Name: Melanom ve Skuamöz Kanser Kök Hücreleri Kullanılarak Yeni Bir Dendritik Hücre aşısının Üretilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 43 s
Description: Öğrenin kanser kök hücreleri kullanılarak dendritik hücre aşısı üretme yöntemini. ALDH yüksek hücreleri izole edip aşıyı hazırlayarak antitümör bağışıklığı değerlendirin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma Michigan Üniversitesi Kapsamlı Kanser Merkezi'nin Will ve Jeanne Caldwell Endowed Araştırma Fonu ve kısmen NIH grant CA82529 ve Gillson Longenbaugh Vakfı tarafından desteklendi.

1. ALDEFLUOR Boyama
<ol><li>Hücre örneği hazırlama: Kültürlü tümör hücrelerinden veya yeni hasat edilmiş tümör örneklerinden tümör hücrelerinin tek hücreli süspansiyonu hazırlayın. Hücreleri sayın ve hücre süspansiyonu ALDEFLUOR Tahlil Tamponunda 1 x10 6 hücre/ml konsantrasyona ayarlayın.</li>
	<li>Dört adet 12 mm x 75 mm polistiren test tüpünü kontrol tüpleri olarak şu şekilde etiketle: #1: Lekesiz, #2: ALDEFLUOR, #3: ALDEFLUOR artı DEAB ve #4: 7AAD.</li>
	<li>Bu kontrol tüpleri için, 1ml hücre süspansiyonu #1 ve #4, ancak 2 ml tüp #2 yerleştirin. Tüp #3 5 μl DEAB (ALDH inhibitörü) ekleyin ve buzda tutun. Daha sonra tüp #2 10 μl aktif ALDEFLUOR substrat ekleyin, karıştırın ve karışımın 1 ml'yi hemen tüp #3 aktarın.</li>
	<li>Aynı zamanda, ALDEFLUOR Test Tamponunda 1 x 10 6 hücre/ml'de de hücrelerin geri kalanına (örnek tüpler) milyon hücre başına2 μl aktif ALDEFLUOR substratı ekleyin.</li>
	<li>37 °C su banyosunda hem 4 kontrol tüpünü hem de numune tüplerini 30 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Kuluçkadan sonra, kontrol tüpüne #4 5 μl 7AAD ve numune tüpüne 1 μl 7AAD 1 x10 6 hücre ekleyin. 4 °C'de 10 dk kuluçkaya yatır.</li>
	<li>Tüm tüpleri 250 x g'da 5 dakika santrifüj edin ve süpernatantı çıkarın.</li>
	<li>ALDEFLUOR Test Arabelleği'ndeki hücreleri yeniden başlatın.</li>
	<li>Akış sitometri tabanlı sıralama gerçekleştirin.</li>
	<li>DEAB ile negatif kontrol olarak tedavi edilen ALDEFLUOR lekeli hücreleri ve canlılık kontrolü için propidium iyodür (PI) 7AAD lekeli hücreleri kullanarak sıralama kapılarını ayarlayın. Bu kontrollere dayanarak, ALDEFLUOR+/ALDHyüksek,D5 ve SCC7 hücrelerini ayırt etmek için bir kapı kuruldu. Bu kapılar daha sonra ALDEFLUOR+/ALDHyüksek D5 ve SCC7 hücreleri için yukarıda hazırlanan tüm örnek hücreleri sıralamak için kullanılacaktır.</li>
</ol>2. Kanser Kök HücreLi Lisate-nabız Dendritik Hücre (CSC-TPDC) Aşısının Hazırlanması
<ol><li>Fareleri (sırasıyla singeneik B6 ve C3H) CO2 kullanarak ötenazi ve femur ve kaval kemiğini izole edin.</li>
	<li>Kemikleri oda sıcaklığında 1 dakika boyunca% 75 etanol içine koyun. Daha sonra HBSS kullanarak kemikleri yıkayın.</li>
	<li>Kemikleri kesin ve hücreleri bir tabağa itmek için 21 G iğne ve 10 ml şırınga kullanın.</li>
	<li>Tek hücre süspansiyonu yapmak için şırınna kullanarak hücreleri aspire edin ve üfleyin.</li>
	<li>5 dakika boyunca 1.500 rpm'de santrifüjlemeden sonra, süpernatantı atın. Daha sonra 37 °C su banyosunda 1 dakika boyunca RBC'yi lizize etmek için 5 ml RBC liziz tamponu ekleyin.</li>
	<li>Hücre sayısını sayın ve hücre süspansiyonu 10 ng/ml GM-CSF ve 10 ng/ml IL-4 içeren tam orta (CM) olarak 1 milyon hücre/ml konsantrasyonuna ayarlayın.</li>
	<li>Hücreleri kültüre edin ve 3 gün sonra CM artı IL-4 ve GM-CSF'yi telafi edin.</li>
	<li>5. günde, olgunlaşmamış dendritik hücreleri (DC'ler) hasat edin ve 4,2 ml çözelti C artı 1 ml OptiPrep yoğunluk gradyan ortamı içeren DC izolasyon ortamını hazırlayın.</li>
	<li>Hücre peletlerini 5 ml CM olarak askıya alın Hücre süspansiyonu izolasyon ortamına yavaşça ekleyin. Oda sıcaklığında 2,000 rpm'de santrifüj.</li>
	<li>CM ve yalıtım ortamı arasındaki DC'leri toplayın. Hücre sayısını sayın ve hücre süspansiyonu 10 ng/ml GM-CSF ve 10 ng/ml IL-4 içeren kültür ortamında 1 milyon hücre/ml konsantrasyonuna ayarlayın.</li>
	<li>Kültür ortamında ALDHyüksek veya sıralanmamış D5 veya SCC7 hücrelerini askıya alarak ve dört kez hızlı donma-çözülme maruziyetine maruz kalarak tümör lysates hazırlayın ve ardından lysates'in membran kısmını toplamak için 5 dakika boyunca 100 x g ∼ dönüş yaparak.</li>
	<li>CSC-TPDC hazırlamak için, otolog ALDHyüksek hücrelerinin lysate ile darbe DC'leri. H-TPDC hazırlamak için, sıralanmamış heterojen tümör hücre lisat ile nabız DC'leri. DC'nin tümör hücre lisat oranı aynıdır.</li>
</ol>3. Etkinliğin Aşılanması ve Değerlendirilmesi
<ol><li>Normal B6 farelerini sırasıyla 2.500 D5 CSC-TPDC veya D5 H-TPDC tümör hücresi ile deri altı (s.c.) ile aşılayın. Normal C3H hayvanları s.c.</li>
	<li>Aşılamadan sonra, B6 farelerini heterojen D5 tümör hücreleriyle meydan oku, yani 20 gün sonra CO2 kullanarak fareleri ötenazi edin. Akciğerleri topla ve akciğer metastazlarını numaralandırır.</li>
	<li>SCC7 modelinde, DC aşısının karşı tarafında sıralanmamış SCC7 tümör hücreleri s.c ile C3H farelerine meydan oku. Tümör boyutunu izleyin.</li>
	<li>Deneylerin sonunda CO2kullanarak B6 ve C3H farelerini ötenazi yapın. İlk aşıdan sonraki 34. günde, fareleri CO2ile ötenazi ve aynı zamanda aseptik bir prosedürle her grubun dalağını toplayın.</li>
	<li>Immobilize anti-CD3 artı hrIL-2 veya LPS içeren CM'de anti-CD28 mAbs artı anti-CD40 (FGK45) mAb assitleri ile dalak T ve/veya B hücrelerini etkinleştirin.</li>
	<li>Etkinleştirmeden sonra, süpernatantları toplayın ve ELISA tahlilleri için kullanın.</li>
	<li>ELISA testi için, IFNφ, GM-CSF ve IgG için antikor içeren kaplama plakaları 4 °C O/N'de.</li>
	<li>Engelleme tamponu uygulamasından sonra, numuneler ve standartlar ekleyin ve oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Plakayı yıkayın ve inkübasyon için HRP algılama antikor ve TMB substrat ekleyin.</li>
	<li>Reaksiyonu durdurduktan sonra 30 dakika içinde 450 nm'de bir ELISA plaka okuyucusunda emiciliği ölçün.</li>
</ol>

