Melanom ve Skuamöz Kanser Kök Hücreleri Kullanılarak Yeni Bir Dendritik Hücre aşısının Üretilmesi

Bu prosedürün genel amacı, immünokompetan bir konakçıda, kanser kök hücresi veya CSC tabanlı bir dendritik hücre veya DC aşısının antitümör immünitesini değerlendirmektir. Bu işlem, öncelikle heterojen tümör hücrelerinden alor pozitif aldehit dehidrogenaz veya A LDH yüksek CSC'lerin izole edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, CSC DC'ler izole edilir ve ardından aşı için lizat ile pulse edilir.

Ardından, CSC lizatı yüklü DC veya TP DC aşısı, normal sinjenik immünokompetan konakçılara uygulanır. Daha sonra son adımda, C-S-C-T-P-D-C aşısının koruyucu anti-tümör etkinliği değerlendirilir. Son olarak, konakçı T-hücreleri ve antikorlar tarafından oluşturulan C-S-C-T-P-D-C aşısı kaynaklı anti-CSC immünitesini değerlendirmek için ELISA gerçekleştirilebilir.

Bu proje, kanser araştırmalarının en heyecan verici iki alanını, kanser kök hücreleri ve tümör immünoterapisi alanlarını bir araya getirmektedir. Laboratuvarımız, katı tümörlerdeki kanser kök hücrelerini keşfeden ilk merkezlerden biriydi. Bunlar, kanserin büyümesini ve metastazını yönlendiren kanser tohumlarıdır.

Bugün, bu kanser kök hücrelerini spesifik olarak hedeflemek için immünoterapi kullanan yeni bir yaklaşım göreceksiniz. Alde fluoro analizi ile tespit edilebilen aldehit dehidrogenaz adlı özel bir belirteç kullanıyoruz. Doktor Lin Liu ve Huon Tau'nun Dr. Chow Lee ile birlikte çalıştığını göreceksiniz.

Bu kanser kök hücrelerini hedefleyerek birçok kanser türündeki hastaların sonuçlarını iyileştirmeyi umuyoruz. İlgili tümör hücrelerini 1 × 10⁶ hücre/mL konsantrasyonda bir alor analiz tamponunda süspanse ederek başlayın. Ardından, tümör hücrelerinin 3 mL'si dışındakileri örnek tüplerinin her birine aktarın ve dört adet 12 × 75 mm polistiren kontrol test tüpünü şu şekilde etiketleyin: boyanmamış, alor, ALOR + DEAB ve 7-AAD. Hücre süspansiyonundan 1 mL'sini boyanmamış ve 7-AAD tüplerine, 2 mL'sini ise alor tüpüne dağıtın.

Ardından, ALOR artı DEAB tüpüne beş µL DEAB ekleyin. Tüpleri buza yerleştirin ve ardından ALOR tüpüne 10 µL aktive edilmiş ALOR substratı ekleyerek karıştırın. Substrat çözeltisinden bir mL'yi hemen ALOR artı DEAB tüpüne aktarın ve ardından her bir örnek tüpüne 1 milyon hücre başına iki µL aktive edilmiş ALOR substratı ekleyin.

Tüm tüpleri 37 °C'lik bir su banyosunda 30 dakika inkübe edin, ardından 7-AAD tüpüne beş µL 7-AAD ve her bir örnek tüpüne 1 milyon hücre başına bir µL 7-AAD ekleyin. Bu tüpleri 10 dakika boyunca 4 °C'de bekletin. Tüm tüpleri oda sıcaklığında 250 ×g'de beş dakika santrifüj edin ve pelletleri, floresanla aktive edilmiş hücre seçimi (FACS) için AldeFluor analiz tamponunda yeniden süspande edin.

