Cerrahi Örnekler kaynaktan İnsan pankreas adacıklarının Lazer Diseksiyon için Geliştirilmiş Protokolü
January 6th, 2013
Lazer mikrodisseksiyon parankiminde dakika miktarlarda seçili hücrelerin iyileşme sağlayan bir tekniktir. Burada Transkriptomik çalışmaları için kullanılacak cerrahi yöntemlerle alınan insan pankreas adacık elde etmek için bir protokol açıklar. Tüm protokol böylece toplama kolaylaştırılması insan beta hücrelerinin içsel otofloresansı, geliştirir.
Merhaba, Benim adım Dorte, Reen Laser Teknoloji Üniversitesi'ndeki Thea Hands Enstitüsü'nden. Mikrodiseksiyon, çok az miktarda ana tümörden özel bir hücre popülasyonu elde etmeyi sağlayan bir tekniktir. Kesilen hücreler transkriptomik ve proteomik çalışmalar, DNA değerlendirmesi veya kromozom analizi için kullanılabilir.
Burada, transkriptomik çalışmalar için kullanılmak üzere cerrahi örneklerden insan pankreas meta hücrelerinin elde edilmesi için protokolümüzü sunuyoruz. Pankreas dokusunu küçük parçalar halinde kesin. Bir kriyo kalıbının ortasına bir parça yerleştirin ve Soğutulmuş gömme bileşiği ile kaplayın.
Dokuyu hemen dondurun Soğutulmuş iki malzeme ile Bhutan ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. 40 yapışkan slaytı bölme etiketi ve bunları Mesih Odasının içinde önceden soğutun. Kriyo bloğunu kestikten sonra donmuş dokuyu OCT bileşiği ile numune tutucuya sabitleyin.
40 adet 10 mikrometre kalınlığında kesitler kesin. Slaytın arka tarafına parmağınızla dokunarak bir bölümü bir slayta aktarın ve sadece üzerine bölümü yerleştirme konumunu ısıtın.Bölümleri kriyo ölüsünün içinde iki ila üç dakika deneyin ve daha sonra eksi 80 santigrat derecede saklayın, Ation reaktiflerini hazırlayın ve selin hariç tüm sıvıları buz üzerinde soğutun. Bu, mikro diseksiyondan önce pet hücrelerinin içsel otofloresansını artıracaktır.
Her seferinde dört bölümün değeri düşürülecektir. Aynı anda iki bölümü işleyin. Önce 30 saniye boyunca% 70 etanol içinde sabitleyin.
Ardından bölümleri beş ila altı hızlı daldırmayla yıkayın. Bundan sonra DPC ile arıtılmış suda. Dokuyu bir dakika% 100 etanolde kurutun ve bu adımı tekrarlayın, slaytları dört dakika boyunca selin içinde inkübe edin.
Bu arada, başka bir bölüm çiftinin dehidrasyonunu başlatın. Son olarak, slaytları karanlıkta üç ila beş dakika havayla kurutun. İki slaytı arka arkaya bir folyoya yerleştirerek dokuyu nemden ve otofloresansın ağartılmasından koruyun 50 ml'lik Tüpü sarın Bölümden önce, mikroskobu RNA'larla temizleyin ve yapışkan kapağı robo Mover'a
sıkıştırın.Slaytı sahne alanına yerleştirin ve kapağı dokunmadan bölümün üzerinde yakından hareket ettirin. Otofloresan daha iyi hücre alanlarını belirleyerek halkaları lokalize edin. İnsan daha iyi hücrelerinin içsel otofloresansı kurulumda sarı görünürken, pankreas kanalları parlak yeşil otofloresan gösterir.
Serbest el seçim aracıyla daha iyi hücre alanlarını seçin ve lazeri başlatarak bunları mikro inceleyin. Dört değeri düşürülmüş kriyo bölümünün deliklerini 40 ila 60 dakika içinde tek bir yapışkan kapağa inceleyin. İstenirse, kapağı Mikroskobun kontrol noktasına hareket ettirerek yakalanan dokuyu kontrol edin.
Robo hareket ettiricinin kapağını çıkarın ve sıkın. Hücre bozulması için kapağın kapağına 10 mikrolitre ekstraksiyon tamponu. Kapağı 30 dakika boyunca 42 santigrat derecede baş aşağı inkübe edin.
Lizatı aşağı doğru döndürün, tüpü etiketleyin ve RNA ekstraksiyonu gerçekleşene kadar eksi 80 azaltılmış Santigrat derecede saklayın. 40 kriyo diseksiyonun tümü ile Ation lazer, mikro diseksiyon ve lizis gerçekleştirin. Daha sonra, 10 lizatı birleştirin ve 11 mikrolitre RNA elde etmek için verilen protokolü takip ederek UR PU RNA izolasyon kitini kullanarak RNA izolasyonuna devam edin.