<ol><li>Shafee, N., Smith, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+contribute+to+cisplatin+resistance+in+Brca1%2Fp53-mediated+mouse+mammary+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells contribute to cisplatin resistance in Brca1/p53-mediated mouse mammary tumors.</a> Cancer Res. 68, 3243-3250 (2008).</li>
<li>Nandi, S., Ulasov, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-dose+radiation+enhances+survivin-mediated+virotherapy+against+malignant+glioma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Low-dose radiation enhances survivin-mediated virotherapy against malignant glioma stem cells.</a> Cancer Res. 68, 5778-5784 (2008).</li>
<li>Dallas, N. A., Xia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoresistant+colorectal+cancer+cells%2C+the+cancer+stem+cell+phenotype%2C+and+increased+sensitivity+to+insulin-like+growth+factor-I+receptor+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Chemoresistant colorectal cancer cells, the cancer stem cell phenotype, and increased sensitivity to insulin-like growth factor-I receptor inhibition.</a> Cancer Res. 69, 1951-1957 (2009).</li>
<li>Yamauchi, K., Yang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+cancer+metastasis+by+cyclophosphamide+pretreatment+of+host+mice%3A+an+opposite+effect+of+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Induction of cancer metastasis by cyclophosphamide pretreatment of host mice: an opposite effect of chemotherapy.</a> Cancer Res. 68, 516-520 (2008).</li>
<li>Chang, A. E., Redman, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+I+trial+of+tumor+lysate-pulsed+dendritic+cells+in+the+treatment+of+advanced+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A phase I trial of tumor lysate-pulsed dendritic cells in the treatment of advanced cancer.</a> Clin. Cancer Res. 8, 1021-1032 (2002).</li>
<li>Ito, F., Li, Q., Shreiner, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-CD137+monoclonal+antibody+administration+augments+the+antitumor+efficacy+of+dendritic+cell-based+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Anti-CD137 monoclonal antibody administration augments the antitumor efficacy of dendritic cell-based vaccines.</a> Cancer Res. 64, 8411-8419 (2004).</li>
<li>Kirk, C. J., Hartigan-O'Connor, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell-dependent+antitumor+immunity+mediated+by+secondary+lymphoid+tissue+chemokine%3A+augmentation+of+dendritic+cell-based+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">T cell-dependent antitumor immunity mediated by secondary lymphoid tissue chemokine: augmentation of dendritic cell-based immunotherapy.</a> Cancer Res. 61, 2062-2070 (2001).</li>
<li>Ning, N., Pan, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cell+vaccination+confers+significant+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cell vaccination confers significant antitumor immunity.</a> Cancer Res. 72, 1853-1864 (2012).</li>
<li>Ginestier, C., Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXCR1+blockade+selectively+targets+human+breast+cancer+stem+cells+in+vitro+and+in+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">CXCR1 blockade selectively targets human breast cancer stem cells in vitro and in xenografts.</a> J. Clin. Invest. 120, 485-497 (2010).</li>
<li>Carpentino, J. E., Hynes, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aldehyde+dehydrogenase-expressing+colon+stem+cells+contribute+to+tumorigenesis+in+the+transition+from+colitis+to+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Aldehyde dehydrogenase-expressing colon stem cells contribute to tumorigenesis in the transition from colitis to cancer.</a> Cancer Res. 69, 8208-8215 (2009).</li>
<li>Charafe-Jauffret, E., Ginestier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+cell+lines+contain+functional+cancer+stem+cells+with+metastatic+capacity+and+a+distinct+molecular+signature%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Breast cancer cell lines contain functional cancer stem cells with metastatic capacity and a distinct molecular signature.</a> Cancer Res. 69, 1302-1313 (2009).</li>
</ol>

