Name: Mikrobiyal Tek Hücreli Analiz için Mikroakışkan Pikolitre Biyoreaktör: Fabrikasyon, Sistem Kurulumu ve Çalışması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-06T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Öğrenin mikroakışkan pikolitre biyoreaktör kullanarak tek hücreli bakteri analizi ve izojenik mikrokoloni büyümesini incelemeyi. Bu yöntem Corynebacterium glutamicum ve Escherichia coli gibi mikroorganizmaların fenotipik heterojenitesini araştırmaya olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, değerli katkıları için teknisyen Agnes Müller-Schröer'e teşekkür eder. Bu çalışma kısmen Forschungszentrum Jülich GmbH'deki Helmholtz Nanoelektronik Tesisi'nde (HNF) gerçekleştirildi. Yazarlar cömert yardım ve destek için minnettarlar.

1. Gofret İmalatı
<ol>
	<li>CAD yazılımı kullanarak girişleri, çıkışları, ana kanalları ve PLBR'leri (Şekil 1A) içeren mikroakışkan cihazı tasarlayın.</li>
	<li>Bu protokolde sunulan tasarım (Şekil 2), iki tohumlama girişi, iki farklı substratın karıştırılması için bir gradyan jeneratörü, bir çıkış ve altı PLBR dizisinden oluşur. Her dizi 5 PLBR içerir, bu da bir mikroakışkan cihaz içinde 30 paralel PLBR ile sonuçlanır.</li>
	<li>İstenen çip düzenlerini içeren bir litografi fotoğraf maskesi oluşturun (Şekil 1B). Fotomaske, mikron altı çözünürlükte elektron ışını yazımı ile şirket içinde üretildi. Kullanılan maske, 5'i2 arada cam plaka üzerinde bir krom tabakadan oluşuyordu. 
	Not: Aşağıdaki tüm adımları temiz oda sınıfı 100 veya daha iyisi koşullar altında gerçekleştirin (Şekil 3A ve 3B'de bir proses akış şeması gösterilmiştir).</li>
	<li>4 inç silikon gofreti piranha (10:1 oranında sülfürik asit ve hidrojen peroksit) ve hidroflorik asit ile birkaç dakika temizleyin (Dikkat: tehlikeli kimyasallar). Deiyonize (DI) su ile yaklaşık 10 saniye durulayın.</li>
	<li>Gofretleri 200 °C'de 20 dakika kurutun.</li>
	<li>Gofret üzerine 1 μm SU-8 2000.5 fotorezist sıkın (1. katman) (4 ml direnç, 10 saniye sıkma, v = 500 rpm ve a = 100 rpm/sn, v = 1.000 rpm ve a = 300 rpm/sn ile 30 saniye sıkma).</li>
	<li>Fazla solventi çıkarmak için kaplanmış gofreti 95 °C'de bir ocak gözüne yerleştirin (65 °C'de 1,5 dakika, 95 °C'de 1,5 dakika ve 65 °C'de 1 dakika; ideal olarak iki ocak gözü kullanın).</li>
	<li>1. katman fotomaskeyi (burada pikolitre reaktörlerinin yakalama bölgeleri) ve gofreti maske hizalayıcının içine yerleştirin ve gofreti 350-400 nm'ye maruz bırakın (vakum teması, 64 mJ/cm², t = 3 sn, I = 7 mW/cm²).</li>
	<li>SU-8'in polimerizasyonunu başlatmak için 95 °C'de bir ocak gözü üzerinde maruz kalma sonrası pişirme yapın (65 °C'de 1 dakika, 95 °C'de 1 dakika ve 65 °C'de 1 dakika). Not: Bu adımdan sonra SU-8 katmanındaki yapılar görülebilir.</li>
	<li>Gofret'i 1 dakika boyunca bir SU-8 geliştirici banyosuna yerleştirin ve gofreti birkaç saniye boyunca taze SU-8 geliştirici içeren ikinci bir kaba aktarın.</li>
	<li>SU-8 geliştiricisini çıkarmak için gofreti izopropanol içinde durulayın ve gofret döndürücünün nitrojen akışını kullanarak gofretleri kurutun.</li>
	<li>Gofretleri 150 °C'de 10 dakika sert bir şekilde pişirin.</li>
	<li>Gofret üzerine 9 μm SU-8 2010 fotorezist sıkın (2. katman) (4ml direnç dağıtın, v = 500 rpm ile 10 saniye sıkın, a = 100 rpm/sn ve v = 4.000 rpm ile 30 saniye sıkın, a = 300 rpm/sn).</li>
	<li>Fazla çözücüyü çıkarmak için SU-8'li gofreti 95 °C'de bir ocak gözüne yerleştirin (65 °C'de 15 dakika, 95 °C'de 45-60 dakika ve 65 °C'de 10 dakika). Not: kırışıklıklara ve kabarcıklara dikkat edilmelidir. Gofret 95 °C'ye kadar ısıtılırsa, buharlaşan çözücü küçük gaz kabarcıkları içinde kapsüllenebilir.</li>
	<li>İstenilen düzende fotoğraf maskesini (burada besin temini için ana kanallar) ve gofreti maske hizalayıcısına yerleştirin ve 350-400 nm'ye maruz bırakın (sert temas, 64 mJ/cm², t = 10 sn, I = 7 mW/cm²)</li>
	<li>SU-8'in polimerizasyonunu sonlandırmak için 95 °C'de bir ocak gözü üzerinde maruz kalma sonrası pişirme yapın (65 °C'de 5 dakika, 95 °C'de 3:30 dakika, 65 °C'de 3 dakika). Not: Bu adımdan sonra SU-8 katmanındaki yapılar görülebilir.</li>
	<li>Gofreti 45 saniye boyunca bir SU-8 geliştirici banyosuna yerleştirin, gofreti taze SU-8 geliştirici içeren ikinci bir kaba aktarın ve 60 saniye boyunca geliştirin.</li>
	<li>Herhangi bir SU-8 geliştirici kalıntısını gidermek için gofreti 20 saniye izopropanol ile durulayın ve gofreti basınçlı nitrojen kullanarak kurutun.</li>
	<li>Son olarak, gofreti 150 °C'de sert bir şekilde pişirin. Sonuç olarak, PDMS kalıplama için ana kalıp olarak kullanılacak olan nihai gofret (Şekil 1C) elde edilir.</li>
	<li>SU-3 yapı yüksekliklerini doğrulamak için profilometre ölçümleri yapın (Şekil 8C). Not: Yapı yüksekliğindeki yanlışlıklar, yetiştirme sırasında verimsiz hücre tuzağına veya hücre kaybına neden olabilir.</li>
</ol>
2. Polidimetilsiloksan Çip İmalatı
Not: Toz parçacıklarının üretim prosedürüne müdahale etmesini önlemek için aşağıdaki tüm adımlar ideal olarak laminer akış koşulları altında gerçekleştirilmelidir (Şekil 4'te bir proses akış şeması gösterilmiştir).
<ol>
	<li>10:1 oranında polidimetilsiloksan (PDMS) bazı ve kürleme maddesi karışımı hazırlayın. Opak görünen homojen bir çözelti elde edilene kadar dikkatlice karıştırın. İstenilen katman yüksekliği için gerektiği kadar hazırlayın (burada 3 mm).</li>
	<li>PDMS karışımını, tüm kabarcıklar kaybolana kadar hafif vakum altında yaklaşık 30 dakika boyunca gazdan arındırın.</li>
	<li>Kalıplama cihazını (veya Petri kabını) uygun SU-8 gofret ile hazırlayın ve PDMS karışımını içine dökün (Şekil 1D).</li>
	<li>PDMS'yi fırında 80 °C'de 3 saat pişirin.</li>
	<li>PDMS levhasını gofretten dikkatlice soyun. Temiz ve keskin bir neşter kullanarak levhayı tek talaşlar halinde kesin.</li>
	<li>Cipsleri 90 dakika boyunca bir n-pentan banyosunda yıkayın, ardından iki aseton yıkama banyosu yapın (her biri 90 dakika). Herhangi bir solvent kalıntısını gidermek için cipsleri gece boyunca kurutun. Dikkat: PDMS yıkamasını çeker ocak altında gerçekleştirin. Not: N-pentan yıkama sırasında, monomerler ve dimerler kürlenmiş PDMS'den çıkarılır ve yıkama işlemi sırasında talaş boyutu geçici olarak iki katına çıkabilir.</li>
	<li>Mikroakışkan PDMS çiplerini son deneye kadar kapalı kaplarda saklayın.</li>
	<li>Deneyden hemen önce, boruları PDMS çipine bağlamak için kullanılan konektörlerden biraz daha küçük çaplı bir iğne (veya delgeç) kullanarak giriş ve çıkış deliklerini PDMS çipine delin</li>.
	<li>Mikroakışkan PDMS çipini izopropanol ile dikkatlice temizleyin ve yapılandırılmış PDMS tarafına yapışabilecek toz parçacıklarını çıkarmak için bant kullanın. Çip üzerinde hiçbir parçacık görülmeyene kadar bantı birkaç kez kullanın.</li>
