Mikrobiyal Tek Hücreli Analiz için Mikroakışkan Pikolitre Biyoreaktör: Fabrikasyon, Sistem Kurulumu ve Çalışması

Bu prosedürün genel amacı, bir mikroakışkan yetiştirme cihazı kullanarak sabit çevresel koşullar altında tek bakterileri ve gelişen izojenik mikrokolonileri tam uzamsal ve zamansal çözünürlükle analiz etmektir. Bu, önce CAD yazılımı kullanılarak bir mikroakışkan yetiştirme sistemi tasarlanarak gerçekleştirilir. Daha sonra, tek kullanımlık mikroakışkan yetiştirme cihazları, bakterilerin tek tabaka büyümesini sınırlamak için bir mikron ve yükseklikte pikolitre biyoreaktörler içeren polidimetilsiloksan'dan üretilir.

Mikrobiyal kültür daha sonra biyoreaktörler içindeki tek ana hücreleri aşılamak için mikroakışkan cihaza infüze edilir. Bu hücreler, sistem boyunca sürekli büyüme ortamı infüzyonu ile genişletilir. Sonuçlar, endüstriyel olarak ilgili bir Corynebacterium glutamicum suşunun yetiştirilmesini, büyüme verilerini ve hücre-hücre heterojenliğini gösteren otomatik hızlandırılmış mikroskopiden elde edilir.

Geleneksel biyoteknolojide, çoğu analiz ortalama verilere dayanır. Mikroakışkan cihazımız, tek tek bakterilerin uzamsal ve zamansal çözünürlükle tek hücre analizini kolaylaştırır. İzojenik mikrokolonilerin hücreden hücreye heterojenliğine yakından bakmak için yararlı bir araçtır.

Alt mikro ortam çözünürlüğüne sahip tek kullanımlık mikroakışkan cihazlar üretmek için ortak SU-8 fotolitografi ve polidimetilsiloksan çip kalıplama uyguluyoruz. Teknolojimizi Escherichia coli ve Corynebacterium glutamicum gibi çeşitli biyoteknik mikroorganizmalarla başarıyla gösterdik. Başlamak için, CAD yazılımı kullanarak mikroakışkan cihazı tasarlayın.

Bu protokolde sunulan tasarım, iki tohumlama girişi, iki farklı substratı karıştırmak için bir gradyan jeneratörü, bir çıkış ve her biri beş biyo-reaktörden oluşan altı diziden oluşur. Temiz bir odada, dört inçlik bir silikon gofret hazırlayın ve ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi gofret üzerine bir mikron SU-8 2000.5 fotorezist kodlayın. Fazla çözücüyü çıkarmak için kaplanmış gofreti 95 santigrat derecede sıcak bir plakaya yerleştirin ve ardından pikolitre reaktörlerinin yakalama bölgelerinden ve kaplanmış gofretten oluşan ilk katman fotoğraf maskesini maske hizalayıcının içine yerleştirin.

Ardından, gofretleri vakum temas modunda santimetre kare başına yedi miliwatt yoğunlukta üç saniye boyunca 350 ila 400 nanometre ışığa maruz bırakın. SU-95'in polimerizasyonunu başlatmak için 8 santigrat derecede düz bir sıcak plaka üzerinde maruz kalma sonrası bir pişirme gerçekleştirin. Daha sonra, gofreti bir dakika boyunca bir SU-8 geliştirici banyosuna yerleştirin ve ardından gofreti birkaç saniye boyunca taze SU-8 geliştirici içeren ikinci bir kaba aktarın.

SU-8 geliştiricisini çıkarmak için gofreti izopropanol içinde durulayın ve gofreti nitrojen akışı veya bir gofret döndürücü kullanarak kurutun. Ardından, gofretleri 150 santigrat derecede 10 dakika pişirin. Ardından, ana kalıbı tamamlamak için ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi ikinci katmanı üretin.

Tabanı ve taşıma maddesini 10'a bir oranında karıştırarak PDMS çip imalatına başlayın. PDMS karışımını, tüm kabarcıklar kaybolana kadar bir vakumlu desikatör içinde yaklaşık 30 dakika gazdan arındırın. Ardından, SU-8 gofretini bir kalıplama cihazına yerleştirin ve gofret üzerine üç milimetrelik bir PDMS karışımı tabakası dökün.

Ardından, PDMS'yi bir fırında 80 santigrat derecede üç saat pişirin. Soğuduktan sonra, PDMS levhasını gofretten dikkatlice soyun ve temiz ve keskin bir neşter kullanarak levhayı tek talaşlar halinde kesin. Cipsleri 90 dakika boyunca bir n-pentan banyosunda yıkayın, ardından her biri 90 dakika boyunca iki aseton yıkama banyosu yapın.

Herhangi bir solvent kalıntısını gidermek için cipsleri gece boyunca kurutun. Deneyden hemen önce, boruları PDMS çipine bağlamak için kullanılan konektörlerden biraz daha küçük çaplı bir iğne veya delgeç kullanarak giriş ve çıkış deliklerini PDMS çipine delin. Ardından, mikroakışkan PDMS çipini izopropanol ile dikkatlice temizleyin ve yapışan toz parçacıklarını çıkarmak için bant kullanın.