STEMCELL Technologies, Açık Erişim yayın ücretlerini desteklemiştir.

SCID fareleri gibi bağışıklık sistemi baskılanmış konaklar, konakçılarda adaptif bağışıklık eksikliği nedeniyle CSC'lerin immünolojik değerlendirmelerini önler. Bu çalışmada, hasta ayarlarını daha yakından taklit edebilecek, immün yetmeseent konakçılarda KSS'lerin immünojenikliğini değerlendirdik. Zenginleştirilmiş CSC'ler immünojeniktir ve lysates'leri seçilmemiş tümör hücresi lisat darbeli PCC'lere kıyasla aşı olarak DC'lere yüklendiğinde daha etkili tümör koruyucu bağışıklığa neden olabilir.  Mekanistik olarak, koruma, CSC-reaktif antikorların ve T hücrelerinin8'in seçici indüksiyonunun yanı sıra IFNφ ve GM-CSF gibi tip 1 sitokin üretimi ile sağlandı.
Dendritik hücre bazlı aşılar ve benimsenen T hücre transferi de dahil olmak üzere mevcut immünoterapilerin çoğu tümör farklılaşmış antijenleri hedeflemek için tasarlanmıştır. Bu farklılaştırılmış antijenleri ifade edemeyen CSC'ler bu immünolojik hedeflemeden kaçabilir. Buna karşılık, özellikle kanser kök hücrelerini hedeflemek için tasarlanan CSC aşısı, kanser hücrelerinin bu özel popülasyonunu yok edebilir ve böylece tümörün nüks ve metastazını önleyerek aşının terapötik etkinliğini artırabilir.
Hem kültürlü tümör hücrelerinde hem de taze hasat edilen tümörlerde, yüksek aldehit dehidrogenaz aktivitesine dayalı akış sitometrisi ile CSC ile zenginleştirilmiş popülasyon belirledik. Bu tür ALDHyüksek hücreleri, CSC-TPDC'leri oluşturmak için DC'yi nabızlamak için bir antijen kaynağı olarak kullanılacak akış sıralama ile izole edilebilir. Kültürlü tümör hücrelerinden izole edilen ALDHyüksek hücrelerinin ve yeni hasat edilen tümörlerin karşılaştırılmasının, anti-CSC bağışıklığının indüksiyonu açısından önemli bir fark göstermedi8. Bu sonuçlar, kültürlü tümör hücrelerinden veya klinik uygulama için yeni hasat edilmiş tümörlerden izole edilmiş CSC'leri kullanma potansiyelini ortaya koydu.
Klinik olarak alakalı olması için, bir aşının terapötik bir ortamda incelenmesi gerekir. Bu deneyler şu anda laboratuvarımızda yapılmaktadır.

Kanser kök hücreleri geleneksel kemoterapi ve radyoterapiye nispeten dirençlidir1,2. Öte yandan, bu hücre popülasyonu, geleneksel kanser tedavilerinden sonra kanserlerin nüks etmesinden ve ilerlemesinden sorumlu hücreler olabilir1-4. Farklılaştırılmış tümör antijenlerinin kanser kök hücreleri üzerinde ifade eksikliği nedeniyle, kanser kök hücreleri, çoğunlukla farklılaştırılmış tümör hücreleri üzerindeki antijenleri hedeflemek için tasarlanmış olan kanser tedavisinin mevcut immünolojik müdahalelerinden kaçabilir. Bu nedenle, özellikle kanser kök hücrelerini hedef alan ve yok eden yeni stratejilerin geliştirilmesi, mevcut kanser tedavisinin terapötik etkinliğini artırmaya yönelik sözler verebilir. Bu amaçla, iki hayvan tümöründen (melanom D5 ve skuamöz hücreli kanser SCC7) kanser kök hücre (CSC) zenginleştirilmiş popülasyonları izole ettik ve CSC-TPDC aşısını hazırlamak için antijen sunum hücrelerini (dendritik hücreler, DC) nabızlamak için bir antijen kaynağı olarak kullandık. Daha sonra CSC-TPDC aşısının indüklediği antitümör bağışıklığı sırasıyla singeneik immün yetmetik konakçılarda, B6 farelerde ve C3H farelerinde değerlendirdik. CSC-TPDC kaynaklı antitümör etkinliği, daha önce grubumuz5,6tarafından kullanılan sıralanmamış heterojen tümör hücrelerinden (H-TPDC) ve diğer araştırmacılar tarafından hem klinik öncesi çalışmalarda hem de klinik çalışmalarda7 ile atımlı geleneksel DC aşısı ile karşılaştırıldı.