	<li>170 μm inceliğinde bir cam slaytı aseton ve izopropanol ile art arda temizleyin. Son olarak deiyonize su ile temizleyin ve basınçlı nitrojen ile kurulayın.</li>
	<li>Plazma aktivasyonundan önce, plazma temizleyiciyi ısıtın ve plazmayı yaklaşık 300 saniye çalıştırın. Plazma oksitlenmiş cam sürgü ve PDMS çipi (Güç 50 W, Zaman = 25 sn, oksijen akış hızı = 20 sccm).</li>
	<li>Yapıştırmadan önce PDMS'yi ve cam çipi hizalayın. Son olarak, PDMS çipini dikkatli bir şekilde cam sürgünün üzerine yerleştirin (Şekil 1E). PDMS ve cam saniyeler içinde yapışacaktır. Not: Yapıştırma işlemi sırasında PDMS çipinin üstüne cımbızla itmeyin. Bu, kanalların ve küçük yapıların çatısının çökmesine neden olabilir.</li>
	<li>Bağı güçlendirmek için, son PDMS cam yongasını 80 °C'de 10 saniye pişirin.</li>
</ol>
3. Bakteri Kültürünün Hazırlanması
Not: Tüm yetiştiricilikler, yetiştirme sırasında müdahale edebilecek istenmeyen parçacıkların birikmesini önlemek için steril filtrelenmiş ortamda hazırlanmalıdır.
<ol>
	<li>İstenen organizmaları içeren bir agar plakası kullanın (burada, C. glutamicum ATCC 13032) ve bir koloniyi 20 ml taze BHI ortamına aşılayın, gece boyunca (≈ 8-14 saat) 30 °C'de döner bir çalkalayıcı (120 rpm) üzerinde inkübe edin.</li>
	<li>10 μl ön kültürü, mikroakışkan kültivasyon sırasında kullanılacak olan istenen ortama (burada CGXII21) aktarın ve hücrenin döner bir çalkalayıcı (120 rpm) üzerinde 30 ° C'de gece boyunca büyümesine izin verin.</li>
	<li>İstenilen miktarda hücre süspansiyonunu (deneyin başlangıcına bağlı olarak 10-500 μl arasında) mikroakışkan hücre ekimi sırasında kullanılacak olan istenen ortama (burada CGXII21) aktarın. Not: En iyisi, tohumlama için erken logaritmik fazdaki hücreleri kullanmaktır. C. glutamicum kültürü için tohumlama için en iyi optik yoğunluk (OD600) 0.5-2 arasındaydı.</li>
	<li>1 ml bakteri kültürünü 2 ml'lik steril bir tüpe aktarın. Not: Bu, çalkalama şişesi ve mikroakışkan yetiştirme arasındaki transfer süresini en aza indirmek için mikroakışkan PDMS çipi monte edildikten hemen sonra yapılmalıdır. Tipik olarak transfer süresi yaklaşık 15 dakikadır ve oksijen sınırlaması ve sıcaklık değişikliklerinin neden olduğu metabolizma üzerindeki etkiyi önlemek için mümkün olduğunca küçük tutulmalıdır.</li>
</ol>
4. Deney Düzeneği
Not: Tüm adımlar ters çevrilmiş bir mikroskopla gerçekleştirilir.
<ol>
	<li>Sistemi ısıtmak için deneyden 2 saat önce mikroskop inkübatörünü başlatın. Not: mikroskopi, sıcaklığı ve istenirse gaz akışını kontrol etmek için tam boyutlu bir inkübatör ile donatılmalıdır. Talaş sistemi sürekli olarak ortamla infüze edildiğinden ek nem kontrolü gerekli değildir.</li>
	<li>İnkübatör sistemini açın, istediğiniz hedefi seçin ve gerekirse objektifin üzerine daldırma yağı ekleyin.</li>
	<li>Çipi çip tutucunun içine monte edin. Gerekirse, sahne çalışması sırasında herhangi bir talaş hareketini önlemek için cam plakayı yapışkan bantla sabitleyin.</li>
	<li>Numuneyi mikroskop üzerinde ortalayın ve PLBR dizilerine odaklanın.</li>
	<li>Giriş ve çıkışları uygun borularla bağlayın (Şekil 1F). Boruyu bir atık rezervuarına bağlayın. Şekil 4D'de temsili bir çip görülebilir.</li>
	<li>Şırıngaları pompalara yerleştirin ve ortam akışını başlatın. Orta, tampon veya gerekirse kaplama solüsyonu kullanın ve mikroakışkan kanalları yaklaşık 1 saat durulayın. Not: Kaplama solüsyonu, spesifik olmayan hücre yapışmasını önlemek için kanal duvarlarını kaplamak için kullanılır.</li>
	<li>E. coli için, kanal duvarlarını kaplamak için% 0.1 BSA çözeltisi kullanılır. C. glutamicum için herhangi bir kaplamaya gerek yoktur. Kaplama işleminden sonra, hücre tohumlamadan önce çipi orta ile yıkayın.</li>
	<li>Hücre tohumlama ve yetiştirmeden önce, sızıntı olmadığını ve sıcaklığın sabit olduğunu kontrol edin.</li>
</ol>
5. Bakteri Hücrelerinin Mikroakışkan Cihaza Tohumlanması
<ol>
	<li>İstenen bakteri çözeltilerinin boruya bağlı uygun şırıngalarda mevcut olduğundan emin olun.</li>
	<li>Tamponu veya kaplama çözeltisini ayırın ve hücre süspansiyonunu çipe bağlayın. Ölüm hacmini, istenmeyen hava kabarcıklarını en aza indirmek ve deney süresini azaltmak için, sadece şırıngalar yerine tüm iğneyi ve hortumu değiştirin.</li>
	<li>PLBR'lerin çoğu istenen miktarda hücre ile dolana kadar hücre süspansiyonunu 200 nl/dk'lık hacimsel akış hızında kanallara infüze edin (Şekil 5A). Not: optimum tohumlama sonuçları, bakteri suşuna, OD600'e ve ön kültürün büyüme ortamına bağlıdır. Bu parametrelerin, reaktör yapılarında yeterli sayıda hücre sıkışana kadar yakalama verimliliğini ve süresini artırmak için uyarlanması gerekir. C. glutamicum için tipik olarak OD600 0.5-2'lik bir hücre süspansiyonu kullanıldı; E. coli için OD600 0.5-1 arasındaydı.</li>
	<li>Yalnızca az sayıda PLBR doldurulursa, akış hızını 800-1.200 nl/dk'ya yükseltin.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunu ayırın ve büyüme ortamını çipe bağlayın (Şekil 5B). Orta değişim sırasında hava kabarcığı oluşmadığından emin olun. 100 nl/dk'da taze büyüme ortamı ile perfüz.</li>
</ol>
6. Hızlandırılmış Görüntüleme
<ol>
	<li>Zaman atlamalı görüntüleme için belirli PLBR'leri seçin. Tipik olarak, bir deneyin başında tek bir ana hücre içeren PLBR'ler seçilir. Bir deneyde araştırılabilecek ilgi bölgelerinin sayısı, istenen kare hızına ve mikroskobik kuruluma bağlıdır.</li>
	<li>PLBR sayısına bağlı olarak uygun bir kare hızı seçin. Mikroskobun zaman atlamalı aralıkta istenen miktarda ROI'yi işleyebildiğinden emin olun.</li>
	<li>Uygun filtre setlerini seçin (burada YFP). Kromofor ağarmasını önlemek için sahne hareketi sırasında ve her zaman atlamalı ölçümden sonra deklanşörü otomatik olarak kapatın.</li>
	<li>Hızlandırılmış mikroskopi dizisini yapılandırın ve deneyi başlatın.</li>
	<li>Tüm PLBR'ler aşırı büyüdükten sonra, deney durdurulabilir, mikroakışkan PDMS çipi atılabilir ve deney değerlendirilebilir.</li>
</ol>
7. Analiz
Not: Prosedürün aşağıdaki adımları veya bölümleri manuel olarak veya ImageJ vb. gibi görüntü analiz programları tarafından gerçekleştirilebilir.
<ol>
	<li>Yetiştiriciliğin istenen tüm kriterleri karşıladığı ilgili PLBR'leri belirleyin, örneğin ana hücre sayısı, ana hücrelerin konumu vb.</li>
	<li>Bir mikrokoloninin büyüme hızını belirlemek için, her zaman dilimindeki hücre sayısını sayın.</li>
	<li>Zamanı ve ln'yi (hücre sayısı) çizerek maksimum büyüme oranını hesaplayın. Grafiğin eğimi [1/saat]'teki büyüme oranını temsil eder (bkz. Şekil 6).</li>
	<li>Floresan veri analizi büyük ölçüde gerçekleştirilen deneye bağlıdır. Bu raporda, farklı izojenik mikrokoloniler arasındaki koloniden koloniye ve hücreden hücreye heterojenliği göstermek için bir örnek seçilmiştir (bkz. Şekil 7).</li>
</ol>