Sıralama kapılarını ayarlamak için, negatif kontrol olarak alde Fluor plus DEAB hücrelerini ve canlılık kontrolü olarak yedi A a D boyanmış hücreleri kullanın. Bu kontrollere dayanarak, alor pozitif A LDH, yüksek D beş ve SCC yedi hücrelerini ayırt etmek için bir kapı belirleyin. Ardından, örnek hücrelerini alor pozitif A LDH, yüksek D beş ve SCC yedi popülasyonlarına sıralamak için bunu kullanın.

Dendritik hücreleri üretmek için öncelikle bir C 57 black six ve bir C3 H faresinden femur ve tibia kemiklerini izole edin. Kemikleri oda sıcaklığında bir dakika boyunca %75 etanol ile sterilize edin ve ardından HBSS ile yıkayın. Sonra, kemiklerin uçlarını kesin ve ardından kemik iliğini bir Petri kabına boşaltmak için 21 gauge iğne takılmış 10 mililitrelik bir şırınga kullanın; tek hücreli bir süspansiyon oluşturmak için hücreleri birkaç kez aspire edip dağıtın ve ardından hücreleri santrifüjle çöktürün.

Peleti, beş mililitre eritrosit lizis tamponu içerisinde, 37 °C sıcaklıktaki su banyosunda bir dakika boyunca inkübe edin. Hücreleri saydıktan sonra, hacmi G-M-C-S-F ve IL-4 ile takviye edilmiş kültür ortamında mililitre başına 1 × 10⁶ hücre olacak şekilde ayarlayın. Ardından hücreleri 37 °C ve %5 CO2 ortamında kültüre edin; besiyerini ve sitokinleri üç gün sonra yenileyin.

Beşinci günde, olgunlaşmamış dendritik hücreleri hasat edin. Hücreleri çöktürdükten sonra, peletleri beş mililitre kültür ortamında yeniden süspande edin ve ardından hücre süspansiyonunu taze hazırlanmış izolasyon ortamının üzerine yavaşça katmanlayın. Hücreleri tekrar santrifüjledikten sonra, kültür ortamı ile izolasyon ortamı katmanları arasında kalan dc'leri toplayın.

Ardından hücreleri saydıktan sonra, hacmi; G-M-C-S-F ve IL 4 ile desteklenmiş kültür ortamında 1 × 10⁶ hücre/mL konsantrasyonuna ayarlayın; şimdi sıralanan hücreleri dört kez hızlı dondurma-çözme döngülerine tabi tutarak ve ardından lizatların membran kısmını toplamak için santrifüj işlemi uygulayarak tümör lizatlarını hazırlayın. Daha sonra, CSC TPC'lerini hazırlamak için DCS'leri, sıralanmış otolog A LDH yüksek hücrelerden elde edilen lizat ile pulse edin.

H-T-P-D-C pulsunu hazırlamak için, deneysel alıcı hayvanları aşılamak amacıyla sıralanmamış heterojen tümör hücre lizatı ile yüklenmiş dcs'den, 100 µL PBS içinde süspanse edilmiş 1 × 10⁶ puls hücreyi her farenin sol yan tarafına deri altına enjekte edin; aşılamadan sonra, C 57 black six alıcı fareleri challenge etmek için 100 µL PBS içinde 1 × 10⁵ heterojen D five tümör hücresini intravenöz olarak uygulayın. SCC seven modeli için, DC aşısının karşı tarafına 100 µL PBS içinde 1 × 10⁶ sıralanmamış SCC seven tümör hücresini C3 H alıcı farelere deri altına enjekte ederek challenge işlemini gerçekleştirin.