<table><tbody><tr><td>ALDHEFLOUR KİTİ</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>1700</td><td></td></tr><tr><td>Murine IL-4</td><td>Pepro Tech</td><td>214-14</td><td></td></tr><tr><td>Murine GM-CSF</td><td>Pepro Tech</td><td>315-03</td><td></td></tr><tr><td>Fare GM-CSF ELISA KIT</td><td>BD Biosciences</td><td>555167</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep Yoğunluk Gradyan Orta</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D1556</td><td></td></tr><tr><td>BD OptEIA TMB Substratlı Reaktif Set</td><td>BD Biosciences</td><td>555214</td><td></td></tr><tr><td>Ekipmanları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACS Aria Hücre Sıralayıcı</td><td>BD Biosciences</td><td>336834</td><td></td></tr><tr><td>Kcjunior</td><td>Bio-Tek Instruments</td><td>176058</td><td></td></tr></tbody></table>

melanom ve skuamöz kanser kök hücreleri kullanılarak yeni bir dendritik hücre aşısının Üretilmesi

Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells

Murine melanom D5 syngeneic'ten C57BL/6 farelere ve Skuamöz kanser SCC7 singenetiğinden C3H farelerine kadar kanser kök hücre (CSC) ile zenginleştirilmiş popülasyonları aldefluor/ALDH'yi belirteç olarak kullanarak belirledik ve hücre lisatını dendritik hücreleri (DC) nabızlamak için antijen kaynağı olarak kullanarak immünojenikliklerini test ettik. ALDHyüksek CSClyazlarla nabız atan DC'ler, her iki modelde ve akciğer metastaz ayarında ve s.c'de sıralanmamış tüm tümör hücresi lysates'lerinin lysates'i ile nabız atan DC'lere göre önemli ölçüde daha yüksek koruyucu antitümör bağışıklığına neden oldu. sırasıyla tümör büyüme ayarı. Bu fenomen, CSC aşısı kaynaklı humoral ve hücresel anti-CSC yanıtlarından kaynaklandı. Özellikle, CSC-DC aşısına maruz kalan konakçıdan izole edilen splenositler, sıralanmamış tümör hücresi kalsat darbeli-DC aşısına maruz kalan konakçıdan izole edilen splenositlerden önemli ölçüde daha yüksek miktarda IFNφ ve GM-CSF üretti. Bu sonuçlar, adjuvan bir ortamda klinik kullanım için otolog CSC tabanlı terapötik aşı geliştirme çabalarını desteklemektadır.

