Mikrobiyal Tek Hücreli Analiz için Mikroakışkan Pikolitre Biyoreaktör: Fabrikasyon, Sistem Kurulumu ve Çalışması

Bu prosedürün genel amacı, sabit çevresel koşullar altında mikroakışkan bir kültür cihazı kullanarak, tekil bakterileri ve gelişen izojenik mikrokolonileri tam uzaysal ve zamansal çözünürlükle analiz etmektir. Bu işlem, öncelikle CAD yazılımı kullanılarak bir mikroakışkan kültür sisteminin tasarlanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, bakterilerin tek tabakalı büyüme ile sınırlandırılması için bir mikron yüksekliğinde piko-litre biyoreaktörler içeren, polidimetilsiloksan'dan tek kullanımlık mikroakışkan kültür cihazları üretilir.

Ardından, biyoreaktörler içindeki tekil ana hücreleri inoküle etmek için mikrobiyal kültür mikroakışkan cihaza infüze edilir. Bu hücreler, sistem üzerinden büyüme ortamının sürekli infüzyonu ile çoğaltılır. Sonuçlar; endüstriyel açıdan ilgili bir Corynebacterium glutamicum suşunun kültivasyonunu, büyüme verilerini ve hücre-hücre heterojenliğini gösteren otomatik zaman atlamalı mikroskopi ile elde edilir.

Geleneksel biyoteknolojide analizlerin çoğu ortalama verilere dayanır. Mikroakışkan cihazımız, bireysel bakterilerin tek hücre analizini mekansal ve zamansal çözünürlükle kolaylaştırır. Bu cihaz, izojenik mikrokolonilerin hücreden hücreye heterojenliğini yakından incelemek için kullanışlı bir araçtır.

Alt mikron ortam çözünürlüğüne sahip tek kullanımlık mikroakışkan cihazlar üretmek için yaygın SU-8 fotolitografi ve polidimetilsiloksan çip kalıplama yöntemlerini uyguluyoruz. Teknolojimizi Escherichia coli ve Corynebacterium glutamicum gibi çeşitli biyoteknolojik mikroorganizmalarla başarıyla kanıtladık. Başlamak için, mikroakışkan cihazı CAD yazılımı kullanarak tasarlayın.

Bu protokolde sunulan tasarım; iki ekim girişi, iki farklı substratı karıştırmak için bir gradyan jeneratörü, bir çıkış ve her biri beş biyoreaktörden oluşan altı diziden meydana gelmektedir. Temiz oda ortamında, dört inçlik bir silikon gofret hazırlayın ve beraberindeki metin protokolünde açıklandığı şekilde gofret üzerine bir mikron SU-8 2000.5 fotoresist spin kaplama yöntemiyle uygulayın. Fazla solventi uzaklaştırmak için kaplanmış gofreti 95 °C sıcaklıktaki bir ısıtıcı tabla üzerine yerleştirin ve ardından piko litre reaktörlerin yakalama bölgelerini içeren ilk katman foto maskesini ve kaplanmış gofreti maska hizalama cihazına yerleştirin.

Ardından, wafer'ı vakum temas modunda, santimetrekare başına yedi miliwatt şiddetindeki 350 ila 400 nanometre ışığa üç saniye boyunca maruz bırakın. SU-8'in polimerizasyonunu başlatmak için düz bir ısıtıcı plaka üzerinde 95 °C'de poz sonrası pişirme işlemi uygulayın. Sonra, wafer'ı bir dakika boyunca SU-8 geliştirici banyosuna yerleştirin ve ardından wafer'ı birkaç saniye boyunca taze SU-8 geliştirici içeren ikinci bir kaba aktarın.

SU-8 geliştiriciyi uzaklaştırmak ve gofretlemi kurutmak için gofreti izopropanol ile durulayın; kurutma işlemi için azot akışı veya gofret döndürücü kullanın. Ardından, gofreti 150 °C'de 10 dakika boyunca sert pişirmeye (hard bake) tabi tutun. Son olarak, ana kalıbı tamamlamak için beraberindeki metin protokolünde açıklandığı şekilde ikinci katmanı oluşturun.

Baz ve taşıyıcı ajanı 10'a bir oranında karıştırarak PDMS çip fabrikasyonuna başlayın. PDMS karışımını, tüm kabarcıklar gidene kadar bir vakum desikatörü içerisinde yaklaşık 30 dakika boyunca gazdan arındırın. Ardından, SU-8 wafer'ı bir kalıplama düzeneğine yerleştirin ve wafer üzerine üç milimetrelik bir PDMS karışımı tabakası dökün.

Ardından, PDMS'i bir fırında 80 °C'de üç saat boyunca pişirin. Soğuduktan sonra, PDMS tabakasını wafer'dan dikkatlice soyun ve temiz, keskin bir neşter kullanarak tabakayı tekil çiplere bölün. Çipleri 90 dakika boyunca n-pentan banyosunda, ardından her biri 90 dakika süren iki adet aseton yıkama banyosunda yıkayın.

Çipler üzerindeki solvent kalıntılarını gidermek için çipleri gece boyunca kurutun. Deneyden hemen önce, tüpleri PDMS çipe bağlamak için kullanılan konnektörlerden biraz daha küçük çaplı bir iğne veya delgeç kullanarak PDMS çip üzerinde giriş ve çıkış deliklerini açın. Ardından, mikroakışkan PDMS çipi izopropanol ile dikkatlice temizleyin ve yapışan toz partiküllerini temizlemek için şeffaf bant kullanın.

