Name: Protein silinmesi indüksiyonu yoluyla In Utero Elektroporasyon Transgenik Modelleri Nöronal Göç Açıkları tanımlayın (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 1 s
Description: Öğrenin transgenik fare modellerinde in utero elektroporasyon ile nöronal göç ve gelişim kusurlarını analiz etme yöntemini. CRE aracılı gen eksizyonu ve hücre özerkliği çalışmaları için etkili bir tekniktir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

In utero elektroporasyon konusundaki yardımları için Pierre Mattar ve Freda Miller'a ve diyagramlar oluşturdukları için Noel Ghanem ve Bensun Fong'a minnettarız. Mükemmel teknik yardım için Linda Jui ve Jason G. MacLaurin'e teşekkür ederiz. Ekipman, İnme Kurtarma Merkezi tarafından desteklendi.
Bu çalışma, HSFO ve OGS'den D.S.S.'ye verilen bir burs ve R.S.S.'ye bir CIHR hibesi ile desteklenmiştir.

NOT: Tüm deneyler Hayvan Bakımı Kanada Konseyi Rehberi bağlı kalarak, Ottawa Hayvan Bakım etik kurul Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. 1. Ön cerrahi hazırlanması ve Malzeme <ol><li> Plazmid hazırlanması: <ol><li> Üreticinin protokolüne göre Qiagen MegaPrep kullanılarak plazmidler hazırlayın. Yüksek DNA verimi sağlar ve bir gece boyunca inkübe etmek, transforme edilen bakterilerden LB et suyu, en az 400 ml aşılanmasında. </li><li> En az 5 ug / ml&#39;lik bir son konsantrasyona kadar, 100-200 ul TE içinde yeniden süspanse plazmid. -20 ° C&#39;de kısım, DNA ve saklayın. Konsantrasyonu çok düşük ise, çökmez ve bu kirlilikleri ekleyebilirsiniz olarak tekrar süspansiyon. Yeni bir hazırlık üzerine başlayın. </li><li> Ameliyat öncesi% 0.1 seyreltilmiş plazma çözeltisi 10 ya da 20 ul başına (ağırlık / hacim) hızlı yeşil boya 1 ul steril su içinde 2 ug / ml tek bir plazmid (örneğin Kre-GFP) seyreltin. GFP EğerGFP ile işaretlenmiş tüm hücreler hem de-elektroporasyona CO ihtimalini en üst düzeye çıkarmak için 4: ve ilgi konusu genin, GFP plazmidi ve 1 arasında bir oranda ilgilenilen geni taşıyan plazmid enjekte ayrı plasmidler üzerindeki birlikte elektropore edilecekse plazmidler. </li></ol></li><li> 62 ° C &#39;de bir tek aşamalı çekme kullanılarak, standart bir iğne çektirmenin - Cam Mikro kapiller tüpler (bundan sonra iğneler olarak adlandırılır 1 mm dış çapında) çekin. </li><li> Aşağıdaki içeren bir cerrahi paketi Otoklav: iğne sahipleri, yara retraktör, forseps, cerrahi makas, iğne için makas, zımba, zımba, gazlı bez, yara örtüleri, cerrahi örtüler (Şekil 1A, B; Malzeme Tablosu). </li><li> Diğer gerekli araçları toplayın: Electroporator, FemtoJet Microinjecter, Tweezertrodes (5 veya 7 mm), tuzlu, dikiş, 5 ml şırınga (Malzeme Tablo). </li></ol> 2. Cerrahi Fare hazırlayın <ol><li> Ağrı yönetimi için, bir zamanlanmış-p enjektebir saat ameliyat öncesi Buprenorfin (0.05 mg / kg vücut ağırlığı) ile regnant fare. E17.5 embriyonik gün 12.5 (E12.5) yerden zamanlanmış farelere bu protokolü uygulayın. </li><li> Arka yük için Microloader pipet ipuçlarını kullanın plazmid çözümü ile iğne çekti. Bu iğne tıkalı hale gelmesine neden olacaktır henüz iğne ucu içine tüm yol doldurmayın. </li><li> 1 L / dk O 2 ile% 2-5 izofluran gaz kullanarak fare uyuşturan. Bir kez hareketsiz, yüz maskesi yerleştirmek ve kurumasını önlemek için gözlere merhem uygulayın. 1 ml tuzlu suda arka (% 0.9 NaCl), deri altından enjekte edilir. NOT: izofluran gaz ile çalışırken, aşırı gaz hatırlamak ve odasına kaçmasını önlemek için gaz süpürücü kullanın. </li><li> Karın Tıraş. , Chlorohexadine fırçalayın ile karın yıkayın su ile durulayın ve chlorohexadine ve% 70 etanol son hazırlık çözümü uygulayın. Steril örtü veya gazlı bez ile kapak fare kürk kapsayacak, ancak karın maruz (Şekil 1C, D) terk etmek. </li></ol>utero Elektroporasyon olarak <ol><li> Alt meme arasındaki karın üzerinde deride bir kesi yapmak. Bağ dokusu yırtılarak alttaki kas tabakasından cilt çekin, sonra linea alba boyunca karın boşluğuna periton kesti. Ayrı yara kenarlarını çekmek için yara ekartörünü yerleştirin. </li><li> Karın boşluğundan rahim çıkarın ve gösterilen (Şekil 1E) olarak ortaya koymak. <ol><li> Farklı yavrular (örneğin, ilgi konusu gen ile GFP genel GFP gibi), farklı plazmitler ile enjekte edilecek ise, her iki tarafta yavrular sayısı ve her bir plasmid ile kaç enjekte hangilerinin ve karar verirler. Geri sıcak ve yağlanmış embriyolar tutmak için karın içine rahim bir tarafını değiştirin. Hemen serum fizyolojik ile maruz rahim (tercihen vücut sıcaklığına ısıtılmış) nemlendirin. </li><li> Aynı plazmid tüm yavrular enjekte Eğer haftaları (örneğin transgenik embriyolar içine Kre-GFP enjekte olduğu gibi)Y aynı anda rahim bir boynuz çıkarın. </li></ol></li><li> Küçük cerrahi makas veya ince forseps bir çift ile ucu kesilmiş dikkatle enjeksiyon değnek kavrama kafasına dolu bir iğne koyun ve. Henüz akışkan bir (Şekil 1Ji-iv) geçmesine izin verirken, iğne sürece mümkün kalması ucu kesilir. <ol><li> Ayak kürek basıldığında 0.1-0.2 ul küçük ama kolayca görülebilir damlacık iğne ucu görünür şekilde mikropüskürtücü (saniye cinsinden) enjeksiyonu uzunluğunu ve enjeksiyon basıncını ayarlayın. Farklı iğneler arasında mümkün olduğunca tutarlı Bu damlacık hacmini tutun. NOT: Bu adım, embriyo hayatta (tartışma) için önemlidir. </li><li> FemtoJet için aşağıdaki enjeksiyon parametrelerini kullanın: basınç enjekte (pi) = 250-300 hPa; Enjeksiyon süresi (ti) = 0.8-1.2 sn; tazminat basıncı = 10-50 hPa. Gerekirse, iğneler arasında bir farklılaşmanın düzeltileceği bu parametreleri ayarlamak. </li></ol></li><li> SBir embriyo seçme ve yavaşça arka, yukarı eğimli kafa (Şekil 1F) üzerine yerleştirin. NOT: Bu dönüm veya embriyo değişen gerektirebilir; Çok fazla baskı uygulamak ve embriyo manipüle ederken amniyon kesesinin yırtılması önlemek için dikkatli olun. </li><li> Embriyo yerleştirildikten sonra, sagital sinüs bir hilal şeklinde gölge paralel olarak sunuyor ventrikül bulun. Hafif bir açıyla ventrikül üzerindeki rahim iğne ucu dokunun ve rahim duvarından iğne rehberlik. Gerekli basmç miktarı iğne netlik bağlıdır. Ventrikül içine korteks ile iğne itin. NOT: nadiren