ALDEFLUOR/ALDH,8-11multipl malignitelerde kök hücreleri izole etmek için tek bir belirteç olarak kullanılmıştır. ALDEFLUOR'u belirteç olarak kullanarak D5 ve SCC7 olmak üzere iki tümör modelinde kanser kök hücre ile zenginleştirilmiş popülasyonları belirledik. Murine melanom B16-D5 ve skuamöz hücreli kanser SCC7'de ALDEFLUOR+ hücreleri saptandı. ALDEFLUOR+ hücrelerinin kültürlü D5 ve SCC7 tümör hücre hatlarında sırasıyla yaklaşık %0,5 ve %5,2 katkıda bulunduğunu tespit ettik (Şekil 1). Kurulan tümörlerden yeni hasat edilen tümör hücreleri, ALDEFLUOR+ hücrelerinin varlığını doğrulamak için analiz edilmiştir. Şekil 1'dede gösterildiği gibi in vivo kurulan D5 ve SCC7 tümörlerinden ALDEFLUOR+ hücrelerinin sırasıyla %2,5'i ve %4,2'si vardı. Bu sıralanmış D5 ve SCC7 ALDEFLUOR+/ALDHyüksek popülasyonlarının tümörojenliği ve kendini yenileme kapasitesi, sırasıyla C57BL/6 ve C3H fareleri olan singeneik immün yetmezlik konağındadeğerlendirildi.
Hem hayvan çalışmalarında hem de klinik çalışmalarda nabız DC'lerine (H-TPDC) heterojen sıralanmamış tümör hücresi lysate kullandık5,6. CSC'lerin immünojenikliğini incelemek için, ALDHyüksek CSC ve darbeli DC'yi CSC-TPDC(Şekil 2)oluşturmak için CSC'lerin kalsatıyla izole ettik ve CSC-TPDC'nin tümör büyümesini önlemede yararlı bir etkisi olup olmadığını test etmek için H-TPDC'yi geleneksel bir kanser aşısı kontrolü olarak kullandık.
CSC-TPDC'nin neden olduğu koruyucu antitümör bağışıklığı inceleyerek CSC'lerin immünojenikliğini değerlendirdik. D5 modelinde, naif immün yetmecen fareler CSC-TPDC veya H-TPDC (aynı lisate: DC oranında) ile s.c aşılandı. Kontrol grupları salin (PBS) aldı. Son aşıdan bir hafta sonra, farelere intravenöz olarak(yani)sıralanmamış D5 tümör hücreleri ile meydan okundu ve akciğer metastazlarını numaralandırmak için akciğerler 3 hafta sonra hasat edildi. Tablo 1'degösterildiği gibi, PBS grubu ile karşılaştırıldığında, H-TPDC ile tedavi edilen fareler daha az akciğer metastazı geliştirdi. Daha da önemlisi, CSC-TPDC ile tedavi edilen fareler, yapılan her iki deneyde H-TPDC aşı grubuna göre önemli ölçüde daha az akciğer metastazlarına sahipti. SCC7 modelinde, normal C3H hayvanları sağ kanatta sırasıyla SCC7 CSC-TPDC veya H-TPDC ile s.c aşılandı ve ardından sol kanada sıralanmamış SCC7 tümör hücreleri s.c ile meydan okudu. PBS grubu ile karşılaştırıldığında, H-TPDC tümör büyümesine karşı mütevazı anti-tümör bağışıklığına neden oldu. Bununla birlikte, hem kontrol grubu hem de H-TPDC grubu ile karşılaştırıldığında CSC-TPDC ile tedavi edilen farelerde tümör büyümesinin önemli inhibisyonu vardı (p<0.05, Şekil 3). Bu sonuçlar, CSC'lerin tümör hücrelerinin zorluğuna karşı koruyucu bağışıklığı teşvik etmek için geleneksel sıralanmamış tümör hücrelerinden daha etkili bir antijen kaynağı olarak kullanılabileceğini göstermektedir.
Gözlemlenen CSC kaynaklı koruyucu antitümör bağışıklığının altında kalan mekanizmaları daha iyi anlamak için, deneylerin sonunda DC aşılarına maruz kalan hayvanlardan dalakları topladık. Dalak hücreleri daha sonra anti-CD3/CD28/IL-2 veya anti-CD3/CD28/IL-2 + LPS/anti-CD40 ile aktive edildi. Daha sonra sitokinlerin ve antikorların ekspresyonunun tespiti için kültür süpernatantları toplandı.  D5 CSC-TPDC veya SCC7 CSC-TPDC ile aşılanan hayvanlardan dalak hücreleri tarafından IFNφ ve GM-CSF'nin önemli ölçüde daha yüksek üretimleri vardı (Şekil 4). Ayrıca, D5 CSC-TPDC veya SCC7 CSC-TPDC ile aşılanan hayvanlardan toplanan LPS/anti-CD40 aktif dalak hücreleri ile D5 H-TPDC veya SCC7 H-TPDC ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde (p<0.05) daha yüksek IgG üretimi vardı. Bu antikorların sırasıyla D5 ve SCC7 CSC'lere bağlanarak yapıldığı tespit edildi ve bu tür bir bağlama, tamamlayıcı8varlığında CSC lizizine neden olabilir.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig1.jpg"> Şekil 1. Kültürlü ve yeni hasat edilmiş taze murine D5 melanom ve SCC7 skuamöz hücreli tümörlerde ALDHFLUOR+/ALDHyüksek popülasyonları saptanmıştır. Negatif kontrol olarak spesifik bir ALDH inhibitörü olan 50 mmol/L DEAB ile tedavi edilen tümör hücreleri kullanıldı.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig1highres.jpg" target="_blank">Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.</a> 
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig2.jpg"> Şekil 2. Dendritik hücre bazlı kanser kök hücre aşılarının üretimi. CSC-TPDC ve H-TPDC'nin hazırlanması için kemik iliği türevi dendritik hücreler sırasıyla ALDHyüksek veya sıralanmamış tümör hücrelyatları ile nabızlandı.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig2highres.jpg" target="_blank">Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.</a> 
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig3.jpg"> Şekil 3. CSC lysate pulsed DC (CSC-TPDC) aşısı s.c daha etkili koruyucu antitümör bağışıklığına neden olabilir. SCC7 tümör modeli. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig3highres.jpg" target="_blank">Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.</a> 

<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig4.jpg"> Şekil 4. CSC-TPDC ile aşılanan immün yetmsiz konakta daha güçlü sistemik hücresel yanıtlar.  Dalaklar H-TPDC veya CSC-TPDC aşısına tabi tutulan hayvanlardan hasat edildi ve belirtildiği gibi aktive edildi. Kültür süpernatantları daha sonra ELISA kullanılarak sitokin tespiti için toplandı.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig4highres.jpg" target="_blank">Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.</a>

Singeneik immün yetmetik konakçılarda değerlendirilen kanser kök hücre (KSS) bazlı dendritik hücre (DC) aşısı, heterojen dökme tümör hücreleri ile nabızlanan geleneksel DC aşılarına göre önemli ölçüde daha yüksek antitümör bağışıklık göstermiştir.

Melanom ve Skuamöz Kanser Kök Hücreleri Kullanılarak Yeni Bir Dendritik Hücre aşısının Üretilmesi

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H ...