<ol><li>Muzzey, D., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Time-Lapse+Fluorescence+Microscopy+in+Single+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Single Cells.</a> Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 25, 301-327 (2009).</li>
<li>Wei, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+virulence+proteins+as+tools+to+rewire+kinase+pathways+in+yeast+and+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bacterial virulence proteins as tools to rewire kinase pathways in yeast and immune cells.</a> Nature. 488, 384-388 (2012).</li>
<li>Park, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+topology+on+bacterial+social+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Influence of topology on bacterial social interaction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 13910-13915 (1073).</li>
<li>Lee, P. J., Helman, N. C., Lim, W. A., Hung, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+system+for+dynamic+yeast+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">A microfluidic system for dynamic yeast cell imaging.</a> BioTechniques. 44, 91-95 (2008).</li>
<li>Kobel, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+analysis+of+single+stem+cells+in+microfluidic+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Automated analysis of single stem cells in microfluidic traps.</a> Lab Chip. 12, 2843-2849 (2012).</li>
<li>Carlo, D. D., Wu, L. Y., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+single+cell+culture+array%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Dynamic single cell culture array.</a> Lab Chip. 6, 1445-1449 (2006).</li>
<li>Locke, J. C. W., Young, J. W., Fontes, M., Jimenez, M. J. H., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+Pulse+Regulation+in+Bacterial+Stress+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stochastic Pulse Regulation in Bacterial Stress Response.</a> Science. 334, 366-369 (2011).</li>
<li>Boedicker, J. Q., Li, L., Kline, T. R., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+bacteria+and+determining+their+susceptibility+to+antibiotics+by+stochastic+confinement+in+nanoliter+droplets+using+plug-based+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Detecting bacteria and determining their susceptibility to antibiotics by stochastic confinement in nanoliter droplets using plug-based microfluidics.</a> Lab Chip. 8, 1265-1272 (2008).</li>
<li>Fritzsch, F. S. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Picoliter+nDEP+traps+enable+time-resolved+contactless+single+bacterial+cell+analysis+in+controlled+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Picoliter nDEP traps enable time-resolved contactless single bacterial cell analysis in controlled microenvironments.</a> Lab Chip. 13, 397-408 (2013).</li>
<li>Groisman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+chemostat+for+experiments+with+bacterial+and+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic chemostat for experiments with bacterial and yeast cells.</a> Nat. Methods. 2, 685-689 (2005).</li>
<li>Mather, W., Mondragon-Palomino, O., Danino, T., Hasty, J., Tsimring, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streaming+Instability+in+Growing+Cell+Populations%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Streaming Instability in Growing Cell Populations.</a> Phys. Rev. Lett. 104, (2010).</li>
<li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+growth+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Robust growth of Escherichia coli.</a> Curr. Biol. 20, 1099-1103 (2010).</li>
<li>Grunberger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+disposable+picolitre+bioreactor+for+cultivation+and+investigation+of+industrially+relevant+bacteria+on+the+single+cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A disposable picolitre bioreactor for cultivation and investigation of industrially relevant bacteria on the single cell level.</a> Lab Chip. 12, 2060-2068 (2012).</li>
<li>Walden, M., Elf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+transcriptional+interactions+in+single+cells+at+sufficient+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Studying transcriptional interactions in single cells at sufficient resolution.</a> Curr. Opin. Biotech. 22, 81-86 (2011).</li>
<li>Keymer, J. E., Galajda, P., Lambert, G., Liao, D., Austin, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computation+of+mutual+fitness+by+competing+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Computation of mutual fitness by competing bacteria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20269-20273 (2008).</li>
<li>Keymer, J. E., Galajda, P., Muldoon, C., Park, S., Austin, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+metapopulations+in+nanofabricated+landscapes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Bacterial metapopulations in nanofabricated landscapes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 17290-17295 (2006).</li>
<li>Grunberger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+growth+rate+0.6%3A+Corynebacterium+glutamicum+cultivated+in+highly+diluted+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Beyond growth rate 0.6: Corynebacterium glutamicum cultivated in highly diluted environments.</a> Biotechnol. Bioeng. 110, 220-228 (2013).</li>
<li>Binder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+approach+to+identify+genomic+variants+of+bacterial+metabolite+producers+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">A high-throughput approach to identify genomic variants of bacterial metabolite producers at the single-cell level.</a> Genome Biol. 13, (2012).</li>
<li>Mustafi, N., Grunberger, A., Kohlheyer, D., Bott, M., Frunzke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+application+of+a+single-cell+biosensor+for+the+detection+of+L-methionine+and+branched-chain+amino+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Metab.+Eng%22%5BJournal%5D)">The development and application of a single-cell biosensor for the detection of L-methionine and branched-chain amino acids.</a> Metab. Eng. 14, 449-457 (2012).</li>
<li>Huber, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robo-Lector+-+a+novel+platform+for+automated+high-throughput+cultivations+in+microtiter+plates+with+high+information+content%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Robo-Lector - a novel platform for automated high-throughput cultivations in microtiter plates with high information content.</a> Microb. Cell Fact. 8, (2009).</li>
<li>Keilhauer, C., Eggeling, L., Sahm, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoleucine+synthesis+in+Corynebacterium+glutamicum%3A+molecular+analysis+of+the+ilvB-ilvN-ilvC+operon%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Isoleucine synthesis in Corynebacterium glutamicum: molecular analysis of the ilvB-ilvN-ilvC operon.</a> J. Bacteriol. 175, 5595-5603 (1993).</li>
<li>Frunzke, J., Bramkamp, M., Schweitzer, J. E., Bott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+Heterogeneity+in+Corynebacterium+glutamicum+ATCC+13032+caused+by+prophage+CGP3%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Population Heterogeneity in Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 caused by prophage CGP3.</a> J. Bacteriol. 190, 5111-5119 (2008).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Bakterilerin tek hücreli analizi için birkaç (PLBR) içeren bir mikroakışkan PDMS cihazının imalatını, deney kurulumunu ve ilgili çalışma prosedürlerini açıkladık.
Yumuşak litografi tekniklerini kullanan mikrofabrikasyon, çeşitli boyutlar ve bakteri morfolojileri için cihaz boyutlarının hızlı bir şekilde ayarlanmasına olanak tanır. Şu anda pikolitre biyoreaktörünü farklı mikrobiyal organizmaların yetiştirilmesi ve yetiştirme verimi ile ilgili olarak optimize ediyoruz. Yakalama verimliliğini artırmak için reaktör geometrisi de optimize edilmektedir. Şekil 8 , şu anda doğrulanmış olan dört yeni PLBR cihazını göstermektedir. Tüm şekillerde tohumlama kanalı genişlik ve şekil açısından yeniden tasarlandı. Uygulamada, bunun sıkışan hücre sayısı üzerinde bir etkisi var gibi görünüyor, ancak daha fazla araştırmaya ihtiyaç var. Reaktör boyunca daha yüksek konveksiyonel akışa ve daha fazla hücrenin sıkışmasına yol açan ek taşma kanallarının dahil edilmesiyle yakalama verimliliğine ilişkin önemli iyileştirmeler de sağlandı. Bununla birlikte, aynı zamanda, yetiştirme sırasında hücrelerin yıkanması riskini de artırır.
Cihaz, tek hücre düzeyinde büyüme ve üretim süreçlerini araştırmak için onlarca yıldır kullanılan makro ölçekli ekimlere ilginç bir alternatiftir. Bununla birlikte, bazı önemli gereksinimleri vardır: Birkaç pikolitre biyoreaktörünün paralel izlenmesi için, odak kayması kompanzasyonu ile yüksek çözünürlüklü ve tam motorlu mikroskobik kurulum zorunludur. Ek olarak, ölçümler boyunca istenen yetiştirme sıcaklığını sabit tutmak için bir inkübasyon sistemine ihtiyaç vardır.
Cihaz imalatında %95 başarı oranı elde ediyoruz. Ana sorunlar, verimsiz PDMS-cam yapıştırma, PDMS çatı çökmesi veya sıvı sızıntısı ile ilgilidir (en çok ortaya çıkan sorunların giderilmesi için Tablo 1'e bakın). Deneysel çalışma kısmen steril olmayan koşullar altında yapılsa da, kapalı akışkan sistem nedeniyle deneyler sırasında nadiren kontaminasyon görüyoruz. PDMS mikroakışkan cihazları optik olarak şeffaftır, bu nedenle yüksek çözünürlüklü in vivo görüntüleme için kullanılabilir. PDMS uygulama için mükemmel gibi görünse de, hidrofobik moleküller için yüksek bir afiniteye sahiptir ve bu da tüm hücre biyokatalitik işlemlerinde yaygın olarak kullanılan çözücülerin kullanımını sınırlı hale getirir. Bununla birlikte, protokolü bu tür uygulamalara uyarlamak için uygun kaplamalar mevcuttur.
Önerilen PLBR, çeşitli bakteri türlerinin hücresel ve hatta hücre altı olaylarının uzay-zamansal analizi için çok uygundur. Mevcut yaklaşımın önemli bir avantajı, geleneksel yöntemlerin aksine mikrokoloni büyümesini doğrudan ölçme yeteneğinde yatmaktadır. Ayrıca PLBR, tanımlanmış ve sabit koşullar altında kültürlemeye izin verir. Sistem, az miktarda reaktif veya malzemenin kullanımını kolaylaştırdığından, ucuz, özelleştirilebilir ve yüksek verime uygun olma avantajlarını taşır. Geleneksel yöntemlerde, mikrobiyal yetiştirme analiz edilirken tüm popülasyonun ortalama değerleri dikkate alınır. Ayrıca, mevcut yöntemler, numunelerin bozulmasına ve dolayısıyla ölçümde hatalara yol açabilecek manuel numune almaya ihtiyaç duyar. PLBR, mikrobiyolojide biyoproses geliştirme ve popülasyon heterojenlik analizi için yeni bakış açıları sunar. PLBR, biyoproses geliştirme içindeki çeşitli uygulamalar için umut verici bir araçtır ve hücreden hücreye heterojenliğin analizi, hücre soyları içindeki spesifik hücre kümelerinin analizi, mikrobiyal üretim suşlarının taranması ve hücre fenotiplerinin gerçek zamanlı araştırılması gibi çeşitli araştırma alanlarında uygulanabilir.