herhangi bir ek saptanabilir direnç olmasına rağmen, embriyonun kafası genellikle biraz uzağa itti ve sonra iğne ventrikül içine korteks geçerken geri teper. </li><li> Plazmid çözüm enjekte etmek için ayak raket Pompa. Yeşil alan görünen ve uygun kadar pompalamaya devamventrikül (Şekil 1G) ark şekli. Genç embriyoların (E14.5 E12.5 için) boya genellikle karşı ventrikül içine nüfuz edecek. Not: pompa sayısı iğne ucu çapına bağlıdır, embriyo (ve karıncığın elde edilen boyutu) ve istenilen enjeksiyon hacmi yaşı. Hacmi tutun embriyolar arasında mümkün olduğunca tutarlı enjekte. </li><li> Üç ya da dört embriyolar enjekte edilir. Prosedür boyunca tuzlu su ile nemli tüm maruz embriyolar tutun. </li><li> Geri enjekte ilk embriyoların gidin ve pozitif elektrot beynin (Şekil 1 H) istenen bölgeye plazmid çekecektir böyle kürekler yerleştirin. Açı negatif elektrot için elektrotlar arasındaki en kısa yol elektroporasyon için hedef yapı (Şekil 2) içinden geçer. </li><li> Kürekler yerdesiniz kez, şok uygulanır. Embriyoların yaş ve boyutuna bağlı olarak, 35-50 V 5 bakliyat kullanın (T bkzmümkün 1). Aşağıdaki elektroporasyon parametreleri kullanın: 5 msn darbe uzunluğu 950 msn darbe aralığı ile. Tüm enjekte embriyolar ile tekrarlayın. </li><li> Geçen iğne olasılıkla kurutulmuş ve adım 3.9 sırasında tıkanmış gibi adım 3.3 gibi yeni ön-yüklenmiş iğne ucu kesin. Aynı plasmid ya da farklı bir plazmid ya da üç ya da dört embriyo sonraki resim enjekte edilir ve daha sonra adım 3.9 olarak darbe uygulanır. Rahim bir tarafında tüm yavrular enjekte edildiğinde, dişinin karın rahim ikinci tarafını kaldırın ve daha sonra sıcak tutmak için tamamlanmış tarafı değiştirin. </li><li> Amnion kesesi travma önlemek için çok fazla baskı uygulamak için tuzlu su ile değil, nemli yüzey tutmak için dikkatli olmak kadın rahim her iki tarafını dön. Basit bir sürekli dikiş kullanılarak kapatıldı kas tabakası dikin. Zımba cilt kapattı. Zımba mevcut değilse, basit bir kesintiye dikiş ile cilt sütür. (Şekil 1 H) </li><li> Suturi dang, giderek hamile dişinin anestezi hafifletmek için izin izofluran aşağı çevirin. NOT: Ameliyat tamamlandıktan sonra bu barajın uyarılma hızlandırmak olacaktır; embriyo yaşam artıracak mümkün olduğunca kısa bir süre için anestezi kadın tutmak. Toplam ameliyat süresi, kadın ilk kez anestezi ne zaman başlayarak, yaklaşık 30 dakika olmalıdır. </li></ol> 4. Sonrası Bakım <ol><li> Bir inkübatör veya anestezi kurtarmak için bir ısıtma pedi üzerinde dikildi kadın yerleştirin. Temiz yatak onu yatak ve kafes içinde standart bir toparlanma jel hidrasyon korumak yerleştirin. Cerrahi sonrası ağrı tedavisi için, daha sonra ameliyat sonrası 8 saat aralıklarla, 12 saat aralıklarla dört ek dozlar en Buprenorfin (0.05 mg / kg vücut ağırlığı) bir kadın üç doz vermek. </li></ol> 5. Hasat Brain NOT: Brain yetişkinliğe herhangi bir yaş kadar hasat edilebilir. şu geçerlidirdoğumdan önce beyinleri toplamak için. Yavrular dünyaya bir kez, rahim içinde sipariş çöp her yavru ya aynı plazmid ile enjekte edilmelidir, böylece kaybolur, ya da kontrol ve deney hayvanlar arasındaki farklılaşma başka bir yöntem icat gerektiğini unutmayın. <ol><li> Soğuk (4 ° C) Hazırlama kadın ötenazi önce% 4 paraformaldehid (PFA) filtre edilmiştir. </li><li> Sodyum pentobarbital (100 mg / kg vücut ağırlığı) öldürücü bir dozda intraperitonal enjeksiyonu ile dişi öldürülür ve açık karın kesti. Rahim iki tarafını çekin ve yavrular başlangıçta enjekte edildiğinde olarak yatıyordu. <ol><li> Tüm yavrular gibi bir transgenik çöp içine Cre enjekte ederken aynı plazmid, alınan durumunda, embriyo sırası nedenle PBS içinde kadın ve yersiz rahim kesmek, önemli değil. </li><li> Yavrular farklı plazmid ile enjekte olsaydı, herhangi bir ölü yavrular belirterek, her yavru bulmak için emin olun, kontrol ve experimen enjekte edildi hangilerinin belirlemekkadın rahim çıkarmadan önce tal plazmidler. Yavru uterus PBS içinde hangi grup daha sonra ait olduğu izlemek için dikkatli olun. </li></ol></li><li> Her biri tek tek yavru çıkarın keskin bir makas veya bir tıraş bıçağı ile başını kesmek ve PBS içinde kafa yerleştirin. Transgenik farelerin durumunda, genotipleme için doku numuneleri toplamak ve bir 12-çukurlu plaka içindeki gibi, ayrı ayrı her bir kafayı tutun. </li><li> Diseksiyon kapsamında, değil nick dikkatli olmak, kafatası korteks beyin kaldırmak veya orta hat gözyaşı. Bir floresan mikroskop kullanarak, başarılı elektropore belirten, beyinleri bir GFP + yama olup olmadığını görmek için kontrol edin. </li><li> Gece boyunca 4 ° C&#39;de PFA içine daldırma ile beyin sabitleyin. NOT: PFA sık sık sinyal doyurur çünkü önce tespite GFP ifade beyinlerini kontrol edin. </li><li> Dondurulmadan önce en az üç gün boyunca% 20 sukroz içinde daldırma yoluyla cryoprotect beyinleri. T sükroz% 10 gradyan,% 15 ve% 20 (her bir çözelti içinde, 24 saat) kullanarakO ozmotik basınca bağlı doku hasarı önlemek. -80 ° C&#39;de dondurulmuş beyinleri saklayın ve 10-14 mikron kalınlığında kesitler bir kriyostat üzerinde kesti. </li></ol> Anti-GFP ile 6. Ortak boyama Not: antijen geri alma ko-leke anti-GFP ile gerekli ise, GFP sinyali ödün vermeyen hafif bir antijen geri alma protokolü kullanılması önemlidir. Bazı antijen alma protokolleri (hatta GFP karşı bir antikor ile) GFP boyama ile birlikte kullanmak için çok sert. Önce birincil antikor uygulaması temel sitrik asit ön-işlem, en epitoplar 24 için başarılı olur. <ol><li> GKD 2 O. sitrik asit 0.01 M bir solüsyon yapmak bir kalibre edilmiş pH metre kullanılarak 6 pH değerine sahiptir. </li><li> Sitrik asit kadar mikrodalga ya da su banyosu içinde boyanması odasındaki ısı sitrik asit, 75-80 ° C&#39;ye ulaştı. 10-15 dakika boyama odasında slaytlar koyun. Mümkün olduğunca istikrarlı olarak sıcaklığını muhafaza. </li><li> PBS slaytlar yıkayın3x, oda sıcaklığında 3 dakika daha karıştırıldı. Primer antikor uygulayın ve bir standart protokole göre immün devam edin. </li><li> (Şekil 3A) yıkmak onaylamak için GFP eş-etiketleme ve ilgi gen tarafından Cre aracılı eksizyon doğrulayın. </li></ol>