Bu prosedürün genel amacı, immünokompetan bir konakçıda, kanser kök hücresi veya CSC tabanlı bir dendritik hücre veya DC aşısının antitümör immünitesini değerlendirmektir. Bu işlem, öncelikle heterojen tümör hücrelerinden alor pozitif aldehit dehidrogenaz veya A LDH yüksek CSC'lerin izole edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, CSC DC'ler izole edilir ve ardından aşı için lizat ile pulse edilir.Ardından, CSC lizatı yüklü DC veya TP DC aşısı, normal sinjenik immünokompetan konakçılara uygulanır. Daha sonra son adımda, C-S-C-T-P-D-C aşısının koruyucu anti-tümör etkinliği değerlendirilir. Son olarak, konakçı T-hücreleri ve antikorlar tarafından oluşturulan C-S-C-T-P-D-C aşısı kaynaklı anti-CSC immünitesini değerlendirmek için ELISA gerçekleştirilebilir.Bu proje, kanser araştırmalarının en heyecan verici iki alanını, kanser kök hücreleri ve tümör immünoterapisi alanlarını bir araya getirmektedir. Laboratuvarımız, katı tümörlerdeki kanser kök hücrelerini keşfeden ilk merkezlerden biriydi. Bunlar, kanserin büyümesini ve metastazını yönlendiren kanser tohumlarıdır.Bugün, bu kanser kök hücrelerini spesifik olarak hedeflemek için immünoterapi kullanan yeni bir yaklaşım göreceksiniz. Alde fluoro analizi ile tespit edilebilen aldehit dehidrogenaz adlı özel bir belirteç kullanıyoruz. Doktor Lin Liu ve Huon Tau'nun Dr. Chow Lee ile birlikte çalıştığını göreceksiniz.Bu kanser kök hücrelerini hedefleyerek birçok kanser türündeki hastaların sonuçlarını iyileştirmeyi umuyoruz. İlgili tümör hücrelerini 1 × 10⁶ hücre/mL konsantrasyonda bir alor analiz tamponunda süspanse ederek başlayın. Ardından, tümör hücrelerinin 3 mL'si dışındakileri örnek tüplerinin her birine aktarın ve dört adet 12 × 75 mm polistiren kontrol test tüpünü şu şekilde etiketleyin: boyanmamış, alor, ALOR + DEAB ve 7-AAD. Hücre süspansiyonundan 1 mL'sini boyanmamış ve 7-AAD tüplerine, 2 mL'sini ise alor tüpüne dağıtın.Ardından, ALOR artı DEAB tüpüne beş µL DEAB ekleyin. Tüpleri buza yerleştirin ve ardından ALOR tüpüne 10 µL aktive edilmiş ALOR substratı ekleyerek karıştırın. Substrat çözeltisinden bir mL'yi hemen ALOR artı DEAB tüpüne aktarın ve ardından her bir örnek tüpüne 1 milyon hücre başına iki µL aktive edilmiş ALOR substratı ekleyin.Tüm tüpleri 37 °C'lik bir su banyosunda 30 dakika inkübe edin, ardından 7-AAD tüpüne beş µL 7-AAD ve her bir örnek tüpüne 1 milyon hücre başına bir µL 7-AAD ekleyin. Bu tüpleri 10 dakika boyunca 4 °C'de bekletin. Tüm tüpleri oda sıcaklığında 250 ×g'de beş dakika santrifüj edin ve pelletleri, floresanla aktive edilmiş hücre seçimi (FACS) için AldeFluor analiz tamponunda yeniden süspande edin.Sıralama kapılarını ayarlamak için, negatif kontrol olarak alde Fluor plus DEAB hücrelerini ve canlılık kontrolü olarak yedi A a D boyanmış hücreleri kullanın. Bu kontrollere dayanarak, alor pozitif A LDH, yüksek D beş ve SCC yedi hücrelerini ayırt etmek için bir kapı belirleyin. Ardından, örnek hücrelerini alor pozitif A LDH, yüksek D beş ve SCC yedi popülasyonlarına sıralamak için bunu kullanın.Dendritik hücreleri üretmek için öncelikle bir C 57 black six ve bir C3 H faresinden femur ve tibia kemiklerini izole edin. Kemikleri oda sıcaklığında bir dakika boyunca %75 etanol ile sterilize edin ve ardından HBSS ile yıkayın. Sonra, kemiklerin uçlarını kesin ve ardından kemik iliğini bir Petri kabına boşaltmak için 21 gauge iğne takılmış 10 mililitrelik bir şırınga kullanın; tek hücreli bir süspansiyon oluşturmak için hücreleri birkaç kez aspire edip dağıtın ve ardından hücreleri santrifüjle çöktürün.Peleti, beş mililitre eritrosit lizis tamponu içerisinde, 37 °C sıcaklıktaki su banyosunda bir dakika boyunca inkübe edin. Hücreleri saydıktan sonra, hacmi G-M-C-S-F ve IL-4 ile takviye edilmiş kültür ortamında mililitre başına 1 × 10⁶ hücre olacak şekilde ayarlayın. Ardından hücreleri 37 °C ve %5 CO2 ortamında kültüre edin; besiyerini ve sitokinleri üç gün sonra yenileyin.Beşinci günde, olgunlaşmamış dendritik hücreleri hasat edin. Hücreleri çöktürdükten sonra, peletleri beş mililitre kültür ortamında yeniden süspande edin ve ardından hücre süspansiyonunu taze hazırlanmış izolasyon ortamının üzerine yavaşça katmanlayın. Hücreleri tekrar santrifüjledikten sonra, kültür ortamı ile izolasyon ortamı katmanları arasında kalan dc'leri toplayın.Ardından hücreleri saydıktan