Name: Baz Çifti Çözünürlük DNA metilasyon Değerlendirme Temsil bisülfit sıralamayı İndirimli pekiştirilmiş (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: Öğrenin, epigenetik araştırmalar için baz çifti çözünürlüklü DNA metilasyon analizi yöntemini. Restriksiyon enzimi sindirimi ve bisülfit dönüşümü kullanan bu teknik, az miktarda başlangıç materyaliyle yüksek kapsamlı veri üretir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Orijinal ERRBS raporunun tüm yazarlarına teşekkür ederiz. Teknik yardım için Mame Fall'a teşekkür ederiz. Teknik hizmetler ve yardım için Weill Cornell Medical College Epigenomics Core'a teşekkür ederiz. Çalışma, bir Sass Vakfı Judah Folkman Bursu, bir NCI K08CA169055 ve FGB, NIH R01HG006798 ve R01NS076465'ye ASH-AMFDP12005, Irma T. Hirschl ve Monique Weill-Caulier Charitable Trusts ve STARR Konsorsiyumu'ndan (I7-A765) CEM'e finansman ve AMM'ye bir LLS SCORE hibesi (7006-13) tarafından desteklenmiştir.

Idam tüm işlemler Tıp Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Indiana Üniversitesi tarafından onaylanmış ve Sağlık kılavuzların Ulusal Enstitüsü takip edilmektedir. 1. Cerrahi Tekniği <ol><li> Steril eldiven, aletler ve NIH kurallarına 25 göre steril cerrahi alanını kullanarak bu işlem sırasında aseptik teknik koruyun. Onları otoklav ile ameliyat başlamadan önce araçları sterilize (tam liste için özel Reaktifler / Ekipman Tablo). Operasyon sırasında araçları sterilize etmek için bir cam boncuk sterilizatör kullanın. </li></ol> 2. Anestezi ve Hazırlık <ol><li> Bir veteriner izofluran buharlaştırıcı sistemi kullanılarak 0.9 L / dk oksijen ve% 2.5 izofluran karışımı ile anestezi kutusuna fare anestezisi. Fare kutusundan çıkarmadan önce vücut pozisyonunda değişikliklere yanıt vermez emin olun. </li><li> Mou oftalmik merhem sürünSE gözleri kurumasını onları korumak için. </li><li> Burun konisi kutuya gaz akışını geçin. Koni içinde kendi burun ve ağız ile cerrahi ped ve emici tezgah kağıdı ile kaplı bir ısıtılmış pad üzerinde sol tarafta kare fare yerleştirin. Sürekli farenin solunum ritmi ve hızı izlemek ve gerektiğinde izofluran seviyelerini ayarlamak - anestezi yeterli düzeyde tutmak için (2,5 ila% 3 izofluran), toplam sedasyon onaylamak için ayak tutam refleksini kullanın. </li></ol> 3. Cerrahi Yaklaşım <ol><li> Hizalayın ve cerrahi alan ile stereoskopla odak. Burun konisi ayarlayın ve görme alanının kenarında konumlandırılmış böylece aşağı bantlayın. </li><li> Fare sol tarafta yalan, kesi yapılacaktır kulağın arkasındaki alanı açığa burun konisi sağ kulak kenarına bantlayın. Posterior aurikular ven kulağa boyunca yatay hareket emin olun. Not t doğru yerleştirmeO hayvan ve kulak bantlama hızlı yüz siniri bulmak için çok önemlidir. </li><li> Ve% 70 etanol ile kulak arkasında kürk ıslatın ve bir jilet veya neşter bıçak kullanarak cerrahi siteyi tıraş. Ön ıslatma kürk, bu anatomik konumda kolay tıraş sağlar. </li><li> % 70 etanol ile ve ardından bu Betadinede cerrahi fırçalama (% 7.5 povidon-iyot) gibi bir iyot çözeltisi ile deri temizleyin. Iyice bölgeyi dezenfekte bu temizlik iki kez daha tekrarlayın. </li><li> , Kesi yapmak kulak çıkıntı için alan posterior kaudal kulak arka aurikular ven iz yeri belirlemek için. Çıkıntı 3 mm posterior - yaylı makas kullanarak, 4 mm&#39;lik kesi 2 yapmak. </li><li> Künt diseksiyon kullanarak deri altı yağ ve fasya ile ayır. Kan damarları veya kas dokusu kolayca zarar görebilir, çünkü makas ile doğrudan kesme kaçının. </li><li> Kanama oluşursa, steril bir pamuklu çubukla cerrahi bölgeye baskı uygulamaken az 30 saniye boyunca karıştırılmıştır. Belirgin sıvı kaybı meydana gelmesi durumunda, fazla 25 ya da 