Hızlandırılmış mikroskopi, canlı hücreleri in vivo1 incelemek için güçlü bir araçtır. Bu arada, termal olarak indüklenen odak kayma telafisi de dahil olmak üzere ticari olarak temin edilebilen tam otomatik mikroskopi platformları, kanser ve nöron hücresi araştırmalarından doku mühendisliği ve tek maya veya bakteri hücreleri2-6 ile dinamik çalışmalara kadar zamana bağlı olayları incelemek için biyolojik araştırmalarda yaygın olarak uygulanmaktadır.
Hızlandırılmış görüntüleme sırasında hücre kültürü ortamları sağlamak için tipik olarak şeffaf kuyu plakaları, agar-pedler veya basitçe mikroskopi slaytları uygulanır7. Bazı araştırmalar için uygun olsa da, bu basit sistemler çevresel koşullar üzerinde çok sınırlı kontrole sahiptir ve daha karmaşık bozulmalara veya iyi tanımlanmış ve hızlı ortam değişikliklerine izin vermez. Seri üretimle üretilen tek kullanımlık mikroakışkan çip cihazları son zamanlarda piyasaya sürülmüştür, ancak çoğunlukla daha büyük ökaryotik hücre tiplerine göre uyarlanmıştır4. Büyüme takip edilebilse de, örneğin kesin hücre yakalama, koloni boyutu, büyüme yönü ve hücre çıkarma yeteneği ile ilgili iyi tanımlanmış büyüme araştırmaları sınırlıdır. Bakteri hücrelerinin 3 boyutlu ortamlarda kültürlendiği mikroakışkan habitatlar ve reaktörlergeliştirilmiştir 8-10, tek hücre düzeyinde kantitatif çalışmalarla uğraşırken dezavantajlara sahiptir. Genel popülasyon heterojenliği analiz edilebilirken, büyüme tek katmanlarla sınırlı olmadığı için birçok hücre parametresi tek hücre çözünürlüğü ile doğru bir şekilde belirlenemez.
Bu sınırlama, hücrelerin iyi tanımlanmış kanallarda ve habitatlarda yetiştirilmesini sağlayan mikro sistemlerin gelişimini tetikledi ve hücreler, tek hücre çözünürlüğü ve özellikle ortam arzı ve çevre koşulları üzerinde sıkı kontrol ile düz tek tabakalar halinde büyüyor6,11,12. Bakteri hücrelerinin yetiştirilmesi için birkaç mikroakışkan sistem örneği gösterilmiştir12-14. Bakteriler tipik olarak çok hızlı büyüme oranları sergilerler ve özellikle mikroskopi için hücre tek katmanları istendiğinde, birkaç mikrometre ve altında mikroakışkan yapılara ihtiyaç duyarlar. Keymer ve ark. mikrofabrikasyon arazilerde E. coli suşlarının büyümesini ve yayılmasını gösterdi15,16. Popülasyon dinamikleriyle ilgilendikleri için tek hücreli çözünürlükle araştırma yapmadılar.
Tek hücre düzeyinde büyüme17 ve floresan bağlantılı verimlilik analizi gibi çeşitli biyoteknolojik performans göstergelerini araştırmak için şu anda uygulanan pikolitre biyoreaktörü (PLBR)18,19 geliştirdik. Mevcut mikroakışkan cihaz, yaklaşık bir pikolitrelik tanımlanmış bir kültür hacminde çevresel reaktör kontrolüne ve aynı anda sürekli tek hücreli gözleme izin verir. Bir veya iki tarafın medya besleme kanalına açık olduğu açık tek katmanlı kutu sistemleri11,14 ile karşılaştırıldığında, PLBR kontrollü yakalama ve kültürlemeye izin verir. Tasarım, birkaç bitişik koloninin büyük bir popülasyon oluşturma riski olmadan uzun süreli bakteri yetiştiriciliğine izin verir. Ayrıca sistem, bakteri büyümesini hücre tek katmanlarıyla sınırlamak için 1 μm yüksekliğinde (hücre çapı sırasına göre) yetiştirme bölgelerini içerir. Buna karşılık, hidrolik direnci en aza indirmek için besleme kanalları 10 kat daha derindir.
Minyatür toplu yetiştirme sistemleriyle20 karşılaştırıldığında, mevcut sistem, sürekli ortam akışı nedeniyle sabit çevresel parametrelerle ekime izin verir. Ayrıca, ortam bileşimi, sıcaklık, akış hızları ve gaz değişimi gibi çevresel parametreler saniyeler içinde kolayca kontrol edilebilir ve değiştirilebilir. Bu, örneğin besin mevcudiyeti veya stres uyaranları ile ilgili çevresel değişikliklere hücresel tepkinin spesifik araştırmalarına izin verir. Sadece birkaç mikrolitre aralığında olan azaltılmış ortam hacimlerine olan talep, araştırmacıların, örneğin bu spesifik çevresel koşullar altında hücre tepkisini çözen büyük ölçekli deneylerin süpernatantı ile hızlandırılmış görüntüleme sırasında hücrelerin bozulması gibi yeni çalışmalar yapmalarını sağlar17. Pikolitre biyoreaktör, araştırmacılara biyofiziksel koşulları sıkı bir şekilde kontrol eden ve hızlandırılmış görüntüleme için yüksek hassasiyetli şırınga pompaları ve otomatik parlak alan ve floresan mikroskobu kullanılarak çalıştırılan sağlam bir sistem sağlar. Burada, cihaz tasarımı, üretimi ve örnek uygulamalar dahil olmak üzere eksiksiz bir protokolü rapor ediyoruz.

<table><tbody><tr><td>Silikon gofret 100 mm çapında, P/BOR < 100></td><td>Si-MAT, Silikon Malzemeler, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photoresist SU-8 2000.5</td><td>Micro Resist Technology GmbH, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photoresist SU-8 2010</td><td>Micro Resist Technology GmbH, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 Geliştirici mr DEV- 600</td><td>Micro Resist Technology GmbH, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polidimetilsiloksan (PDMS) Sylgard 184 Silikon Elastomer Kiti</td><td>Dow Corning; Farnell GmbH, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dağıtım iğneleri Hassas uçlar&nbsp; 27 g; İç çap = 0,2 mm, dış çap = 0,42 mm</td><td>Nordson EFD Deutschland, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cam plakalar D263 T eco, 30 mm x 25 mm x 0,17 mm</td><td>Schott AG, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Delgeç AKA 5130-B-90</td><td>Harris Tek Damarlı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Boru Tygon S-54-HL, ID = 0,25 mm, OD = 0,76 mm</td><td>Saint Gobain; VWR International GmbH, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tek Kullanımlık Şırıngalar &ndash; Omnifix Spritzen BRAUN Omnifix 40 Duo, 1 ml</td><td>B. Braun Melsungen AG, Almanya</td><td>552-183143</td><td></td></tr><tr><td>Şırıngalar, 1 ml steril cam şırıngalar</td><td>YENİLİKÇİ LABOR SYSTEME GMBH (ILS), Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Chemicals</td></tr><tr><td>(NH4)2SO4</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&boğa; 7H2O</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FeSO4&bull; 7H2O</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MnSO4&bull; H2O</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZnSO4&bull; 7H2O</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CuSO4</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NiCl2&bull; 6H2O</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prokatechuic asit</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glikoz-Monohidrat</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BHI</td><td>Becton, Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td>CellsCorynebacterium glutamicum ATTC 13032</td><td>DSMZ; Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli MG 1655</td><td>DSMZ; Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Ekipman</td></tr><tr><td>Gofret Temizleyici SSEC 3300</td><td>Katı Hal Ekipmanları LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spin Kaplayıcı SPIN150 -NPP</td><td>SPS Europe B.V.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maske Hizalayıcı MA-6</td><td>Karl Suess</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sıcak Plaka HP30A - 2</td><td>Torrey Pines Bilimsel Laboratuvar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>fırını Memmert UN 200</td><td>Memmert</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plazma Temizleyici FEMTO</td><td>Diener Elektronik, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>neMESYS şırınga pompaları</td><td>Cetoni GmbH, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Manyetik karıştırıcı CB 162</td><td>Stuart</td><td>VWR 442-0304</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Nikon Eclipse Ti</td><td>Nikon Mikroskopi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop inkübüatörü</td><td>Pecon GmbH, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj minispin plus " siyah çizgi"</td><td>Eppendorf</td><td>9776501</td><td></td></tr><tr><td>Fotometre Biyofotometre plus&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>6132000008</td><td></td></tr><tr><td>Çalkalayıcı şişeleyici/inkübatör 3031</td><td>GFL - Gesellschaft f&uuml; r Labortechnik mbH, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Profilometre, Dektak 150 Stylus Profil Oluşturucu</td><td>Veeco</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mikrobiyal tek hücreli analiz için mikroakışkan pikolitre biyoreaktör: fabrikasyon, sistem kurulumu ve Çalışması