sonra, hacmi; G-M-C-S-F ve IL 4 ile desteklenmiş kültür ortamında 1 × 10⁶ hücre/mL konsantrasyonuna ayarlayın; şimdi sıralanan hücreleri dört kez hızlı dondurma-çözme döngülerine tabi tutarak ve ardından lizatların membran kısmını toplamak için santrifüj işlemi uygulayarak tümör lizatlarını hazırlayın. Daha sonra, CSC TPC'lerini hazırlamak için DCS'leri, sıralanmış otolog A LDH yüksek hücrelerden elde edilen lizat ile pulse edin.H-T-P-D-C pulsunu hazırlamak için, deneysel alıcı hayvanları aşılamak amacıyla sıralanmamış heterojen tümör hücre lizatı ile yüklenmiş dcs'den, 100 µL PBS içinde süspanse edilmiş 1 × 10⁶ puls hücreyi her farenin sol yan tarafına deri altına enjekte edin; aşılamadan sonra, C 57 black six alıcı fareleri challenge etmek için 100 µL PBS içinde 1 × 10⁵ heterojen D five tümör hücresini intravenöz olarak uygulayın. SCC seven modeli için, DC aşısının karşı tarafına 100 µL PBS içinde 1 × 10⁶ sıralanmamış SCC seven tümör hücresini C3 H alıcı farelere deri altına enjekte ederek challenge işlemini gerçekleştirin.Alıcı C3 H farelerinin dalaklarından tek hücre süspansiyonu hazırlayın. Ardından, dalak T ve B hücrelerini, uygun stimülanlarla desteklenmiş kültür ortamında immobilize anti CD 3 ve anti CD 28 monoklonal antikorlarla aktive edin. Dört gün sonra süpernatantları toplayın ve ardından ELISA plaklarını 4 °C'de gece boyunca interferon gamma, G-M-CSF veya IgG'ye karşı antikorlarla kaplayın. Ertesi gün plakları non-spesifik bağlanmayı önlemek için bloke edin; standartları ve yeni toplanan süpernatantları ekleyin ve ardından plakları oda sıcaklığında inkübe edin. Yıkama işleminden sonra HRP deteksiyon antikorunu bir saat boyunca ekleyin ve ardından TMB substratını ilave edin.Son olarak, reaksiyonu durdurduktan sonraki 30 dakika içinde bir ELISA plak okuyucusu ile 450 nanometrede absorbansı ölçün. Alor, aralarında kanser kök hücresi açısından zenginleştirilmiş D beş ve SCC yedi popülasyonlarının da bulunduğu çok sayıda malignitede kök hücreleri izole etmek için bir belirteç olarak kullanılmıştır; özellikle bu nokta grafiklerinde gösterildiği üzere, alor pozitif hücreler kültüre edilmiş D beş ve SCC yedi tümör hücre hatlarının sırasıyla yaklaşık %0,5'ini ve %5,2'sini oluşturmaktadır. Yeni hasat edilmiş tümör hücrelerinin ise, in vivo olarak oluşturulan D beş ve SCC yedi tümörlerinden sırasıyla %2,5 ve %4,2 oranında alor pozitif hücre içerdiği belirlenmiştir.D-E-A-B-A spesifik A LDH inhibitörü ile işlem görmüş tümör hücreleri negatif kontrol olarak kullanılmıştır. Kanser kök hücrelerin immünojenisitesi, az önce gösterilen aşılama modeli kullanılarak CSC TPC'ler tarafından indüklenen koruyucu antitümör immünite incelenerek değerlendirilmiştir. Bu tabloda gösterildiği üzere, H TPC'ler ile işlem gören fareler, sadece PBS ile işlem gören farelere kıyasla daha az akciğer metastazı geliştirmiştir.Önemli bir nokta olarak, CSCT PC'leri ile tedavi edilen fareler, sadece H-T-P-D-C veya PBS ile tedavi edilen hayvanlara kıyasla daha az akciğer metastazı göstermiştir. SCC seven modelinde, kontrol grubuyla karşılaştırıldığında, normal C3 H hayvanları az önce gösterildiği şekilde aşılanmıştır. H TPC'ler orta düzeyde anti-tümör immünite oluştururken, CSC TPC'ler belirgin bir tümör büyüme inhibisyonu sağlamıştır. Bu sonuçlar, tümör hücresi atağına karşı koruyucu immünite oluşturmak amacıyla DC'leri yüklemek için CSC'lerin, geleneksel olarak ayrıştırılmamış tümör hücrelerine kıyasla daha etkili bir antijen kaynağı olarak kullanılabileceğini göstermektedir.Gözlemlenen CSC kaynaklı koruyucu anti-tümör immünitesinin altında yatan mekanizmaları daha iyi anlamak için, DC aşılı hayvanlardan alınan sitositler aktive edilmiş ve sitokin üretimleri EISA ile ölçülmüştü; burada gösterildiği üzere, D beş CSC TPC'leri veya S CCC yedi CSC PC'leri ile aşılanan hayvanlardan elde edilen sitositlerde sitokin üretimi, D beş H TPC'leri veya SCC yedi HTC'leri ile aşılanan hayvanlardan elde edilenlere göre anlamlı derecede daha yüksekti. Bugün, kanser kök hücrelerini izole etmek için Alor deneyinin nasıl kullanılacağını gördünüz.Bu kanser kök hücreleri daha sonra dendritik hücrelerin kullanıldığı immünoterapiler geliştirmek için kullanılabilir. Tek başına veya mevcut tedavilerle kombinasyon halinde kullanılan bu immünoterapilerin, birçok kanser türü olan hastaların prognozunu iyileştirmesini umuyoruz.