<ol><li>Hippenmeyer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathways+controlling+the+sequential+steps+of+cortical+projection+neuron+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular pathways controlling the sequential steps of cortical projection neuron migration.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 800, 1-24 (2014).</li>
<li>Evsyukova, I., Plestant, C., Anton, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+mechanisms+of+oriented+neuronal+migration+in+the+developing+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrative mechanisms of oriented neuronal migration in the developing brain.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 29, 299-353 (2013).</li>
<li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+neuronal+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">The dynamics of neuronal migration.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 800, 25-36 (2014).</li>
<li>McClellan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+requirement+for+Rb%2FE2F3+in+neuronal+migration%3A+evidence+for+cell+cycle-independent+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Unique requirement for Rb/E2F3 in neuronal migration: evidence for cell cycle-independent functions.</a> Mol. Cell. Biol. 27 (13), 4825-4843 (2007).</li>
<li>Nguyen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P27kip1+Independently+Promotes+Neuronal+Differentiation+and+Migration+in+the+Cerebral+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">P27kip1 Independently Promotes Neuronal Differentiation and Migration in the Cerebral Cortex.</a> Genes Dev. 20 (11), 1511-1524 (2006).</li>
<li>Svoboda, D. S., Paquin, A., Park, D. S., Slack, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pocket+proteins+pRb+and+p107+are+required+for+cortical+lamination+independent+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Pocket proteins pRb and p107 are required for cortical lamination independent of apoptosis.</a> Dev. Biol. 384 (1), 101-113 (2013).</li>
<li>Hashimoto-Torii, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+Reelin+and+Notch+signaling+regulates+neuronal+migration+in+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Interaction between Reelin and Notch signaling regulates neuronal migration in the cerebral cortex.</a> Neuron. 60 (2), 273-284 (2008).</li>
<li>Ori-McKenney, K. M., Vallee, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+migration+defects+in+the+Loa+dynein+mutant+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Neuronal migration defects in the Loa dynein mutant mouse.</a> Neural Dev. 6, (2011).</li>
<li>Wang, H., Ge, G., Uchida, Y., Luu, B., Ahn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gli3+is+required+for+maintenance+and+fate+specification+of+cortical+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Gli3 is required for maintenance and fate specification of cortical progenitors.</a> J. Neurosci. 31 (17), 6440-6448 (2011).</li>
<li>Heng, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenin+2+controls+cortical+neuron+migration+through+regulation+of+Rnd2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neurogenin 2 controls cortical neuron migration through regulation of Rnd2.</a> Nature. 455 (7209), 114-118 (2008).</li>
<li>Alfano, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COUP-TFI+promotes+radial+migration+and+proper+morphology+of+callosal+projection+neurons+by+repressing+Rnd2+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">COUP-TFI promotes radial migration and proper morphology of callosal projection neurons by repressing Rnd2 expression.</a> Development. 138 (21), 4685-4697 (2011).</li>
<li>De Vry, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+of+the+central+nervous+system%3A+a+non-viral+approach+for+targeted+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery.</a> Prog. Neurobiol. 92 (3), 227-244 (2010).</li>
<li>Dixit, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+delivery+into+multiple+CNS+territories+using+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Efficient gene delivery into multiple CNS territories using in utero electroporation.</a> J. Vis. Exp. (52), (2011).</li>
<li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nat. Protoc. 1 (3), 1552-1558 (2006).</li>
<li>Elias, G. M., Elias, L. A., Apostolides, P. F., Kriegstein, A. R., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+trafficking+of+AMPA+and+NMDA+receptors+by+SAP102+and+PSD-95+underlies+synapse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Differential trafficking of AMPA and NMDA receptors by SAP102 and PSD-95 underlies synapse development.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (52), 20953-20958 (2008).</li>
<li>Bhuiyan, M. I., Lee, J. H., Kim, S. Y., Cho, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+exogenous+LIN28+contributes+to+proliferation+and+survival+of+mouse+primary+cortical+neurons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Expression of exogenous LIN28 contributes to proliferation and survival of mouse primary cortical neurons in vitro.</a> Neuroscience. 248C, 448-458 (2013).</li>
<li>Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+electroporation+followed+by+primary+neuronal+culture+for+studying+gene+function+in+subset+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons.</a> J. Vis. Exp. (44), (2010).</li>
<li>Yoshida, A., Yamaguchi, Y., Nonomura, K., Kawakami, K., Takahashi, Y., Miura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+expression+of+different+transgenes+in+neurons+and+glia+by+combining+in+utero+electroporation+with+the+Tol2+transposon-mediated+gene+transfer+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system.</a> Genes Cells. 15 (5), 501-512 (2010).</li>
<li>Miyagi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sox-2+regulatory+regions+display+their+activities+in+two+distinct+types+of+multipotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Sox-2 regulatory regions display their activities in two distinct types of multipotent stem cells.</a> Mol. Cell. Biol. 24 (10), 4207-4220 Forthcoming.</li>
<li>Wang, X., Qiu, R., Tsark, W., Lu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+promoter+analysis+in+developing+mouse+brain+and+genetic+labeling+of+young+neurons+by+doublecortin-DsRed-express%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Rapid promoter analysis in developing mouse brain and genetic labeling of young neurons by doublecortin-DsRed-express.</a> J. Neurosci. Res. 85 (16), 3567-3573 (2007).</li>
<li>LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+and+improved+tools+for+in+utero+electroporation+studies+of+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb.+Cortex%22%5BJournal%5D)">New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex.</a> Cereb. Cortex. 19, Suppl 1. 120-125 (2009).</li>
<li>Bouabe, H., Gene Okkenhaug, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((targeting+in+mice%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">targeting in mice: a review.</a> Methods Mol. Biol. 1064, 315-336 (2013).</li>
<li>Ferguson, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell-autonomous+requirement+for+the+cell+cycle+regulatory+protein%2C+Rb%2C+in+neuronal+migration%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">A cell-autonomous requirement for the cell cycle regulatory protein, Rb, in neuronal migration.</a> EMBO J. 24 (24), 4381-4391 (2005).</li>
<li>Lagace, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+contribution+of+nestin-expressing+stem+cells+to+adult+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dynamic contribution of nestin-expressing stem cells to adult neurogenesis.</a> J. Neurosci. 27 (46), 12623-12629 (2007).</li>
<li>Andrusiak, M. G., Vandenbosch, R., Park, D. S., Slack, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinoblastoma+protein+is+essential+for+survival+of+postmitotic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The retinoblastoma protein is essential for survival of postmitotic neurons.</a> J. Neurosci. 32 (42), 14809-14814 (2012).</li>
<li>Shan, B., Chang, C. Y., Jones, D., Lee, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+E2F-1+mediates+the+autoregulation+of+RB+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">The transcription factor E2F-1 mediates the autoregulation of RB gene expression.</a> Mol. Cell. Biol. 14 (1), 299-309 Forthcoming.</li>
<li>Ferland, R. J., Cherry, T. J., Preware, P. O., Morrisey, E. E., Walsh, C. A. Characterization of Foxp2 and Foxp1 mRNA and protein in the developing and mature brain. 460 (2), 266-279 (2003).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur

Utero electroporations performans birincil sorunlar iki embriyo öldürücü ve 2) electroporations arasındaki değişkenliği azaltarak engelliyor) 1 bulunmaktadır. Künt iğne embriyo daha fazla hasar gibi öldürücü önlemede en önemli faktörlerden biri, iğne kalitesidir. İğneyi keserken hala ayak kürek (Şekil 1J) bir pompa aşağıdaki görünmesini sıvı 0.1-0.2 ul görünür damlacık izin verirken, mümkün olduğunca uzun ucu tutun. İğne çok sıkıcı ya da şaft çok kısa ise, ortaya çıkan doku hasarı embr...

Radyal göç erken kortikal gelişim merkezi bir süreçtir. Bu tür doğru mitotik çıkış ve nöronal farklılaşması, hücre polarite, sitoskeletal dinamikleri ve zar-ötesi reseptörlerin ekspresyonunun düzenlenmesini, hem de bu tür bir radyal glial iskele oluşumu olmayan hücre otonom faktörleri ve hücre otonom faktörler, çeşitli bağlıdır göçmen rehberlik salgılanması 1-3 molekülleri. Bu mekanizmaların herhangi birinin bozulması beri karmaşık ve zor bir süreç olabilir göç bir kusur yatan nedenini belirlemek, bir transgenik fare modelinde 4-8 nöronal göç bozabilir. Utero elektroporasyon (İEÜ) olarak tamamlayacak ve basitleştirmek için kullanılabilir böylece genetik knock-out model fenotip ve yorumlanması radyal göç 7,9-11 için gerekli önemli mekanizmaları aydınlatmak. Utero elektroporasyon (İEÜ) süreci olan bir plazmid carryi tarafından<html> İlgili bir geni ve bir raportör hem ng bir fare veya sıçan embriyo beyninde ventrikül içine enjekte edilir ve daha sonra bir elektrik akımı 12-14 kullanımı ile ventrikül astar hücreleri içine çekilir. Bu araştırmacı yukarı veya geliştirme ya da Electroporated nöronların fonksiyonu ilgi bir gen düzenlenmesi aşağı etkisini analiz etmeyi sağlar. İEÜ sonra, beyinleri immunohistokimyasal 7,9-11, elektrofizyoloji 15 ya da hücre kültürü 16,17 için işlenebilir. İEÜ büyük avantajı, bu gen ekspresyonunun yüksek oranda spesifik müdahale edilebilmesini sağlar olmasıdır. Ayrıca, İUE yönlendirilmiş bir akım (Şekil 2) boyunca gelişen beynin belirli bir bölgeyi hedef için kullanılabilir. İUE çeşitli promotörler ya da plazmid tahrik sistemleri kontrolü altındaki genleri taşıyan plazmid enjeksiyonu yoluyla, belirli bir hücre türü hedef için kullanılabilir 10,18-21 (tetrasiklin ile uyarılan gen ifadesi bir örnektir). &gt; İUE Cre Lox aracılığıyla gen eksizyon sistemi 7-9,11,22 ile bağlantılı olarak kullanılabilir jove_content &quot;. Cre proteini için mesaj kodlayan bir gen içeren bir plazmid floxed alel için bir embriyo homozigot (elektroporasyona edilebilir olup, burada gen veya belirli DNA bölgeleri Cre aracılı DNA rekombinasyon, iki loxP sitelerinin) tarafından kuşatılmıştır. Cre daha sonra, spesifik elektroporasyona sinir ön ilgi konusu genin rekombinasyona neden olacaktır, ve floxed allele.The etkisinin bir knock-out üretilmesi sinir göç ve bireysel nöronlar içinde gelişimine demonte protein daha sonra incelenebilir. Cre Elektroporasyon sağlam destek ortamı terk etkilenen hücrelerin sadece küçük bir popülasyonda rekombinasyonu neden olur. Bunun tersine, belirli bir hücre tipinin kontrol altında Cre dokuya özgü sentezleme promotör, tüm dokusu boyunca meydana hem göç Nöroblastlar ve çevresini etkilenmiş olabileceğini. Böylece, Jux böyleceBu iki yaklaşımın taposition verilen göç kusur özerk ya da hücre dışı özerk mekanizmaları hücre bağlı olup olmadığını belirleyebilir. Her iki deneysel sistemlerde Arızalı göç anlaşılacağı bir hücre özerk mekanizması gözlemlenen fenotip sonuçları olduğunu; bir doku-spesifik Cre modelinde kusurlu göç Cre elektroporasyonu, aşağıdaki normal bir göç ilgi konusu gen, bir hücre olmayan bağımsız bir mekanizma yoluyla etki olduğunu gösterir. İEÜ da nakavt hayvanlar 7,9,10 içine potansiyel etkileşim genleri electroporating kurtarma deneyleri gerçekleştirmek için kullanılabilir. Örneğin, bir araştırmacı bir alt hedef electroporating ve göç kusur Electroporated nöronlar giderilmiştir ise belirleyerek bir transgenik modelinde bir göç fenotip kurtarmak için çalışabilir. Bu başarılı bir kurtarma normal bir göç SPE protein ifadesini manipüle tarafından restore edilebileceğini belirtir ek yararı vardır, spesifik nöron, çevredeki ortam hala hedeflenen gen için eksik olsa. Yine, bu yaklaşım daha fazla zaman ve kusurlu mekanizma hücre özerk olup olmadığını belirlemek yararı, transgenik çizgiler kapısı veya oluştururken daha maliyetli olduğunu. İUE nakavt embriyolar (Şekil 4C) bir haberci plazmid elektroporasyonu yoluyla nöronlar göç izlemek için kullanılabilir. Ameliyat sırasında ventrikül astar sadece nöronlar 17 elektropore olarak, İEÜ in vivo morfolojisi görselleştirme avantajı ile belirli bir zamanda doğmuş nöronlar takip etmek için kullanılabilir. Son olarak, bu tür orta veya dorsal telencephalon, hipokamp veya ganglionik eminensinden (Şekil 2) gibi beyin bölgeleri hedef IUE kullanmak mümkündür. Bu araştırmacılara komplikasyon sonuç belirli bir alanda bağımsız gen fonksiyonunu araştırmak için güç verirkomşu yapılarda demonte proteinden ing. Retinoblastoma proteini (pRb), p107 ve p130 cep protein ailesini oluşturan ve iyi hücre döngüsü çıkış regülatörleri kurulmuştur. Bununla birlikte, bu proteinler, aynı zamanda, nöral gelişimi, hücre döngüsü bağımsız yönlerini düzenleyen dair artan kanıtlar vardır. Daha önce görüldüğü gibi, pRb ve p107 hem teğet 4,23 ve radyal göç 6 önemli bir rol oynamaktadır. Burada, biz bir transgenik modeli Cre utero elektroporasyon kullanımını örneklendirmek için sinir göç 6 cep protein aile üyeleri pRb ve P107 rolünü göstermektedir. Özetle, İEÜ gen silme (veya aşırı ekspresyonu) hücre özerk etkilerini analiz güçlü bir yol sağlar. Modelleri nakavt özel dokusu ile kombine edildiğinde, İEÜ nöral göçü kontrol mekanizmaları ile ilgili ek bilgi sağlayabilir.

<table><tbody><tr><td>ECM 830 Kare Dalga Elektroporatörü</td><td>BTX Harvard Aparatı</td><td>45-0052</td><td>Yalnızca elektroporatör ve kabloları ayrı olarak satın alın (45-0204)</td></tr><tr><td>1250FS ECM 830</td><td>BTX Harvard Aparatı için Ayak Pedalı</td><td>45-0211</td><td>Eller serbest elektroporasyon için ayak kürek gereklidir</td></tr><tr><td>Cımbız</td><td>BTX Harvard Aparatı</td><td>45-0489 (5mm)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 45-0488 (7mm)</td> <td>Platin forsep tarzı elektrotlar</td></tr><tr><td>Femtojet</td><td>Eppendorf</td><td>920010504</td><td></td></tr><tr><td>Mikroenjektör Kavrama Kafası 0</td><td>Eppendorf</td><td>920007414</td><td>Çekilen iğneyi tutar</td></tr><tr><td>Üniversal Kılcal Tutucu</td><td>Eppendorf</td><td>920007392</td><td>Kavrama kafasını tüpe bağlar</td></tr><tr><td>Enjeksiyon Tüpü</td><td>Eppendorf</td><td>920007431</td><td>Kılcal tutucuyu Femtojet'e bağlar</td></tr><tr><td>Ayak Kumandası</td><td>Eppendorf</td><td>920005098</td><td>Eller serbest enjeksiyon için ayak küreği</td></tr><tr><td>Mikro Yükleyici Uçları</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td>Çekilen kılcal boruları yüklemek için uçlar</td></tr><tr><td>Plazmid Mega Kiti</td><td>Qiagen</td><td>12181</td><td>5 QIAGEN-tip 2500, Reaktifler, Tamponlar</td></tr><tr><td>Hızlı Yeşil FCF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252-5G</td><td>Toksik olmayan boya</td></tr><tr><td>Ekstra İnce Bonn Makas</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>14084-08</td><td>İğneleri kesmek için</td></tr><tr><td>Bonn Şaşılık Makas</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>14084-09</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11050-10</td><td>Düz</td></tr><tr><td>Colibri Ekartörler</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>17000-03</td><td></td></tr><tr><td>Zımba</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>12031-07</td><td>7mm klipsler için</td></tr><tr><td>Castroviejo İğne Tutucu</td><td>Tıbbi Aletler</td><td>SNH-6737</td><td>Düz, kilitli</td></tr><tr><td>İğne Çektirme</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td>Mikrokapilleri çekmek için</td></tr><tr><td>Mikrokılcal damarlar</td><td>Drummond</td><td>1-000-800</td><td>0,4 mm iç çaplı cam kılcal borular</td></tr></tbody></table>

protein silinmesi indüksiyonu yoluyla in utero elektroporasyon transgenik modelleri nöronal göç açıkları tanımlayın

Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models

Transgenik fare hatları Cre-Lox sistemini kullanarak Genetik silme protein fonksiyonunu incelemek için kullanılan güçlü bir araçtır. Bununla birlikte, çok özel Cre modellerinde dışında, bir doku veya hücre popülasyonu içinde bir proteinin silme genellikle birden fazla etkileşim mekanizmalardan kaynaklanan karmaşık fenotiplere yol açar. Söz konusu, ya da hücrenin çevre düşüklüğü kaynaklanabilecek olmayan bir hücre özerk bir mekanizma, gelen hücreye özgü bir hücre özerk mekanizmasının bozulması bir fenotip sonuçları, ayırt etmek zor olabilir olup olmadığını belirleme. Utero elektroporasyon, bir in vivo bağlamda protein işlevi anlamak için (İUE), gelişmekte olan korteks ya da seçilen diğer beyin bölgesi içindeki hücrelerin küçük bir alt grubu içerisinde, gen silme sağlar. İUE sırt telencephalon medial telencephalon, hipokampus veya ganglionik eminensinden da dahil olmak üzere spesifik beyin alanları, hedef için kullanılabilir. Bu gözlem o kolaylaştırırsağlıklı bir çevrede bağlamında hücre özerk gen silme sonuçları f. Bu protokolün amacı, İEÜ protein silme hücre özerk olmayan hücre özerk etkileri ayırt üzerinde durularak, floxed transgenik fare doğrultusunda radyal göç bir kusur analiz etmek nasıl kullanılabileceğini göstermektir. Beyin gelişiminde proteinin işlevi sınırlı hücre popülasyonunda İUE aracılı gen silme karşı tüm korteks içinde gen silme kaynaklanan fenotip, daha iyi bir fikir karşılaştırarak izolasyonu ya tekniği kullanılarak daha yüksek verim elde edilebilir.

Embriyonun başı üzerindeki palet elektrotların yönü değiştirilerek beynin farklı bölgeleri elektroporasyon için hedeflenebilir (Şekil 2). Ön beynin tüm kısımları için plazmit, lateral ventriküle enjekte edilir (arka beyin, dördüncü ventriküle enjekte edilerek hedeflenebilir). Genel olarak elektrotları, aralarındaki düz çizgi ilgilenilen bölgeden geçecek şekilde yerleştirin; DNA pozitif elektroda doğru çekilecektir. Lateral korteksi hedeflemek için (Şekil 2A), pozitif elektrodu hafif bir ...

Nöron göçü, çok sayıda hücre otonom ve hücre dışı otonom faktör tarafından düzenlenir. Bu protokol, transgenik bir faredeki bir fenotipin bir hücre içsel mekanizmasının bozulmasından mı yoksa nöron ile çevresi arasındaki etkileşimin bozulmasından mı kaynaklandığını belirlemek için utero elektroporasyonun nasıl kullanılabileceğini gösterir.

Protein silinmesi indüksiyonu yoluyla In Utero Elektroporasyon Transgenik Modelleri Nöronal Göç Açıkları tanımlayın