Alıcı C3 H farelerinin dalaklarından tek hücre süspansiyonu hazırlayın. Ardından, dalak T ve B hücrelerini, uygun stimülanlarla desteklenmiş kültür ortamında immobilize anti CD 3 ve anti CD 28 monoklonal antikorlarla aktive edin. Dört gün sonra süpernatantları toplayın ve ardından ELISA plaklarını 4 °C'de gece boyunca interferon gamma, G-M-CSF veya IgG'ye karşı antikorlarla kaplayın. Ertesi gün plakları non-spesifik bağlanmayı önlemek için bloke edin; standartları ve yeni toplanan süpernatantları ekleyin ve ardından plakları oda sıcaklığında inkübe edin. Yıkama işleminden sonra HRP deteksiyon antikorunu bir saat boyunca ekleyin ve ardından TMB substratını ilave edin.

Son olarak, reaksiyonu durdurduktan sonraki 30 dakika içinde bir ELISA plak okuyucusu ile 450 nanometrede absorbansı ölçün. Alor, aralarında kanser kök hücresi açısından zenginleştirilmiş D beş ve SCC yedi popülasyonlarının da bulunduğu çok sayıda malignitede kök hücreleri izole etmek için bir belirteç olarak kullanılmıştır; özellikle bu nokta grafiklerinde gösterildiği üzere, alor pozitif hücreler kültüre edilmiş D beş ve SCC yedi tümör hücre hatlarının sırasıyla yaklaşık %0,5'ini ve %5,2'sini oluşturmaktadır. Yeni hasat edilmiş tümör hücrelerinin ise, in vivo olarak oluşturulan D beş ve SCC yedi tümörlerinden sırasıyla %2,5 ve %4,2 oranında alor pozitif hücre içerdiği belirlenmiştir.

D-E-A-B-A spesifik A LDH inhibitörü ile işlem görmüş tümör hücreleri negatif kontrol olarak kullanılmıştır. Kanser kök hücrelerin immünojenisitesi, az önce gösterilen aşılama modeli kullanılarak CSC TPC'ler tarafından indüklenen koruyucu antitümör immünite incelenerek değerlendirilmiştir. Bu tabloda gösterildiği üzere, H TPC'ler ile işlem gören fareler, sadece PBS ile işlem gören farelere kıyasla daha az akciğer metastazı geliştirmiştir.

Önemli bir nokta olarak, CSCT PC'leri ile tedavi edilen fareler, sadece H-T-P-D-C veya PBS ile tedavi edilen hayvanlara kıyasla daha az akciğer metastazı göstermiştir. SCC seven modelinde, kontrol grubuyla karşılaştırıldığında, normal C3 H hayvanları az önce gösterildiği şekilde aşılanmıştır. H TPC'ler orta düzeyde anti-tümör immünite oluştururken, CSC TPC'ler belirgin bir tümör büyüme inhibisyonu sağlamıştır. Bu sonuçlar, tümör hücresi atağına karşı koruyucu immünite oluşturmak amacıyla DC'leri yüklemek için CSC'lerin, geleneksel olarak ayrıştırılmamış tümör hücrelerine kıyasla daha etkili bir antijen kaynağı olarak kullanılabileceğini göstermektedir.

Gözlemlenen CSC kaynaklı koruyucu anti-tümör immünitesinin altında yatan mekanizmaları daha iyi anlamak için, DC aşılı hayvanlardan alınan sitositler aktive edilmiş ve sitokin üretimleri EISA ile ölçülmüştü; burada gösterildiği üzere, D beş CSC TPC'leri veya S CCC yedi CSC PC'leri ile aşılanan hayvanlardan elde edilen sitositlerde sitokin üretimi, D beş H TPC'leri veya SCC yedi HTC'leri ile aşılanan hayvanlardan elde edilenlere göre anlamlı derecede daha yüksekti. Bugün, kanser kök hücrelerini izole etmek için Alor deneyinin nasıl kullanılacağını gördünüz.

Bu kanser kök hücreleri daha sonra dendritik hücrelerin kullanıldığı immünoterapiler geliştirmek için kullanılabilir. Tek başına veya mevcut tedavilerle kombinasyon halinde kullanılan bu immünoterapilerin, birçok kanser türü olan hastaların prognozunu iyileştirmesini umuyoruz.