27 G iğne kullanılarak steril% 0.9 tuzlu su çözeltisi 0.5 ml ile periton içine fare enjekte edilir. </li><li> Yüz siniri bulmak için, birkaç anahtar yerler, spinal aksesuar sinir, kulak kanalına kullanın ve (aşağıda açıklanmıştır) digastrik kas anterior. Fasiyal sinirin dalları görüntülenmiştir kadar bu yerler etrafında ayır. o zaman ortaya sinir önemli bir beyaz katı bir yapı olarak görünür ve fasya tabakası altında yatan yapılara bunu yapışır. <ol><li> Deri altı yağ ve fasya disseke edilmiş bir kez, trapez kasını innerve kafatası kaudal kısmından geçecek spinal aksesuar sinir, bulun. fasial sinir, spinal aksesuar sinir derin. </li><li> Inci beyazı görünüyor ve fasiyal sinirin rostralinde görülebilir kıkırdak kulak kanalı bulun. </li><li> Üst ve c yatıyor ön digastrik kas kas karın bulfasiyal sinirin için audal. </li></ol></li><li> Fasial sinirin ana dalları görüntülenmiştir zaman, Stylomastoid foramende kendi kökenini bulmak için dorsal onları iz. , Açık cerrahi siteyi tutun sinirin yolu takip bahar makas ipuçlarını ilerlemek, daha sonra açık yeni gelişmiş alan tutmak için dorsal forseps taşımak için ince uçlu Dumont forseps # 5/45 kullanma. </li><li> Bu noktada elmacık, yanak ile fasiyal sinirin gövdesini ve marjinal mandibular dalı gözünüzde canlandırın. NOT: Temporal dal foramen yakın bulunacaktır. üst ve alt bölüme marjinal mandibular sinir dalları yakın çene, böylece bu sinir dalları bu düzeyde görünür olmayacaktır. <ol><li> Bir sinir transeksiyonu performans ise, ince uçlu forseps ile yavaşça sinir stabilize ve yaylı makas ile sinir kesti. Beyin sapından sinir avulsing önlemek için forseps ile sinire çok çekiş uygulamaktan kaçının. İtBirbirlerinden uzakta, ya da kesilmiş ve distal sinir bir kısmını çıkarmadan kütükleri hiçbir yeniden bağlanma oluşabilir sağlamak için. </li><li> Bir ezilme yaralanması gerçekleştirmek, sonra, tüm aksonlar sever ilk ezilme sitesine dik ikinci bir açıyla bu ezmek tekrarlamak için sabit basınç kullanarak 30 saniye boyunca sinir sıkıştırmak için Dumont # 5/45 forseps kullanabilir. Aksi takdirde yaralanma hayvanlar arasında tutarsız olacaktır, 30 sn ezmek sırasında basınç değişken miktarlarda uygulamaktan kaçının. </li></ol></li></ol> 4. Kapanış ve Kurtarma <ol><li> Altta yatan yapıları üzerinde yağ ve kas yerleştirin. </li><li> Kesi kenarlarını yaklaştığı ve 7,5 mm yara klibi kullanarak yara kapatın. Dikişler ya da yapıştırıcı aynı zamanda yara kapatma için kabul edilebilir. Ameliyat sonrası analjezikler, şu anda temin edilebilir. </li><li> Farenin kulağına bandı çıkarın. Izofluran akışını kapatın ve fare 1 dakika 30 saniye için saf oksijen solumak için izin verir. Planestezi kurtarmak için hiçbir yatak ile boş bir kafes içinde fare ace. </li><li> Fare kurtarıldı zaman, yüz felci doğrulayıcı belirtileri için davranışlarını incelemek. bıyıkları felç ve sırt yanak doğru açılı olacak, burun sapma olacak, ve göz hava puf yanıt yanıp olmaz. </li><li> Ev hayvanlar ortaklaşa ameliyattan sonra onlar kadın iseniz. Daha agresif ve zorla enfeksiyona yol açar onların cagemate yara klipleri, kaldırmak eğilimindedir çünkü ortaklaşa erkek fareler konut kaçının. Gerekirse, şu anda cerrahi sonrası analjezik sağlayın. </li><li> Hiçbir enfeksiyon ya da diğer bir komplikasyon postoperatif meydana sağlamak için ameliyattan sonra birkaç gün günde bir defa fareler izleyin. Kendi üzerinde düşmüş değil varsa ameliyattan sonra 10 gün - yara klipleri 7 çıkarın. </li><li> Göz kırpma refleksi yeniden ya kadar günlük kornea komplikasyonları önlemek için etkilenen göze göz merhemi yağlama Uygulaörtülü veya ötenazi kadar. </li></ol>

Yazarlar ifşa etmek Çıkar çatışması var.