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

Bu protokolde, yakın zamanda piyasaya sürülen mikroakışkan pikolitre biyoreaktörün (PLBR) üretimi, deney kurulumu ve temel çalışması ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. PLBR, hücre büyümesi, morfoloji, stres tepkisi ve tek hücre düzeyinde metabolit veya protein üretimi gibi biyoteknolojik ve mikrobiyolojik ile ilgili soruları araştırmak için tek bakteri ve mikro kolonilerin analizi için kullanılabilir. Cihaz, pertürbasyon çalışmaları için sabit çevresel koşulları mümkün kılan sürekli ortam akışına sahiptir, ancak buna ek olarak, istenen herhangi bir çevresel durumu taklit etmek için hızlı ortam değişikliklerine ve salınım koşullarına izin verir. Tek kullanımlık cihazları imal etmek için, mikrometre altı boyutlu SU-8 yapıları içeren bir silikon gofret, hızlı polidimetilsiloksan dökümü için çoğaltma kalıbı görevi gördü. Çipler kesildi, birleştirildi, bağlandı ve uzaysal-zamansal hücre analizi için güçlü bir araç olan hızlandırılmış görüntüleme için uygun yüksek çözünürlüklü ve tam otomatik bir mikroskop üzerine kuruldu. Burada, biyoteknolojik platform organizması Corynebacterium glutamicum PLBR'ye tohumlandı ve hücre büyümesi ve hücre içi floresan birkaç saat boyunca takip edildi ve akış sitometrisi gibi geleneksel analiz yöntemleriyle mümkün olmayan, tek hücre düzeyinde zamana bağlı popülasyon heterojenliğini çözdü. Cihaz imalatına ilişkin içgörülerin yanı sıra, ön kültürün hazırlanması, bakterilerin yüklenmesi, yakalanması ve tek hücrelerin ve kolonilerin PLBR yetiştiriciliği de gösterilmiştir. Bu cihazlar, sıkı çevresel kontrol altında tek bir bakterinin zamana bağlı fenomenlerini analiz etmek için mikrobiyolojik araştırmalara yeni bir boyut katacaktır. Basit ve nispeten kısa üretim süreci sayesinde, teknoloji herhangi bir mikroakışkan laboratuvarında kolayca uyarlanabilir ve özel ihtiyaçlara göre basit bir şekilde uyarlanabilir.