Genetic deletion using the Cre-Lox system in transgenic mouse lines is a powerful tool used to study protein function. However, except in very specific ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, embriyonik ön beynin çeşitli bölgelerinin in utero elektroporasyonunu kullanarak transgenik fare modellerinde nöral gelişim ve göçteki kusurları analiz etmektir. Bu, Cree için genleri taşıyan bir plazmid ve GFP gibi bir raportör proteinin embriyonik bir beynin ventrikülüne enjekte edilmesi ve bu plazmitin ventrikülün hücre zarına çekmek için kafaya bir elektrik akımı uygulanmasıyla elde edilir. İkinci bir adım olarak, embriyolar barajın karın boşluğuna geri gönderilir ve embriyoların gelişmeye devam etmesine izin verirken, kırışıklık eksprese edilir ve özellikle elektroporasyonlu nöronlarda gen eksizyonuna aracılık eder.Daha sonra embriyolar toplanır ve CRE aracılı gen eksizyonu ve ardından elektropore nöronlarda protein yıkımının etkisini belirlemek için beyinler analiz için sabitlenir, ilgilenilen genin eksizyonunun immünohisto kimyası kullanılarak hücreye özgü bir şekilde nöral gelişimi ve göçü nasıl düzenlediğini gösteren sonuçlar elde edilir. Bu tekniğin dokuya özgü transgenik CRE çizgileri gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, Cree'nin elektroporasyonunun ilgilenilen geni yalnızca araştırmacı tarafından seçilen beynin bir bölgesindeki küçük bir nöron popülasyonundan çıkarmasıdır, bu da sonuçları büyük ölçüde basitleştirir ve fenotip analizini kolaylaştırır. Bu tekniğin görsel olarak gösterilmesi çok önemlidir, çünkü cerrahi adımların öğrenilmesi çok zor olabilir ve bu aşamadaki embriyolar çok hassastır ve yanlışlıkla zarar görmesi kolaydır.Ameliyattan önce, tek bir plazmiti steril suda mikrolitre başına iki mikrograma kadar seyreltin, 10 veya 20 mikrolitre seyreltilmiş plazmit çözeltisi başına hacim başına ağırlık% 0.1 hızlı yeşil boya ile. Ardından, cam mikro kılcal tüpleri 62 santigrat derece tek adımda standart bir mikro pipet polarına çekin. Ardından, çekilen iğneleri plazmid solüsyonu ile geri yüklemek için mikro yükleyici pipet uçlarını kullanın.İğnenin tıkanmasına neden olacağı için iğnenin ucunu tamamen doldurmayın. Bu prosedürde, anestezi uygulanmış bir hamile farenin alt tetleri arasında karın üzerindeki deride bir kesi yapın. Bağ dokusunu yırtarak cildi alttaki kas tabakasından uzaklaştırın.Daha sonra peritondan lineer dirsek boyunca karın boşluğuna kesin. Kenarları ayırmak için yara ekartörünü yerleştirin. Sonra uterusu karın boşluğundan çıkarın ve gösterildiği gibi yerleştirin.Farklı yavrulara farklı plazmitler enjekte edilecekse, her iki taraftaki yavruları sayın ve her bir plazmid ile hangilerinin ve kaç tane enjekte edileceğine karar verin, embriyoları sıcak ve yağlanmış tutmak için uterusun bir tarafını karın içine geri döndürün, açıkta kalan uterusu hemen ılık tuzlu su ile nemlendirin. Ardından, enjeksiyon çubuğunun kavrama kafasına yüklü bir iğne yerleştirin. Ucu, bir çift küçük cerrahi makas veya ince forseps ile, iğne mümkün olduğu kadar uzun süre kalacak ve sıvının geçmesine izin verecek şekilde dikkatlice kesin.Ardından, enjeksiyonun uzunluğunu ve mikro enjektör üzerindeki enjeksiyon basıncını, iğnenin ucunda 0,1 ila 0,2 mikrolitrelik küçük ama kolayca görülebilen bir damlacık görünecek şekilde ayarlayın. Ayak küreğine basıldığında, bu damlacığın hacmini farklı iğneler arasında mümkün olduğunca tutarlı tutun. Şimdi bir embriyo seçin ve başı yukarı doğru eğik olacak şekilde nazikçe sırt üstü yatırın.Embriyo yerleştirildikten sonra, sagital sinüse paralel hilal şeklinde bir gölge olarak ortaya çıkan ventrikülü bulun. İğnenin ucuyla ventrikülün üzerindeki uterusa hafif bir açıyla dokunun ve iğneyi uterus duvarından geçirin. Sonra iğneyi korteksten ventriküle doğru itin.Ardından, plazmit çözeltisini enjekte etmek için ayak küreğini pompalayın. Yeşil bir alan görünene ve ventrikülün yay şekline uyana kadar pompalamaya devam edin. Genç embriyolarda, boya genellikle kontralateral ventriküle yayılır.Toplamda yaklaşık üç veya dört embriyo enjekte edin ve maruz kalan tüm