Genel olarak, mikrodiseksiyon dokusu miktarı ile RNA verimi arasında doğrudan bir ilişki bulamadık Cerrahlar tarafından hasat edilmesi ile pankreas örneğinin patolog tarafından incelendikten sonra dondurulması arasındaki zaman aralığındaki farklılıklar, kısmen geri kazanılan RNA'nın therial kalitesi ve miktarını açıklayabilir. Dikkate alınması gereken diğer önemli faktörler, daha yüksek RNA bütünlüğü kullanılarak daha düşük enerjili mikro diseksiyon için uygulanan lazer enerjisinin yanı sıra lazer odağı ve lazer basınçlı kesici işaretleme noktalarının mesafesidir. Ek olarak, yapışkan kapak ile kapak arasındaki mesafe mümkün olduğunca düşük tutularak RNA miktarı optimize edilebilir.
Lazer mikro diseksiyon mikroskobunun mevcut olması şartıyla, yakalama işlemi sırasında mikro diseke doku kaybını önleyin. Bu prosedür, kısmi pankreas ektomisi yapan herhangi bir araştırma kurumunda uygulanabilir, böylece hem diyabetik olmayan hem de diyabetik deneklerden insan göz kapağı materyaline erişimi artırabilir.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, cerrahi örneklerden insan pankreas adalarını kurtarmak için lazer mikrodiseksiyon protokolü sunar. Teknik, transkriptomik çalışmalar için beta hücreleri toplamada etkinliği artırır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Hücre Biyolojisi
- Transkriptomik
Arka Plan
- Lazer mikrodiseksiyon, özel hücre popülasyonlarının izole edilmesini sağlar.
- Özellikle küçük doku örnekleri için yararlıdır.
- Teknik, transkriptomik ve proteomik analizler de dahil olmak üzere çeşitli çalışmalara uygulanabilir.
- Otofloresanlıktaki gelişme, hedeflenen hücrelerin toplanmasına yardımcı olur.
Çalışmanın Amacı
- İnsan pankreas adalarını elde etmek için detaylı bir protokol sağlamak.
- Transkriptomik araştırmalarda beta hücrelerinin çalışmasını kolaylaştırmak.
- Cerrahi örneklerden hücre toplamının verimliliğini artırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Pankreas dokusuna uygulanan lazer mikrodiseksiyon tekniği.
- Küçük parçalara kesilerek doku örneklerinin hazırlanması.
- Optimal diseksiyon için dokunun soğuk bir bileşime gömülmesi.
- Daha fazla analiz için beta hücrelerinin toplanması.
Ana Sonuçlar
- İnsan pankreas adalarının başarılı bir şekilde izole edilmesi.
- Beta hücrelerinde geliştirilmiş otofloresanlık gözlemlendi.
- Protokolün, transkriptomik çalışmalar için etkinliği gösterildi.
- Küçük örneklerden hedeflenen hücre popülasyonlarının toplanmasını kolaylaştırdı.
Sonuçlar
- Protokol, insan pankreas adalarının kurtarılmasını artırır.
- Lazer mikrodiseksiyon, hücresel analiz için değerli bir araçtır.
- Geliştirilen yöntemler, transkriptomik araştırmalarda daha iyi anlayışlara yol açabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Laser microdissection enables precise isolation of human pancreatic beta cells from limited surgical specimens, addressing a critical bottleneck in transcriptomic studies of diabetes-relevant tissues. By enhancing intrinsic autofluorescence through ice-cold reagent processing, the protocol reduces tissue handling time and improves RNA preservation, directly supporting target validation in metabolic disease research. This approach strengthens mechanistic de-risking by providing purified cell populations for downstream omics applications in early discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating pure beta cell populations for pathway analysis in type 2 diabetes models.
- Operational Value: Facilitates biological de-risking through rapid, accurate identification of target cells via enhanced autofluorescence, reducing false positives in target selection.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for assay standardization by providing consistent, high-integrity RNA inputs from microdissected islets.
- Operational Value: Supports reproducible quantitative outputs essential for screening readiness and platform reuse in biomarker discovery pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance by enabling transcriptomic analysis of human pancreatic islets directly linked to diabetic pathophysiology.
- Operational Value: Ensures continuity from discovery through preclinical validation by supplying defined cell populations for mechanistic follow-up studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by enabling hypothesis testing in early biology, supporting assay development through standardized inputs, and informing translational decisions via quantitative molecular profiling.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking by isolating beta cells for functional target validation in metabolic disease models.
- Screening: Delivers assay-ready samples with reproducible RNA yields, critical for screening compound effects on isolated islets.
- Analytics: Generates quantitative transcriptomic readouts that allow comparison between diabetic and non-diabetic states to inform lead identification.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing human-relevant samples that bridge in vitro findings to disease mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for accessing primary human islets across multiple projects, reducing dependency on variable donor sources.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in beta cell-specific signaling pathways.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through controlled tissue processing and defined dissection parameters.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early assessment of target engagement in human-relevant cells, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of diabetes targets based on validated human islet transcriptomic profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in histology, cryosectioning, and laser microdissection instrumentation.
- Dependent on access to a PALM MicroBeam system or equivalent LMD platform with AutoLPC capability.
- Necessitates standardized reagent handling protocols to maintain autofluorescence and RNA integrity across users.
- Involves adaptation considerations for varying pancreatic specimen quality and ischemic time between harvest and freezing.
- Limited by RNA yield constraints, necessitating pooling of multiple microdissected samples for sufficient input to downstream kits.