Cihaz Fabrikasyonu
Mikroakışkan PLBR sistemi, yüksek çözünürlüklü mikroskopiye uygun ince bir cam çip üzerine bağlanmış bir katman PDMS ile üretilir. Üretim iki ana aşamadan oluşur: ilk olarak replikasyon kalıbının üretimi (Şekil 1A, 1B ve 1C) ve ikinci olarak çip üretimi (Şekil 1D, 1E ve 1F). Protokole göre, ana kalıbı oluşturmak için standart fotolitografik mikroüretim teknikleri kullanılır. Temiz oda tesisi bulunmayan laboratuvarlar, ticari olarak mevcut özelleştirilmiş SU-8 ana kalıplar edinebilirler. Tekrarlayan PDMS kalıplama yöntemi kullanılarak (Şekil 1A, 1B ve 1C) yüzlerce tek kullanımlık çip üretilebilir. PDMS kalıplama ve çip montajı herhangi bir laboratuvarda yapılabilir ve temiz oda tesisleri gerektirmez; ancak laminer hava akışlı çalışma alanları tercih edilir.
Süreç, mikroakışkan çip sisteminin tasarımıyla başlar. Mikroakışkan çipi tasarlamak için tipik olarak CAD yazılımı kullanılır (Şekil 1A). CAD işleminden sonra, altmikron çözünürlüğe sahip bir e—beam yazıcı ile bir maske oluşturulur (Şekil 1B). Bu çalışmada, SU-8 gofret litografisi için kullanılan 5 in krom maske oluşturulmuştur. Nihai silikon—SU—8 gofreti, PDMS kalıplama için kullanılır (Şekil 1D). Bir pişirme adımının ardından, PDMS blok cam slaytlar üzerine geri dönüşümsüz olarak bağlanacak şekilde çipler halinde kesilir (Şekil 1E). Son olarak, borular bağlanır (Şekil 1F).
Şekil 2, mikroakışkan sistemin tasarımını detaylı olarak göstermektedir. Sistem, iki ekim girişinden, farklı substratların veya ortamların karıştırılması için bir gradyan oluşturucudan ve bir çıkıştan oluşmaktadır. Ana kanalların boyutları 50 µm x 10 µm'dir (G x Y). Her cihaz, her biri 5 PLBR içeren altı PLBR dizisinden oluşur. Bu durum, tek bir mikroakışkan cihaz içerisinde 30 paralelleştirilmiş reaktör ile sonuçlanır.
Şekil 3, replikasyon ana kalıbının üretimini göstermektedir. Protokolde ayrıntılı olarak açıklandığı üzere, ilk SU-8 katmanı SU-8 litografisi ile hazırlanır (Şekil 3A). İkinci katman için de benzer bir prosedür uygulanır (Şekil 3B). Kanal geometrisini kontrol etmek için bir profilometre kullanarak PLBR'lerin ve ana kanalların yüksekliğini inceledik. Şekil 3C'de gösterilen örnekte, ilk katman (kültürleme katmanı) ölçülmüştür. Burada katman, BHI besiyerinde C. glutamicum kültürü için uygun olan 1.200 nm'lik tutarlı bir yükseklik sergilemektedir.
Şekil 4, PDMS karıştırma (Şekil 4A) ile başlayan, ardından kalıplama işlemini (Şekil 4B) ve son olarak yapıştırma adımını (Şekil 4C) takip eden PDMS kalıplama prosedürünü göstermektedir. Şekil 4D, 170 µm kalınlığındaki cam plakayı, giriş ve çıkışları olan PDMS çipi (3 mm yükseklikte) ve tüplere bağlı çelik iğneleri içeren nihai mikroakışkan çipi göstermektedir. Deneyden sonra çip atılabilir ve kapsamlı bir temizlik gerekmez. Ayrıca, montajı ve kullanımı kolaydır. Karmaşık ve zor bir doldurma prosedürüne ihtiyaç yoktur.
Cihaz Prensibi
Şekil 5, reaktör sisteminin çalışma prensibini göstermektedir. Hücreler mikroakışkan cihaza infüze edilir ve tekil hücreler, sadece hücre duvarı etkileşimleri sayesinde PLBR içinde hapsolmuş olarak kalır. Kanal ve PLBR arasındaki hidrodinamik direnç farkı nedeniyle, PLBR içinde yalnızca minimum akış gerçekleşir. PLBR ekiminden sonra (Şekil 5A), bakteri çözeltisinden büyüme ortamına geçişle birlikte büyüme ve gözlem aşaması başlatılır (Şekil 5B). PLBR'ler aşırı büyüdükten sonra (Şekil 5C) deney tipik olarak durdurulur ve zaman atlamalı görüntüler analiz edilebilir. PLBR içindeki tutma mekanizmaları ve akış profili hakkında daha fazla detay için okuyucunun Grünberger et al.13  çalışmasına başvurması önerilir.
Büyüme Hızı Analizi
Mevcut sistem; büyüme, morfoloji veya floresan sinyali gibi farklı biyolojik parametreler açısından çeşitli bakteri türlerini incelemek için uygulanabilir. İlk örnekte, endüstriyel açıdan ilgili bir üretim organizması olan C. glutamicum, standart kültür koşulları altında (T=30 °C, CGXII besiyeri21) kültüre edilmiştir. Şekil 6A, üç izojenik mikrokoloniden elde edilen büyüme eğrilerini göstermektedir. Eksponansiyel büyüme, PLBR'ler dolana kadar devam etmektedir; bu durum herhangi bir besin kısıtlamasının oluşmadığını göstermektedir. Şekil 6B, büyümekte olan bir C. glutamicum kolonisine ait dört DIC zaman aşımı mikroskopi görüntüsünü sergilemektedir.
Floresans Analizi
Tek hücreli floresan mikroskobisinde araştırmacılar, ilgilenilen belirli bir fenotipi ölçülebilir bir çıktıya (floresan sinyali) bağlamak için sıklıkla GFP veya türevleri gibi spesifik floresan proteinlerden yararlanırlar. PBLR'nin floresan tabanlı zaman serimli çalışmalara uygulanabilirliğini göstermek için, Ptac promotörü kontrolü altında plazmid kodlu bir YFP-TetR füzyon proteini üreten bir C. glutamicum suşunun (pEKEx2-yfp-tetR)18,22 floresan emisyonunu inceledik. Düşük indükleyici (IPTG) konsantrasyonlarının varlığında, Ptac üzerinden ekspresyonun izojenik bakteriyel popülasyonlarda hücreler arası belirgin varyasyona yol açtığı bilinmektedir. Tek bir ön kültürden başlanarak, birkaç izojenik mikrokoloninin büyümesi ve tek hücre floresansı takip edildi. Şekil 7'de görülebileceği üzere, farklı mikrokoloniler arasında fenotipik heterojenlik ve tek bir ana hücreden başlayan koloniler içinde tek hücre düzeyinde heterojenlik gözlemledik. Bir koloni (Şekil 7B, PLBR 1) neredeyse hiç floresan emisyonu göstermezken, PLBR 2 hücreleri Ptac promotöründen kaynaklanan bazal yfp-tetR ekspresyonu nedeniyle düşük bir floresan emisyonu sergiledi. PLBR 3'te floresan emisyonu diğer kolonilere kıyasla oldukça güçlüydü ve popülasyonun geniş bir dağılımı gözlemlendi. Bu örnek, PBLR'nin zaman serimli floresan mikroskopi çalışmaları için uygulanabilirliğini kanıtlamaktadır. Tek hücrelerin floresanının tek bir zaman noktasında belirlenebildiği akış sitometrisi ile karşılaştırıldığında, mevcut sistem hücrelerin takibine ve tek hücre floresanının birçok nesil boyunca gerçek zamanlı olarak incelenmesine olanak tanır.
<img alt="Tasarım, maske, wafer, kalıplama, bağlama ve montaj aşamalarını içeren mikroçip üretim süreci diyagramı." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50560/50560fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50560/50560fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Şekil 1"> 
Şekil 1. PLBR çip üretim sürecine genel bakış. Ana kalıp üretimi: (A) Tasarım, (B) Litografi maskesi üretimi ve (C) Wafer üretimi ile başlar. PDMS-cam çip üretimi: (D) PDMS kalıplama ile başlar, ardından (E) cam ve PDMS bağlama ve (F) nihai çip montajı gelir.
<img alt="Hücre ayırma ve analiz araştırmaları için etiketli akış kanallarına sahip mikroakışkan çip diyagramları." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50560/50560fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50560/50560fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Şekil 2"> 
Şekil 2. PLBR çipinin tasarımı. (A) Tüm mikroakışkan çipin CAD çizimi; (B) Seçili yerleşim konumlarının büyütmeleri: Yerleşim iki besiyeri girişi (a1), karıştırma kanallı bir gradyan oluşturucu (a2) ve 6 paralel PLBR dizisi (b1) içerir. b2, genişliği 100 µm olan bir sıvı kanalına gömülmüş bir PLBR'yi göstermektedir. PLBR'nin iç çapı 40 µm ve besiyeri kanallarının genişliği 2 µm'dir. Ekim girişinin uzunluğu 40 µm'dir. Pembe renk birinci katmanı (yakalama ve kültürleme bölgesi) ve mavi renk ikinci katmanı (sıvı iletimi) temsil eder.
<img alt="SU-8 fotolitografi aşamaları ve yükseklik ölçüm sonuçlarını içeren mikrofabrikasyon işlem şeması." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50560/50560fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50560/50560fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Şekil 3"> 
Şekil 3. İki katmanlı gofer (wafer) fabrikasyon sürecinin illüstrasyonu. (A) Tuzaklama yapılarını içeren birinci katmanın fabrikasyonu; (B) Akışkan kanallarını, girişleri ve çıkışları içeren ikinci katmanın fabrikasyonu; (C) Birinci katmanın temsilci yüzey profilleri. Bu durumda birinci katmanın yüksekliği 1,200 nm olup kompleks ortamda C. glutamicum kültivasyonu için kullanılmıştır.
<img alt="PDMS kalıplama işlemi diyagramı; SU8, PDMS, cam katmanlı mikroakışkan çip mimarisi; girişler/çıkışlar." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50560/50560fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50560/50560fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Şekil 4"> 
Şekil 4. Cihaz üretimi ve temsili çip. PDMS kalıplama işleminin illüstrasyonu: (A) PDMS karıştırma ve gaz giderme; (B) PDMS kalıplama; (C) kalıptan çıkarma, kesme ve çip bağlama. Nihai çip (Royal Society of Chemistry'nin izniyle yeniden üretilmiştir13): (D) 2 girişi ve 1 çıkışı olan PDMS çipin fotoğrafı; (E) her biri 5 PLBR içeren altı paralel dizinin CAD görüntüsü; (F) bir PLBR'nin SEM görüntüsü.
<img alt="Mikroakışkan cihazda bakteriyel büyüme; laminer akış kanalları; PDMS düzeneği; taşma ve besleme kanalları." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50560/50560fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50560/50560fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Şekil 5"> 
Şekil 5. PLBR sisteminin çalışma prensibi. (A) Ekim aşaması; (B) Bakteriyel mikrokolonilerin büyüme aşaması; (C) Taşma aşaması. Royal Society of Chemistry'den alınan izinle yeniden üretilmiştir13. <a href="http://dx.doi.org/10.1039/C2LC40156H">http://dx.doi.org/10.1039/C2LC40156H</a>.
<img alt="Mikrobiyal mikroskopi görüntüleriyle hücre büyüme grafiği; büyüme hızı analizi için denklemler ve sonuçlar." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50560/50560fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50560/50560fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Şekil 6"> 
Şekil 6. C. glutamicum WT mikrokolonilerinin büyüme hızının belirlenmesi. (A) Üç PLBR kültivasyonunun büyüme grafiği ve buna bağlı üstel eğriler (Bölümler Royal Society of Chemistry'nin izniyle yeniden üretilmiştir)13. <a href="http://dx.doi.org/10.1039/C2LC40156H">http://dx.doi.org/10.1039/C2LC40156H</a>. (B) Büyüyen bir C. glutamicum kolonisinin zaman ayarlı (time-lapse) görüntüleri.
<img alt="Floresan verileriyle mikrobiyal kültür süreci diyagramı; deney hücre büyümesini ve analizini göstermektedir." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50560/50560fig7highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50560/50560fig7.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Şekil 7"> 
Şekil 7. Popülasyon heterojenliğinin PBLR tabanlı analizi. İndükleyici IPTG yokluğunda, Ptac promoter kontrolü altında yfp-tetR füzyonu eksprese eden C. glutamicum (pEKEx2-yfp-tetR) gösterilmiştir. (A) Deneysel iş akışı; (B) koloni-koloni arası heterojenlik ve hücre-hücre arası heterojenlik gösteren üç izojenik mikrokoloni; (C) ilgili mikrokoloniler içindeki tek hücreli floresan dağılımı.
<img alt="Malzeme analizi için farklı ekim girişlerine sahip mikro yapıları karşılaştıran mikroskopi görüntüsü." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50560/50560fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50560/50560fig8.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Şekil 8"> 
Şekil 8. Farklı PLBR'lerin taramalı elektron görüntüleri. Yakalama verimliliğinin optimizasyonu için ekim girişlerini gösteren SEM görüntüleri. (A) Daha büyük ekim girişleri (B) Daha küçük ekim girişleri (C) Daha büyük "açık" ekim girişleri (D) İki ekim girişi.
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1276">
	<colgroup>
		<col span="4">
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td>Adım</td>
			<td>Problem</td>
			<td>Olası Neden</td>
			<td>Çözüm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Wafer Üretimi</td>
			<td>Yumuşak pişirme sırasında SU-8 içinde hapsolmuş hava kabarcıkları</td>
			<td>Sıcaklığın çok hızlı artırılması</td>
			<td>Birkaç kez 95 °C ve 65 °C'de pişirin</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Wafer Üretimi</td>
			<td>Kayıp veya kırılmış SU-8 yapıları</td>
			<td>Optimal olmayan üretim prosedürü; SU-8 yapılarda mekanik stres</td>
			<td>Pişirme süresi, pozlama süresi gibi parametreleri optimize edin</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Wafer Üretimi</td>
			<td>Çok düşük, çok yüksek veya düzensiz SU-8 tabaka kalınlığı</td>
			<td>Spin kaplama sırasında sorun</td>
			<td>Spin-coater parametrelerini ve wafer tutucusunu kontrol edin</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Çip Bağlama ve Montaj </td>
			<td>Çökmüş PLBR'ler</td>
			<td>Optimal olmayan PDMS bağlama parametreleri </td>
			<td>Gücü, plazma pozlama süresini ve bağlama sonrası pişirme süresini ayarlayın</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Çip Bağlama ve Montaj</td>
			<td>PLBR'lerde kirli yapılar ve partiküller</td>
			<td>Çip uygun şekilde temizlenmemiş</td>
			<td>Yüzey temizliği için scotch-tape uygulayın </td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Çip Bağlama ve Montaj</td>
			<td>Yetersiz PDMS-cam bağlama</td>
			<td>Optimal olmayan bağlama parametreleri veya yetersiz temizlik </td>
			<td>Oksijen plazma ayarlarını kontrol edin</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mikroakışkan Deney</td>
			<td>Sıvı sızıntısı</td>
			<td>Giriş/çıkış deliği uygun şekilde delinmemiş </td>
			<td>Delme işlemini optimize edin</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mikroakışkan Deney</td>
			<td>Dolum sırasında çok sayıda küçük PDMS partikülü</td>
			<td>Delik uygun şekilde delinmemiş </td>
			<td>Delme işlemini optimize edin</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mikroakışkan Deney, Biyolojik Boyut</td>
			<td>Hücre büyümemesi</td>
			<td>Temizleme prosedüründen kalan çözücü kalıntısı</td>
			<td>Hücre yüklemesi öncesinde çipi daha kapsamlı şekilde yıkayın veya bağlama öncesinde çözücünün buharlaşmasını bekleyin</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mikroakışkan Deney, Biyolojik Boyut</td>
			<td>Değişen büyüme hızları</td>
			<td>Çeşitli nedenler</td>
			<td>Ön kültürü ve sıcaklığı kontrol edin</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mikroakışkan Deney, Biyolojik Boyut</td>
			<td>Kültürleme sırasında hücre morfolojisi değişiklikleri</td>
			<td>Besin kısıtlamaları veya sıcaklık değişimi</td>
			<td>İnkübatörü ve akışı kontrol edin</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mikroakışkan Deney, Teknik Boyut</td>
			<td>Zaman serisi mikroskobisinde pozisyon kayması</td>
			<td>Sıcaklık dalgalanmaları</td>
			<td>Deneyler öncesinde, osilasyon sona erene kadar sıcaklık profilini kontrol edin</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mikroakışkan Deney, Teknik Boyut</td>
			<td>Kültürleme sırasında hücre kaybı</td>
			<td>Biraz fazla yüksek reaktör yüksekliği </td>
			<td>Reaktör yüksekliğini optimize edin</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mikroakışkan Deney, Teknik Boyut</td>
			<td>Tuzaklama gerçekleşmemesi</td>
			<td>Çok düşük reaktör yüksekliği </td>
			<td>Reaktör yüksekliğini optimize edin</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 1. Sorun Giderme. Bu tablo, deneysel çalışma sırasındaki kritik noktaları, yaygın hataları ve olası çözümleri özetlemektedir.