embriyoları işlem boyunca tuzlu su ile nemli tutun. Enjekte edilen ilk embriyodan başlayarak, kürekleri, pozitif elektrot plazmidi beynin istenen bölgesine çekecek şekilde yerleştirin. Negatif elektrodu, elektrotlar arasındaki en kısa yol doğrudan elektroporasyon için hedeflenen yapıdan geçecek şekilde açın.Kürekler yerine oturduktan sonra şoku uygulayın. Embriyoların yaşına ve büyüklüğüne bağlı olarak, 35 ila 50 voltluk beş darbe, beş milisaniye darbe uzunluğu ve 950 milisaniye darbe aralığı kullanın. Elektroporasyon için, enjekte edilen tüm embriyolarla tekrarlayın.Daha sonra, uterusun her iki tarafını fareye geri koyun. Amniyotik saksafon travmasını önlemek için yüzeyi tuzlu su ile nemli tutmaya ve çok fazla baskı uygulamamaya dikkat edin. Ardından, basit bir sürekli dikiş kullanarak kas tabakasını dikin.Ardından cildi kapalı bir şekilde zımbalayın. Şimdi dört santigrat derece filtrelenmiş% 4 PFA hazırlayın. Hayvanı öldürücü dozda sodyum pentobarbital intraperitoneal enjeksiyonu ile ötenazi yaptıktan sonra, karın bölgesini kesin.Daha sonra uterusun her iki tarafını da dışarı çekin ve yavrulara ilk enjekte edildiği gibi yerleştirin. Yavrulara farklı plazmitler enjekte edildiyse, her bir yavruyu ölü yavruları not ederek bulduğunuzdan ve hangilerine kontrol ve deneysel plazmitler enjekte edildiğini belirlediğinizden emin olun. Dişiden uterusu çıkarmadan önce, her yavruyu uterustan ve amniyotik kesekten ayrı ayrı çıkarın.Keskin bir makas veya tıraş bıçağıyla kafasını kesin ve kafayı PBS'ye yerleştirin. Transgenik fareler söz konusu olduğunda, genotipleme için doku örnekleri toplayın ve her bir kafayı, bir diseksiyon kapsamı altındaki 12 oyuklu bir plakada olduğu gibi ayrı tutun, beyni kafatasından çıkarın, hepsi korteksi çentiklememeye veya orta hattı yırtmamaya dikkat edin. Bir floresan mikroskobu kullanarak, beyinlerin başarılı bir şekilde elektroporasyona tabi tutulduklarını gösteren bir GFP pozitif yama olup olmadığını kontrol edin.Daha sonra, beyinleri PFA'da gece boyunca dört santigrat derecede sabitleyin. Şimdi, pH'ın daha önce altıya ayarlandığı sitrik asidi, bir mikrodalga veya su banyosunda bir boyama odasında 75 ila 80 santigrat dereceye ulaşana kadar ısıtın. Ardından slaytları 10 ila 15 dakika boyama odasına koyun.Daha sonra, slaytları PB S3 içinde oda sıcaklığında her seferinde üç dakika boyunca yıkayın. Birincil antikoru uygulayın ve standart bir protokole göre immün boyamaya devam edin. Daha sonra, knockdown'ı doğrulamak için GFP ve ilgilenilen gen için ortak etiketleme ile CRE aracılı eksizyonu doğrulayın.Bu şekil, silinen genin aşağı akış hedefi için cos boyama ile CRE aracılı eksizyonunun doğrulanmasını göstermektedir. RB Flocked, P 1 0 7 nakavt P one 30 floklu embriyolar ya boş PCI iki plazmid ya da PCI iki Cree plazmidi ile elektropore edildi ve GFP ve KI 67 için boyandı. Hücre proliferasyonunun bir belirteci.Çift lekeli hücreler nöronlarda görüldü, Cree ile elektropore edildi, ancak nöronlarda görülmedi. Psig ile elektroporasyonlu. Yalnız iki.RB eksizyonu, slaytlardan çıkarılan doku kesitlerinden ekstrakte edilen DNA üzerinde genotipleme primerleri ile PCR yapılarak da doğrulandı. Üst bant F flox alelini, alt bant ise vahşi tip aleli temsil eder. Ok, beynin elektroporasyonlu tarafındaki eksize edilmiş aleli gösterir.Sadece CRE aracılı eksizyon da doğrulanabilir in vitro floklu durdurma kodonlarına sahip plazmitler kullanılarak. NL DS gibi RFP'nin yukarı akışında Red RFP, sadece HEK 2 93 hücrelerinde CREE GFP ile koyola transfekte edildiğinde EK hücrelerinde eksprese edilir, bu da eksizyonun başarılı olduğunu gösterir Bu tekniği takiben. Hücre kültürü, immünohistokimya veya elektrofizyoloji gibi diğer yöntemler, c aracılı gen eksizyonunu takiben bireysel nöronların gelişimi ve işlevi ile ilgili ek soruları yanıtlamak için kullanılabilir.Bu tekniği izledikten sonra, utero elektroporasyonun beynin farklı bölgelerini hedeflemek için nasıl kullanılabileceğini görebilirsiniz ve bu, farklı transgenik hayvanlarda sahip olduğumuz karmaşık fenotiplerin bazılarını anlamaya gerçekten yardımcı olabilir.