Ayrıca, 170 mikron kalınlığındaki bir cam lamı önce aseton, ardından izopropanol ve son olarak deiyonize su ile temizleyin ve lamı bir nitrojen akımıyla kurutun. Temizlendikten ve kuruduktan sonra, cam lamı ve PDMS çipi 50 Watt güç ve 20 sccm oksijen akış hızıyla 25 saniye boyunca plazma ile oksitleyin. Ardından, PDMS'i camın üzerine yerleştirmeden önce PDMS ve cam çipi dikkatlice hizalayın; bu işlem saniyeler içinde bağlanmalarını sağlayacaktır.

Düzenek 80 °C'de 10 saniye boyunca fırınlanarak bağ sabitlenir. Bakterileri bir çip deneyi için hazırlamak üzere, C.glutamicum gibi istenen bir bakteri suşunun tek bir kolonisini 20 ml taze BHI besiyerine inoküle edin ve kültürü 30 °C'de, 120 RPM hızındaki döner çalkalayıcıda gece boyunca inkübe edin. Ertesi sabah, başlangıç kültüründen 10 µL'yi, 20 ml istenen besiyeri içeren ikinci bir kültüre aktarın ve hücrelerin aynı koşullar altında gece boyunca büyümesine izin verin.

Ertesi gün, bir ters mikroskobun inkübatörünü 30 °C'ye kadar önceden ısıtın. Bu işlem, kullanılan düzeneğe bağlı olarak iki saate kadar sürebilir. Düzenek ısınırken inkübatörü açın, istenen objektifi seçin ve gerekli olan herhangi bir montaj medyumu ile hazırlayın.

Ardından, çipi çip tutucuya yerleştirin ve sabitleyin. Numuneyi mikroskopta ortalayın ve piko litre biyoreaktör dizilerine odaklanın. Çip odaklandığında, giriş ve çıkışları uygun borularla bağlayın ve ardından çıkış borusunu bir atık haznesine yerleştirin.

Ardından, bir şırıngayı taze besiyeri ile doldurun, bir şırınga pompasına yerleştirin ve çipi hazırlamak için mikroakışkan kanalları dakikada 200 nanolitre akış hızında bir saat boyunca durulayın. Hücreler henüz erken eksponansiyel büyüme evresindeyken, bir mililitre bakteri kültürünü steril bir şırıngaya aktarın ve besiyeri içeren şırıngayı ve boruyu, hücre süspansiyonu ve yeni boruyla değiştirin. Pikolitre biyoreaktörlerin çoğu dolana kadar hücre süspansiyonunu kanallara dakikada 200 nanolitre hacimsel akış hızında infüze edin.

Sadece az sayıda biyoreaktör doldurulacaksa, akış hızını dakikada 800 ila 1200 nanolitreye yükseltin. İstenen miktarda hücre ekildiğinde, hücre süspansiyonunu ayırın, büyüme ortamını çipe tekrar bağlayın ve dakikada 100 nanolitre hızla taze besiyeri ile perfüzyon yapın. Ardından, çipi tarayın ve time-lapse görüntüleme için belirli biyoreaktörleri seçin.

Ardından, biyoreaktörleri başlangıçtan bitişe kadar görüntülemek ve deneyi başlatmak için bir time-lapse mikroskopi sekansı konfigüre edin. Tüm piko litre biyoreaktörler aşırı büyüdüğünde, deneyi durdurun ve çipleri uygun şekilde imha edin. Analize başlamak için öncelikle, ana hücrelerin sayısı ve konumu gibi deney için istenen tüm kriterleri karşılayan biyoreaktörleri belirleyin.

Image J gibi bir analiz programı kullanarak, her zaman noktasındaki hücre sayısını sayarak her bir mikrokoloninin büyüme hızını belirleyin. Zaman ile hücre sayısının logaritmasını grafikleyerek maksimum büyüme hızını hesaplayın. Burada sunulan sistem; büyüme, morfoloji veya floresan sinyali gibi farklı biyolojik parametreler açısından çeşitli bakteri türlerini incelemek için uygulanabilir.

Bu örnekte, C.glutamicum standart kültür koşulları altında kültüre edilmiş ve üç izojenik mikrokoloniden elde edilen büyüme eğrileri burada gösterilmiştir. Pikolitre biyoreaktörlerin, burada gösterildiği üzere zaman geçirmeli floresan mikroskopisi kullanılarak protein üretimine erişimde faydalı olduğu da kanıtlanmıştır. Hücreler düşük konsantrasyonda protein indükleyicisi IPTG'ye maruz bırakılarak, tek bir ana hücreden başlayan koloniler içerisinde proteinin hücreler arası varyasyonları tek hücre düzeyinde incelenebilmektedir.

Gösterilen teknik, kusursuz çevresel kontrol ile tekil bakteriyel hücrelerin izlenmesi ve analiz edilmesi için uygulanabilir. Bu, geleneksel laboratuvar ölçekli kültürleme sistemleri kullanılarak pek mümkün değildir. Bu videoyu izledikten sonra, benzer tek hücre analizlerini gerçekleştirmek için mikroakışkan kültürleme çiplerinin nasıl hazırlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.