Ayrıca, 170 mikron inceliğinde bir cam slaytı önce asetonla, ardından izopropanolle, ardından deiyonize suyla temizleyin ve slaytı bir nitrojen akışı ile kurutun. Temiz ve kuruduktan sonra, plazma cam sürgüyü ve PDMS çipini 50 Watt'lık bir güç ve 20 sccm'lik bir oksijen akış hızı kullanarak 25 saniye boyunca oksitler. Ardından, PDMS'yi camın üzerine yerleştirmeden önce PDMS'yi ve cam çipini dikkatlice hizalayın, bu da camın saniyeler içinde yapışmasına neden olacaktır.

Kurulumu 80 santigrat derecede 10 saniye pişirerek bağı sabitleyin. Bakterileri bir çip deneyine hazırlamak için, C.glutamicum gibi istenen bir bakteri suşunun tek bir kolonisini 20 mililitre taze BHI ortamına aşılayın ve kültürü gece boyunca 30 santigrat derecede 120 RPM'de döner bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin. Ertesi sabah, 10 mikrolitre başlangıç kültürünü, istenen ortamdan 20 mililitre içeren ikinci bir kültüre aktarın ve hücrelerin aynı koşullar altında gece boyunca büyümesine izin verin.

Ertesi gün, ters çevrilmiş bir mikroskobun inkübatörünü 30 santigrat dereceye ısıtın. Bu, bireysel kuruluma bağlı olarak iki saat kadar sürebilir. Kurulum ısınırken, inkübatörü açın ve istenen hedefi seçin ve gerekli herhangi bir montaj ortamı ile hazırlayın.

Ardından, çipi çip tutucunun içine monte edin ve yerine sabitleyin. Numuneyi mikroskop üzerinde ortalayın ve pikolitre biyoreaktör dizilerine odaklanın. Çip odaktayken, girişleri ve çıkışları uygun borularla bağlayın ve ardından çıkış borusunu bir atık haznesine yerleştirin.

Daha sonra, bir şırıngayı taze ortamla doldurun, bir şırınga pompasına yerleştirin ve çipi doldurmak için mikroakışkan kanalları dakikada 200 nanolitre akış hızında bir saat boyunca durulayın. Hücreler hala erken üstel büyüme aşamasındayken, bakteri kültürünün bir mililitresini steril bir şırıngaya aktarın ve şırınga ve boru içeren ortamı hücre süspansiyonu ve taze boru ile değiştirin. Pikolitre biyoreaktörlerin çoğu dolana kadar hücre süspansiyonunu dakikada 200 nanolitrelik hacimsel bir akış hızında kanallara infüze edin.

Yalnızca az sayıda biyoreaktör doldurulursa, akış hızını dakikada 800 ila 1200 nanolitreye yükseltin. İstenilen miktarda hücre tohumlandığında, hücre süspansiyonunu ayırın, büyüme ortamını çipe yeniden bağlayın ve dakikada 100 nanolitre taze ortamla perfüzyon yapın. Ardından, çipi tarayın ve hızlandırılmış görüntüleme için belirli biyoreaktörleri seçin.

Ardından, biyoreaktörleri baştan sona görüntülemek ve deneye başlamak için hızlandırılmış bir mikroskopi dizisi yapılandırın. Tüm pikolitre biyoreaktörleri aşırı büyüdüğünde, deneyi durdurun ve talaşları uygun şekilde atın. Analize başlamak için önce hangi biyoreaktörlerin ana hücrelerin sayısı ve konumu gibi deney için istenen tüm kriterleri karşıladığını belirleyin.

Resim J gibi bir analiz programı kullanarak, her bir zaman noktasındaki hücre sayısını sayarak her bir mikrokoloninin büyüme oranını belirleyin. Hücre numarasının günlüğüne karşı zamanı çizerek maksimum büyüme oranını hesaplayın. Burada sunulan sistem, büyüme, morfoloji veya floresan sinyali gibi farklı biyolojik parametrelere göre çeşitli bakteri türlerini incelemek için uygulanabilir.

Bu örnekte, C. glutamicum standart yetiştirme koşulları altında kültürlenmiştir ve üç izojenik mikrokoloniden türetilen sonuçta elde edilen büyüme eğrileri burada gösterilmiştir. Pikolitre biyoreaktörlerinin, burada gösterildiği gibi hızlandırılmış floresan mikroskobu kullanılarak protein üretimine erişimde de yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Hücreleri düşük bir protein indükleyici IPTG konsantrasyonuna maruz bırakarak, proteinin hücreden hücreye varyasyonları, tek bir ana hücreden başlayarak koloniler içindeki tek hücre düzeyinde incelenebilir.

Gösterilen teknik, mükemmel çevresel kontrol ile tek bakteri hücrelerini izlemek ve analiz etmek için uygulanabilir. Bu, geleneksel tezgah ölçekli yetiştirme sistemleri kullanılarak pek mümkün değildir. Bu videoyu izledikten sonra, karşılaştırılabilir tek hücre analizi yapmak için mikroakışkan yetiştirme çiplerinin nasıl hazırlanacağını iyi anlamış olmalısınız.