induction-protein-deletion-through-utero-electroporation-to-define

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Utero elektroporasyon nöronal progenitör hücrelerinin in vivo transfecting için değerli bir yöntemdir. Elektrotlar ve elektroporasyon gelişimsel timepoint yerleştirme bağlı kortikal hücrelerin bazı altkümelerini hedeflenebilir. Hedeflenen hücreler daha sonra in vivo veya in vitro genetik değişiminin etkileri analiz edilebilir.

In utero Elektroporasyon Kortikal nöronlar Altküme Gen Fonksiyonu Öğrenmenin İlköğretim Nöronal Kültür takip

Utero elektroporasyon gelişmekte olan merkezi sinir sistemi (MSS) bir mekansal ve zamansal olarak kontrollü bir şekilde hızlı bir gen teslimat için izin verir. Burada son derece uyarlanabilir tarif telencephalon diensefalon ve retina da dahil olmak üzere birden fazla embriyonik MSS etki alanı ifade yapıları sunmak için kullanılabilir utero elektroporasyon protokol.

Verimli kullanarak birden çok CNS Topraklar&#39;da Gen Teslimat In Utero Elektroporasyon

Gelişmekte olan fare beyninin içine bir gen transferi yöntemi eşsiz bir cerrahi yöntem ve elektrotlar özel şekli ile tarif edilir. Bu benzersiz tekniği, beyin gelişimi okuyan birçok Nörobilimadamları yardımcı olacak zamansal ve mekansal plazmid DNA transfeksiyon sağlar.

Fare Utero Elektroporasyon: Kontrollü Spatiotemporal Gen Transfeksiyon

Bu protokol, in utero elektroporasyon yoluyla C57BL/6 merkezi sinir sistemindeki farklı bölgelerin spesifik olarak nasıl transfekte edileceğini ayrıntılı olarak açıklar. Bu protokolde korteks, hipokampus, talamus, hipotalamus, lateral septal çekirdek ve striatuma dönüşen bölgelerin transfeksiyonları için ayrıntılı talimatlar bulunmaktadır.

Korteks, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- ve Striatum özgü<em&gt; In Utero</em&gt; C57BL / 6 Fare Elektroporasyon

Periventriküler Nodüler Heterotopya (PNH) malformasyonu kortikal gelişim (MCD) en sık görülen yetişkinlikte ama genetik temeli en dağınık durumda bilinmeyen kalır. Biz son zamanlarda roman aday genler MCD'ler için tanımlamak için ve doğrudan kendi etken rol içinde vivoonaylamak için bir strateji geliştirdik.

Dizi-CGH, Bütün exome sıralama ve rahim içinde elektroporasyon Rodents beyin malformasyonlar için sorumlu genlerin tanımlamak için birleştirerek yeni bir strateji

Bu yazının tek hücre düzeyinde ve floresan etiketli nöronların eksitabilite nöronların yapısal bağlantı tanımlamak için utero elektroporasyon (İEÜ) kullanmak protokolleri sağlar. Histoloji dendritik ve aksonal projeksiyonlar karakterize etmek için kullanılır. Akut dilim tam hücreli kayıt eksitabilitesini araştırmak için kullanılır.

Rahimde Elektroporasyon Nöronal alt popülasyonlar heyecanlanma ve Tek hücreli Bağlantı Eğitim Yaklaşımları

Gen beyinde hücre-otonom fonksiyonları kaybı inducing tarafından okudu ya da seyrek nüfus hücre işlevinin kazanmak. Burada, rahim içinde elektroporasyon Cre recombinase işlev içinde vivokaybına neden için floxed genler ile kortikal nöronlar geliştirme seyrek nüfus sunmak için açıklamak.

CRE-lox rekombinasyon fare serebral korteks rahim içinde elektroporasyon ile inducing

Burada, electroporated beyin organotypic dilim kültürler fare embriyo confocal mikroskobu ve canlı görüntüleme teknikleri için uygun oluşturmak için düşük maliyetli ve güvenilir bir yöntem sağlamak.

Eski Utero Elektroporasyon ve embriyonik fare beyni canlı görüntüleme, GABAergic Interneurons geçiş için Organotypic dilim kültürleri

Uteros elektroporasyonda çift mekansal ve zamansal olarak ayrılmış hücre popülasyonları hedefleme sağlar. Bu teknik, bu hücre popülasyonları arasındaki etkileşimleri normal koşullarda floresan proteinler ihsallaştırmak için değil, aynı zamanda fonksiyonel deneylerden sonra ilgi genlerini tedirgin etmek için görselleştirmek için yararlıdır.

Geçici ve Mekansal Olarak Ayrılmış Hücre Popülasyonlarını Hedef lemek için Utero Elektroporasyonunda Çift

Bu protokolde, E7.5'teki fare amniyotik boşluğunun lentivirüs ile nasıl enjekte edileceğini açıklıyoruz, bu da tüm sinir plakasının düzgün bir şekilde transdüksiyonuna yol açarak, hayatta kalma veya embriyonik gelişim üzerinde minimum zararlı etkiye sahiptir.

Embriyonik Gün 7.5'te In Utero Nano-Enjeksiyon (NEPTÜN) ile Murin Nöral Plaka Hedefleme

Öğrenin transgenik fare modellerinde in utero elektroporasyon ile nöronal göç ve gelişim kusurlarını analiz etme yöntemini. CRE aracılı gen eksizyonu ve hücre özerkliği çalışmaları için etkili bir tekniktir.

Protein silinmesi indüksiyonu yoluyla In Utero Elektroporasyon Transgenik Modelleri Nöronal Göç Açıkları tanımlayın

Daha fazla video keşfet