytı sahne alanına yerleştirin ve kapağı dokunmadan bölümün üzerinde yakından hareket ettirin. Otofloresan daha iyi hücre alanlarını belirleyerek halkaları lokalize edin. İnsan daha iyi hücrelerinin içsel otofloresansı kurulumda sarı görünürken, pankreas kanalları parlak yeşil otofloresan gösterir.
Serbest el seçim aracıyla daha iyi hücre alanlarını seçin ve lazeri başlatarak bunları mikro inceleyin. Dört değeri düşürülmüş kriyo bölümünün deliklerini 40 ila 60 dakika içinde tek bir yapışkan kapağa inceleyin. İstenirse, kapağı Mikroskobun kontrol noktasına hareket ettirerek yakalanan dokuyu kontrol edin.
Robo hareket ettiricinin kapağını çıkarın ve sıkın. Hücre bozulması için kapağın kapağına 10 mikrolitre ekstraksiyon tamponu. Kapağı 30 dakika boyunca 42 santigrat derecede baş aşağı inkübe edin.
Lizatı aşağı doğru döndürün, tüpü etiketleyin ve RNA ekstraksiyonu gerçekleşene kadar eksi 80 azaltılmış Santigrat derecede saklayın. 40 kriyo diseksiyonun tümü ile Ation lazer, mikro diseksiyon ve lizis gerçekleştirin. Daha sonra, 10 lizatı birleştirin ve 11 mikrolitre RNA elde etmek için verilen protokolü takip ederek UR PU RNA izolasyon kitini kullanarak RNA izolasyonuna devam edin.
Genel olarak, mikrodiseksiyon dokusu miktarı ile RNA verimi arasında doğrudan bir ilişki bulamadık Cerrahlar tarafından hasat edilmesi ile pankreas örneğinin patolog tarafından incelendikten sonra dondurulması arasındaki zaman aralığındaki farklılıklar, kısmen geri kazanılan RNA'nın therial kalitesi ve miktarını açıklayabilir. Dikkate alınması gereken diğer önemli faktörler, daha yüksek RNA bütünlüğü kullanılarak daha düşük enerjili mikro diseksiyon için uygulanan lazer enerjisinin yanı sıra lazer odağı ve lazer basınçlı kesici işaretleme noktalarının mesafesidir. Ek olarak, yapışkan kapak ile kapak arasındaki mesafe mümkün olduğunca düşük tutularak RNA miktarı optimize edilebilir.
Lazer mikro diseksiyon mikroskobunun mevcut olması şartıyla, yakalama işlemi sırasında mikro diseke doku kaybını önleyin. Bu prosedür, kısmi pankreas ektomisi yapan herhangi bir araştırma kurumunda uygulanabilir, böylece hem diyabetik olmayan hem de diyabetik deneklerden insan göz kapağı materyaline erişimi artırabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, cerrahi örneklerden insan pankreas adacıklarını geri kazanmak için lazer mikrodisseksiyon protokolü sunmaktadır. Bu teknik, transkriptomik çalışmalar için beta hücrelerinin toplanmasını geliştirmektedir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Hücre Biyolojisi
- Transkriptomik
Arka Plan
- Lazer mikrodissection, spesifik hücre popülasyonlarının izolasyonuna olanak tanır.
- Özellikle küçük doku örnekleri için oldukça kullanışlıdır.
- Bu teknik, transkriptomik ve proteomik analizler dahil olmak üzere çeşitli çalışmalara uygulanabilir.
- Otoflüoresansın artırılması, hedef hücrelerin toplanmasına yardımcı olur.
Çalışmanın Amacı
- İnsan pankreas adacıklarının elde edilmesi için ayrıntılı bir protokol sağlamak.
- Transkriptomik araştırmalarda beta hücrelerinin incelenmesini kolaylaştırmak.
- Cerrahi örneklerden hücre toplama verimliliğini artırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Pankreas dokusuna uygulanan lazer mikrodissection tekniği.
- Doku örneklerinin küçük parçalara bölünerek hazırlanması.
- Optimal diseksiyon için dokunun soğutulmuş bir bileşiğe gömülmesi.
- İleri analizler için beta hücrelerinin toplanması.
Ana Sonuçlar
- İnsan pankreas adacıklarının başarılı izolasyonu.
- Beta hücrelerinde gözlemlenen iyileştirilmiş otofloresans.
- Protokolün transkriptomik çalışmalar için etkinliğinin kanıtlanması.
- Küçük örneklerden hedeflenen hücre popülasyonlarının toplanmasının kolaylaştırılması.
Sonuçlar
- Protokol, insan pankreas adacıklarının geri kazanımını artırır.
- Lazer mikrodisseksiyon, hücresel analizler için değerli bir araçtır.