Bu protokolde, prokaryotik mikroorganizmaların tek hücreli analizi için bir mikroakışkan pikolitre biyoreaktörün (PLBR) üretimi, kurulumu ve temel çalışması tanıtılmaktadır. Endüstriyel olarak ilgili mikroorganizmalar, geleneksel yöntemlerle neredeyse imkansız olan, belirli zaman dilimlerinde büyüme hızı, morfoloji ve fenotipik heterojenlik hakkında bilgi sahibi olmaya izin veren ilke kanıtı olarak analiz edildi.

Mikrobiyal Tek Hücreli Analiz için Mikroakışkan Pikolitre Biyoreaktör: Fabrikasyon, Sistem Kurulumu ve Çalışması

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Bu prosedürün genel amacı, sabit çevresel koşullar altında mikroakışkan bir kültür cihazı kullanarak, tekil bakterileri ve gelişen izojenik mikrokolonileri tam uzaysal ve zamansal çözünürlükle analiz etmektir. Bu işlem, öncelikle CAD yazılımı kullanılarak bir mikroakışkan kültür sisteminin tasarlanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, bakterilerin tek tabakalı büyüme ile sınırlandırılması için bir mikron yüksekliğinde piko-litre biyoreaktörler içeren, polidimetilsiloksan'dan tek kullanımlık mikroakışkan kültür cihazları üretilir.Ardından, biyoreaktörler içindeki tekil ana hücreleri inoküle etmek için mikrobiyal kültür mikroakışkan cihaza infüze edilir. Bu hücreler, sistem üzerinden büyüme ortamının sürekli infüzyonu ile çoğaltılır. Sonuçlar; endüstriyel açıdan ilgili bir Corynebacterium glutamicum suşunun kültivasyonunu, büyüme verilerini ve hücre-hücre heterojenliğini gösteren otomatik zaman atlamalı mikroskopi ile elde edilir.Geleneksel biyoteknolojide analizlerin çoğu ortalama verilere dayanır. Mikroakışkan cihazımız, bireysel bakterilerin tek hücre analizini mekansal ve zamansal çözünürlükle kolaylaştırır. Bu cihaz, izojenik mikrokolonilerin hücreden hücreye heterojenliğini yakından incelemek için kullanışlı bir araçtır.Alt mikron ortam çözünürlüğüne sahip tek kullanımlık mikroakışkan cihazlar üretmek için yaygın SU-8 fotolitografi ve polidimetilsiloksan çip kalıplama yöntemlerini uyguluyoruz. Teknolojimizi Escherichia coli ve Corynebacterium glutamicum gibi çeşitli biyoteknolojik mikroorganizmalarla başarıyla kanıtladık. Başlamak için, mikroakışkan cihazı CAD yazılımı kullanarak tasarlayın.Bu protokolde sunulan tasarım; iki ekim girişi, iki farklı substratı karıştırmak için bir gradyan jeneratörü, bir çıkış ve her biri beş biyoreaktörden oluşan altı diziden meydana gelmektedir. Temiz oda ortamında, dört inçlik bir silikon gofret hazırlayın ve beraberindeki metin protokolünde açıklandığı şekilde gofret üzerine bir mikron SU-8 2000.5 fotoresist spin kaplama yöntemiyle uygulayın. Fazla solventi uzaklaştırmak için kaplanmış gofreti 95 °C sıcaklıktaki bir ısıtıcı tabla üzerine yerleştirin ve ardından piko litre reaktörlerin yakalama bölgelerini içeren ilk katman foto maskesini ve kaplanmış gofreti maska hizalama cihazına yerleştirin.Ardından, wafer'ı vakum temas modunda, santimetrekare başına yedi miliwatt şiddetindeki 350 ila 400 nanometre ışığa üç saniye boyunca maruz bırakın. SU-8'in polimerizasyonunu başlatmak için düz bir ısıtıcı plaka üzerinde 95 °C'de poz sonrası pişirme işlemi uygulayın. Sonra, wafer'ı bir dakika boyunca SU-8 geliştirici banyosuna yerleştirin ve ardından wafer'ı birkaç saniye boyunca taze SU-8 geliştirici içeren ikinci bir kaba aktarın.SU-8 geliştiriciyi uzaklaştırmak ve gofretlemi kurutmak için gofreti izopropanol ile durulayın; kurutma işlemi için azot akışı veya gofret döndürücü kullanın. Ardından, gofreti 150 °C'de 10 dakika boyunca sert pişirmeye (hard bake) tabi tutun. Son olarak, ana kalıbı tamamlamak için beraberindeki metin protokolünde açıklandığı şekilde ikinci katmanı oluşturun.Baz ve taşıyıcı ajanı 10'a bir oranında karıştırarak PDMS çip fabrikasyonuna başlayın. PDMS karışımını, tüm kabarcıklar gidene kadar bir vakum desikatörü içerisinde yaklaşık 30 dakika boyunca gazdan arındırın. Ardından, SU-8 wafer'ı bir kalıplama düzeneğine yerleştirin ve wafer üzerine üç milimetrelik bir PDMS karışımı tabakası dökün.Ardından, PDMS'i bir fırında 80 °C'de üç saat boyunca pişirin. Soğuduktan sonra, PDMS tabakasını wafer'dan dikkatlice soyun ve temiz, keskin bir neşter kullanarak tabakayı tekil çiplere bölün. Çipleri 90 dakika boyunca n-pentan banyosunda, ardından her biri 90 dakika süren iki adet aseton yıkama banyosunda yıkayın.Çipler üzerindeki solvent kalıntılarını gidermek için çipleri gece boyunca kurutun. Deneyden hemen önce, tüpleri PDMS çipe bağlamak için kullanılan konnektörlerden biraz daha küçük çaplı bir iğne veya delgeç kullanarak PDMS çip üzerinde giriş ve çıkış deliklerini açın. Ardından, mikroakışkan PDMS çipi izopropanol ile dikkatlice temizleyin ve yapışan toz partiküllerini temizlemek için şeffaf bant kullanın.Ayrıca, 170 mikron kalınlığındaki bir cam lamı önce aseton, ardından izopropanol ve son olarak deiyonize su ile temizleyin ve lamı bir nitrojen akımıyla kurutun. Temizlendikten ve kuruduktan sonra, cam lamı ve PDMS çipi 50 Watt güç ve 20 sccm oksijen akış hızıyla 25 saniye boyunca plazma ile oksitleyin. Ardından, PDMS'i camın üzerine yerleştirmeden önce PDMS ve cam çipi dikkatlice hizalayın; bu işlem saniyeler içinde bağlanmalarını sağlayacaktır.Düzenek 80 °C'de 10 saniye boyunca fırınlanarak bağ sabitlenir. Bakterileri bir çip deneyi için hazırlamak üzere, C.glutamicum gibi istenen bir bakteri suşunun tek bir kolonisini 20 ml taze BHI besiyerine inoküle edin ve kültürü 30 °C'de, 120 RPM hızındaki döner çalkalayıcıda gece boyunca inkübe edin. Ertesi sabah, başlangıç kültüründen 10 µL'yi, 20 ml istenen besiyeri içeren ikinci bir kültüre aktarın ve hücrelerin aynı koşullar altında gece boyunca büyümesine izin verin.Ertesi gün, bir ters mikroskobun inkübatörünü 30 °C'ye kadar önceden ısıtın. Bu işlem, kullanılan düzeneğe bağlı olarak iki saate kadar sürebilir. Düzenek ısınırken inkübatörü açın, istenen objektifi seçin ve gerekli olan herhangi bir montaj medyumu ile hazırlayın.Ardından, çipi çip tutucuya yerleştirin ve sabitleyin. Numuneyi mikroskopta ortalayın ve piko litre biyoreaktör dizilerine odaklanın. Çip odaklandığında, giriş ve çıkışları uygun borularla bağlayın ve ardından çıkış borusunu bir atık haznesine yerleştirin.Ardından, bir şırıngayı taze besiyeri ile doldurun, bir şırınga pompasına yerleştirin ve çipi hazırlamak için mikroakışkan kanalları dakikada 200 nanolitre akış hızında bir saat boyunca durulayın. Hücreler henüz erken eksponansiyel büyüme evresindeyken, bir mililitre bakteri kültürünü steril bir şırıngaya aktarın ve besiyeri içeren şırıngayı ve boruyu, hücre süspansiyonu ve yeni boruyla değiştirin. Pikolitre biyoreaktörlerin çoğu dolana kadar hücre süspansiyonunu kanallara dakikada 200 nanolitre hacimsel akış hızında infüze edin.Sadece az sayıda biyoreaktör doldurulacaksa, akış hızını dakikada 800 ila 1200 nanolitreye yükseltin. İstenen miktarda hücre ekildiğinde, hücre süspansiyonunu ayırın, büyüme ortamını çipe tekrar bağlayın ve dakikada 100 nanolitre hızla taze besiyeri ile perfüzyon yapın. Ardından, çipi tarayın ve time-lapse görüntüleme için belirli biyoreaktörleri seçin.Ardından, biyoreaktörleri başlangıçtan bitişe kadar görüntülemek ve deneyi başlatmak için bir time-lapse mikroskopi sekansı konfigüre edin. Tüm piko litre biyoreaktörler aşırı büyüdüğünde, deneyi durdurun ve çipleri uygun şekilde imha edin. Analize başlamak için öncelikle, ana hücrelerin sayısı ve konumu gibi deney için istenen tüm kriterleri karşılayan biyoreaktörleri belirleyin.Image J gibi bir analiz programı kullanarak, her zaman noktasındaki hücre sayısını sayarak her bir mikrokoloninin büyüme hızını belirleyin. Zaman ile hücre sayısının logaritmasını grafikleyerek maksimum büyüme hızını hesaplayın. Burada sunulan sistem; büyüme, morfoloji veya floresan sinyali gibi farklı biyolojik parametreler açısından çeşitli bakteri türlerini incelemek için uygulanabilir.Bu örnekte, C.glutamicum standart kültür koşulları altında kültüre edilmiş ve üç izojenik mikrokoloniden elde edilen büyüme eğrileri burada gösterilmiştir. Pikolitre biyoreaktörlerin, burada gösterildiği üzere zaman geçirmeli floresan mikroskopisi kullanılarak protein üretimine erişimde faydalı olduğu da kanıtlanmıştır. Hücreler düşük konsantrasyonda protein indükleyicisi IPTG'ye maruz bırakılarak, tek bir ana hücreden başlayan koloniler içerisinde proteinin hücreler arası varyasyonları tek hücre düzeyinde incelenebilmektedir.Gösterilen teknik, kusursuz çevresel kontrol ile tekil bakteriyel hücrelerin izlenmesi ve analiz edilmesi için uygulanabilir. Bu, geleneksel laboratuvar ölçekli kültürleme sistemleri kullanılarak pek mümkün değildir. Bu videoyu izledikten sonra, benzer tek hücre analizlerini gerçekleştirmek için mikroakışkan kültürleme çiplerinin nasıl hazırlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