generation-novel-dendritic-cell-vaccine-using-melanoma-squamous

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu videoda hücre bazlı bir tümör aşılama testi gösterilmektedir. Tümör oluşumu için intradermal olarak B16-F10 melanom hücreleri enjekte edilen bir fare, geliştirilen tümörün yakınında Flt3L sitokin salgılayan B16-F10 hücreleri ile aşılanır. Aşıdan salgılanan Flt3L, daha sonra lenf düğümlerindeki T hücrelerine tümör antijenleri sunan dendritik hücrelerin olgunlaşmasını ve çoğalmasını teşvik ederek hedeflenmiş bir anti-tümör bağışıklık tepkisini tetikler.

Bir fare modelinde tümör implantasyonu ve bir tümör aşısının enjeksiyonu

Tümör immünoterapide kullanım için otolog dendritik hücreler, çok sayıda (DC'ler) oluşturmak için en yaygın olarak kullanılan yöntem tarif edilmektedir. Gibi bir yöntem monositlerden DC'ler ayırt etmek için, IL-4 ve GM-CSF kullanır. Bu hastaya geri enjekte edilmeden önce olgunlaşmamış DC'lerin olgun ve daha sonra antijen ile yüklenir için uyarılır.

İmmünoterapi için Tümör Antijen-yüklü Olgun dendritik hücreler hazırlanması

Bu makale, birincil hücre kültürleri ve nasıl tümör hücrelerinden eritrositler ve fibroblastların kirlilikler çıkarmak için taze olarak elde edilen melanom doku hazırlanmasını tarif etmektedir. Son olarak, biz nasıl tarif...

Hasta Türetilen Hücre Kültürü ve CD133 İzolasyonu<sup&gt; +</supMelanom dan&gt; sağlayan olası Kanser Kök Hücreleri

Bu protokolün amacı, melanom tümörüne sızan lenfositlerin indüklenmiş pluripotent kök hücrelere yeniden programlanması için protokolü göstermektir.

İnsan Melanom tümör-süzücü lemfositler ile ilgili uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Bu makalede, üç boyutlu (3D) timik kültür sistemi tarafından tümör antijene özgü indüklenen pluripotent kök hücre kaynaklı timik göçmenler (iTE) oluşturmak için yeni bir yöntem açıklanmaktadır. iTE, proliferasyon, hafıza oluşumu ve tümör baskılanması kapasitesine sahip naif T hücreleri ile yakından ilişkili T hücrelerinin homojen bir alt kümesidir.

Üç boyutlu Timik Kültür Sistemi Murine indüklenen Pluripotent Kök Hücre kaynaklı Tümör Antijen-spesifik Timik Emigrants oluşturmak için

Transimmünizasyon (TI) cihaz veya plaka ve ilgili protokoller, deneysel bir ortamda, ekstrorporeal fotokemoterapi (ECP) temel özelliklerini çoğaltmak için geliştirilmiştir, fizyolojik olarak aktif, ayarlanabilir dendritik üretimi için izin kanser immünoterapi için hücreler (DCs).

Fizyoloji Immunogenic dendritik hücreler oluşturma için yeni protokol

Bu makalede, OP9/DLL1 co-kültür sistemini kullanarak fonksiyonel tümör antijene özgü indüklenen pluripotent kök hücre türetilmiş CD8αβ+ tek pozitif T hücreleri oluşturmak için bir yöntem açıklanmaktadır.

Tümör Antijene Özgü T Hücrelerinin Üretimi için İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Kullanılması

Burada sunulan kök hücre kaynaklı viral antijen (Ag) özgü T lenfositlerin benimseyen hücre transferi (ACT) kullanarak farelerde hepatit B virüsü (HBV) replikasyonu nun etkin bastırılması için bir protokoldür. Bu işlem HBV enfeksiyonunun act tabanlı potansiyel immünoterapisi için uyarlanabilir.

Kök Hücre Kaynaklı Viral Ag-Spesifik T Lenfositler Farelerde HBV Replikasyonlarını Baskılar

Protokol, Flt3L eksprese eden B16-F10 melanomu ile hücre bazlı tümör aşılamasını kullanan bir kanser immünoterapi modeli sunmaktadır. Bu protokol, kültürlenmiş tümör hücrelerinin hazırlanması, tümör implantasyonu, hücre ışınlaması, tümör büyümesinin ölçülmesi, intratümöral immün hücrelerin izolasyonu ve akış sitometrisi analizi dahil olmak üzere prosedürleri göstermektedir.

Hematopoetik Sitokin ile Tümör Aşılaması Kullanılarak Deneysel Melanom İmmünoterapi Modeli

Bir sialidaz tedavisi kullanılarak izole edilmiş periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC'ler) de-sialillenmiş insan monosit türevli dendritik hücreler (mo-DC'ler) oluşturmak için benzersiz, kapsamlı bir protokol sunulmaktadır. Ayrıca, mo-DC'lerin fenotipik ve fonksiyonel karakterizasyonunu değerlendirmek ve sialidaz tedavisinin mo-DC'lerin olgunlaşma seviyesini nasıl iyileştirdiğini değerlendirmek için yöntemler açıklanmaktadır.

Farklı Sialillenmiş Fenotiplere Sahip Monosit Kaynaklı Dendritik Hücrelerin Üretimi

Bu protokol, fare kanseri hücrelerinin, transkripsiyon faktörleri PU.1, IRF8 ve BATF3'ün zorunlu ekspresyonu yoluyla tümör mikroçevresi içinde tip 1 dendritik benzeri hücrelere in vivo olarak yeniden programlanmasını tanımlar.

Tümör Hücrelerinin Tip 1 Konvansiyonel Dendritik Hücre Benzeri Hücrelere İzlenebilir İn Vivo Yeniden Programlanması

Öğrenin kanser kök hücreleri kullanılarak dendritik hücre aşısı üretme yöntemini. ALDH yüksek hücreleri izole edip aşıyı hazırlayarak antitümör bağışıklığı değerlendirin.

Melanom ve Skuamöz Kanser Kök Hücreleri Kullanılarak Yeni Bir Dendritik Hücre aşısının Üretilmesi

Daha fazla video keşfet