- İyileştirilmiş yöntemler, transkriptomik araştırmalarda daha iyi içgörüler elde edilmesini sağlayabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluk
Lazer mikrodissection, sınırlı cerrahi örneklerden insan pankreatik beta hücrelerinin hassas bir şekilde izole edilmesini sağlayarak, diyabetle ilgili dokuların transkriptomik çalışmalarındaki kritik bir darboğazı giderir. Buz gibi soğuk reaktif işleme yoluyla içsel otofloresansı artırarak, bu protokol doku işleme süresini azaltır ve RNA korunmasını geliştirerek metabolik hastalık araştırmalarındaki hedef doğrulamasını doğrudan destekler. Bu yaklaşım, erken keşif iş akışlarındaki aşağı akış omik uygulamaları için saflaştırılmış hücre popülasyonları sağlayarak mekanistik risk azaltma sürecini güçlendirir.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Tip 2 diyabet modellerinde yolak analizi için saf beta hücre popülasyonlarını izole ederek terapötik hipotezlerin sorgulanmasını sağlar.
- Operasyonel Değer: Geliştirilmiş otofloresan yoluyla hedef hücrelerin hızlı ve doğru şekilde tanımlanmasını sağlayarak biyolojik risklerin azaltılmasına yardımcı olur ve hedef seçimindeki yanlış pozitifleri düşürür.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Mikrodisseke adacıklardan tutarlı ve yüksek bütünlüklü RNA girdileri sağlayarak, valide edilmiş biyolojik sistemleri assay standardizasyonuna hazırlar.
- Operasyonel Değer: Biyobelirteç keşif süreçlerinde platformun yeniden kullanımı ve tarama hazırlığı için temel olan tekrarlanabilir kantitatif çıktıları destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Diyabetik patofizyolojisi ile doğrudan bağlantılı insan pankreas adacıklarının transkriptomik analizine olanak tanıyarak hastalıkla olan ilgiyi korur.
- Operasyonel Değer: Mekanistik takip çalışmaları için tanımlanmış hücre popülasyonları sağlayarak, keşif aşamasından preklinik doğrulamaya kadar süreklilik sağlar.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, erken biyoloji aşamasında hipotez test edilmesini sağlayarak, standartlaştırılmış girdiler aracılığıyla analiz geliştirmeyi destekleyerek ve kantitatif moleküler profilleme yoluyla translasyonel kararları bilgilendirerek keşif sürecine entegre olmaktadır.
- Keşif Biyolojisi: Metabolik hastalık modellerinde fonksiyonel hedef doğrulaması için beta hücrelerini izole ederek yolak açıklığa kavuşturulmasını ve biyolojik risklerin azaltılmasını destekler.
- Tarama: İzole adacıklar üzerindeki bileşik etkilerini taramak için kritik olan, tekrarlanabilir RNA verimine sahip analizle hazır örnekler sunar.
- Analitik: Öncü madde tanımlamasını bilgilendirmek amacıyla, diyabetik ve diyabetik olmayan durumlar arasında karşılaştırmaya olanak tanıyan kantitatif transkriptomik okumalar üretir.
- Translasyonel Araştırma: İn vitro bulguları hastalık mekanizmalarıyla ilişkilendiren insan odaklı örnekler sağlayarak preklinik süreklilikle bağlantı kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla projede birincil insan adacıklarına erişim için yeniden kullanılabilir bir yetkinlik oluşturarak, değişken donör kaynaklarına olan bağımlılığı azaltır.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Beta hücresine özgü sinyal yolaklarındaki mekanistik belirsizliği azaltarak öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Kontrollü doku işleme ve tanımlanmış diseksiyon parametreleri aracılığıyla standardizasyonu ve tekrarlanabilirliği geliştirir.
- Stratejik Değer: İnsanla ilgili hücrelerde hedef etkileşiminin erken değerlendirilmesine olanak sağlayarak, geç aşama biyolojik riskini azaltır ve devam/durdur kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Doğrulanmış insan adacık transkriptomik profillerine dayanarak, diyabet hedeflerinin riskle ayarlanmış önceliklendirmesini destekler.
Uygulama Hususları
- Histoloji, kriyoseksiyon ve lazer mikrodissection cihazları konusunda uzmanlık gerektirir.
- AutoLPC kapasitesine sahip bir PALM MicroBeam sistemine veya eşdeğer bir LMD platformuna erişime bağlıdır.
- Kullanıcılar arasında otofloresan ve RNA bütünlüğünü korumak için standartlaştırılmış reaktif hazırlama protokollerini gerektirir.
- Değişken pankreas örneği kalitesi ve toplama ile dondurma arasındaki iskemik süreye yönelik adaptasyon değerlendirmelerini içerir.
- RNA verimi kısıtlamalarıyla sınırlıdır; bu durum, sonraki kitler için yeterli girdi sağlamak amacıyla birden fazla mikrodissect edilmiş örneğin havuzlanmasını gerektirir.