microfluidic-picoliter-bioreactor-for-microbial-single-cell-analysis

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Mikroakışkansal Pikoliterli Mikrobiyal Tek Hücre Analizi için Biyoreaktör: Üretim, Sistem Kurulumu ve Çalıştırma

Pnömatik bir biyoreaktör kullanarak, memeli hücrelerinin büyümesi için bu tek kullanımlık biyoreaktör sisteminin montajını, çalışmasını ve performansını gösteriyoruz.

Tek kullanımlık Pnömatik Biyoreaktör Sistemi kullanılarak memeli hücrelerinde yetiştirme

Bu protokol, bir mikroakışkan cihaz kullanarak otomatik küçük hacimli (0,15–1,5 ml) parçacık ayırma işlemleri gerçekleştirmek için bir sistem mimarisini tanımlar ve akustoakışkan cihaz performansını ve çalışmasını optimize etme yöntemlerini tartışır.

Bir mikroakışkan Hassas Küçük hacimli Numune İşleme Platformu ve Akustik mikrocihazda Ayrı Biyolojik Parçacıklar Boyutu Kullanımı

Burada, yüksek verimli tek hücre izolasyonu ve uzun süreli klonal kültüre izin vermek için yeni bir mikro kuyu tasarım konseptini kullanan mikroakışkan bir platformla tek hücreleri izole etmek ve kültürlemek için bir protokol sunuyoruz.

Yüksek verim Tek hücreli İzolasyonu ve Kültür mikroakışkan Platformu

Biz örnek olarak Bacillus subtilis kullanarak bireysel bakteri hücre soy mikrosıvısal çözümlenmesi için bir yöntem mevcut. Yöntemi gözlem, hücre nesiller sıkı bir şekilde kontrol edilebilir ve düzgün büyüme koşullar altında yüzlerce izin vererek Mikrobiyoloji geleneksel analitik yöntemleri eksikliklerin üstesinden gelir.

Bacillus subtilis tek hücreli mikrosıvısal analizi

Burada, Pseudomonas aeruginosa biyofilmler araç da dahil olmak üzere yeşil flüoresan proteinler ifade üzerinde kesme stres etkileri analizi için floresan mikroskop ile birleştiğinde bir akışı sağlayarak daha yüksek mikrosıvısal biyoreaktör kullanımını açıklar biyofilm kapsamı, büyüme oranı ve morfolojik özellikleri belirlenmesi, ayarla.

Canlı hücre analizi, yamultma stres bir otomatik yüksek üretilen iş mikrosıvısal sistemi kullanarak Pseudomonas aeruginosa

1500 kültür ünitesi, bir dizi gelişmiş peristaltik pompa ve yerinde karıştırma modülünden oluşan karmaşık yaşam makineleri üzerinde yüksek verimli çalışmalar için mikroakışkan bir sistem sunuyoruz. Mikroakışkan çip, vivodaki son derece karmaşık ve dinamik mikro çevresel koşulların analizini sağlar.

Yüksek Verimli Mikroakışkan Cihaz Kullanarak Dinamik ÇevreSel Koşulların Üretilmesi

Bu yazıda, hücresel proseslerde çözünenlerin sekresyon dinamiklerini ve absorpsiyon oranlarını ölçmek için düşük maliyetli, çok kanallı bir perfüzyon hücre kültürü sistemi kurmak ve çalıştırmak için bir yöntem sunulmaktadır. Sistem ayrıca hücreleri dinamik uyaran profillerine maruz bırakabilir.

Dinamik Hücre Kültürü için Çıkış Fraksiyonasyonu ile Entegre Çok Akışlı Perfüzyon Biyoreaktörü

Mevcut protokol, yüksek çözünürlüklü mikroskopi görüntülemeyi eşzamanlı basınç farkı ölçümleriyle birleştirerek yarı-2D gözenekli ortamlarda biyofilm gelişimini incelemek için mikroakışkan bir platformu tanımlamaktadır. Platform, gözenekli ortamlardaki gözenek boyutunun ve sıvı akış hızlarının biyotıkanma üzerindeki etkisini ölçer.

Gözenekli Ortamlarda Biyotıkanıklığı İncelemek için Mikroakışkan Bir Platform

Bu protokol, mikrobiyal monoklonal izolasyon, yetiştirme ve toplama işlemlerini gerçekleştirmek için Tek hücreli Mikrolitre damlacık Kültür Omik Sisteminin (MISS hücresi) nasıl kullanılacağını açıklar. MISS hücresi, mükemmel damlacık monodispersisitesi, yüksek paralel yetiştirme ve yüksek verimli biyokütle tespiti sunan damlacık mikroakışkan teknolojisine dayalı entegre bir iş akışı sağlar.

Tek Hücreli Mikrolitre Damlacık Kültürü Omik Sistemini Kullanarak Otomatik ve Yüksek Verimli Mikrobiyal Monoklonal Yetiştirme ve Toplama

Bu protokol, anaerobik koşullar altında karmaşık dışkı topluluklarının sürekli akış kültürü için kullanılacak mini biyoreaktör dizilerinin montajını detaylandırır. Daha fazla analiz için reaktörlerin montajı, aşılanması ve numune alınması yöntemlerini de tartışıyoruz.

Karmaşık dışkı topluluklarının sürekli kültürü için biyoreaktör düzeneği

Bu protokol, manganez oksit minerallerinin mikrobiyal çökelmesini incelemek için mikrofluidik bir sistem sunar. Biyomineral oluşumu yerinde optik mikroskopi ve görüntü analiziyle ölçülür. Bu yaklaşım, gözenekli ortamlarda diğer belirgin renkli biyojenik minerallerin çökelmesini incelemek için uyarlanabilir.

Gözenekli ortamda metal oksitlerin mikrobiyal çökelmesini araştırmak için mikrofluidik bir platform

Öğrenin mikroakışkan pikolitre biyoreaktör kullanarak tek hücreli bakteri analizi ve izojenik mikrokoloni büyümesini incelemeyi. Bu yöntem Corynebacterium glutamicum ve Escherichia coli gibi mikroorganizmaların fenotipik heterojenitesini araştırmaya olanak tanır.

Mikrobiyal Tek Hücreli Analiz için Mikroakışkan Pikolitre Biyoreaktör: Fabrikasyon, Sistem Kurulumu ve Çalışması

Daha fazla video keşfet