biyolojik-ilgili genomik bölgelerde sitozin metilasyonu protokolü sunulan verimleri baz çifti çözünürlüğü verileri. başlangıç ​​malzemesinin 50 ng için optimize edilmiş yazıldığı gibi protokol, ancak, bu, giriş malzemesi, bir dizi (5 ng ya da daha fazla) 26 işlemek için uyarlanabilir. Tablo 6&#39;da görüldüğü gibi, Bu protokol adımlar bazı ayarlamalar gerektirecektir. ERRBS kütüphaneleri de sekanslama ile gerçekleştirilebilir eşleştirilmiş uç dizisi ve daha da genomik içerisinde için uygun olan daha 51 döngü daha okur. Numune başına daha düşük maliyet protokolü sunacak Multiplexed sıralama, ancak bu verilerin (Şekil 5 ve Tablo 8) temsil CpG site başına azaltılmış kapsama neden olur, ve başına yüksek kapsama gerektiren analizler gerçekleştirmek için kapsama yeterli derinliği vermez (Landan ve ark. 33 tarafından tarif edildiği gibi) örneğin CpG Alanı. Son olarak, bu protokol (veya herhangi bir bisülfit bazlı Protocol) metil-sitozin ve hidroksimetili-sitozin 46,47 arasında ayrım yapamaz. Ancak, diğer protokol ile entegre edilebilir oluşturulan veriler, farklı değişiklikleri tanımlamak için 48,49 sonuçları ve diğer sitozin modifikasyonları son zamanlarda ilgi olmalıdır, 50 bildirdiler. Şekil 3G (kırmızı iz) her iki kütüphane fraksiyonlardan eşit mol katılım temsil gösterildiği gibi Şekil 3A-C&#39;de gösterildiği gibi, ve bir kez de sekanslama için bir araya getirilmiş bir izleme elde edilmesini sağlar, yüksek kaliteli kütüphaneleri görünür. Kütüphane hazırlık hatası prosedürü sırasında herhangi bir aşamada neden olabilir. Bozulmuş DNA işlenir Eğer bu protokolü açıklanan sıralama parametreleri kullanılarak düşük CpG kapsama dolayısıyla MspI fragmanları zenginleştirilmiş ve kütüphaneler neden olur. Bir enzim işlevsel olmayan veya yanlışlıkla reaksiyonlardan biri dışında ise, protokol beklenen kütüphane vermez. Ligasyon rea Eğerölü m, verimsizdir, adaptörler beklenenden daha yüksek bir konsantrasyonda, ve / veya kullanılan primerler konsantrasyon, son amplifıkasyonda için sınırlayıcı bir madde, kütüphane hata oluşabilir. Nedeniyle kütüphane ve aşırı adaptörler hem gelişigüzel kümelenme da sıralama ile engel olacak kütüphanede, (Şekil 3D-F Bioanalyzer sonuçlarında ~ 150 bp bir zirveleri olarak görülen) Aşırı adaptörler. Böyle bir kütüphane, görünüşe göre, normal olarak sırası da, önemli bir kısmının, sadece adaptör dizileri olacaktır okur. Aşırı adaptörler bir kütüphane gözlenir ise, bu malzeme miktarı oranları adaptör optimal girdi malzeme kullanılarak varsa kütüphane hazırlık tekrarlamak için en iyisidir. Son olarak, kütüphanelerin etkin PCR sağlamak için, alt ve üst kütüphane fraksiyonlar bisülfit dönüşüm ve PCR zenginleştirme aşamaları boyunca ayrı numune olarak muhafaza edilir. Aksi takdirde P sırasında amplifikasyon ayırıcı verimliliğini verirCR (Şekil 3G mavi iz görüldüğü gibi) daha yüksek ve daha düşük fraksiyonların reaksiyon ve sıralama sırasında her kütüphane fraksiyonu kaplı ilgili genomik loci eşitsiz temsil potansiyeli. Kullanıcı kütüphaneleri üretilen yükseltmek için gerekli optimum PCR döngüleri daha titrasyon için bisülfit dönüşüm hemen sonra kantitatif PCR adım dahil etmek tercih edebilir. ERRBS kütüphane hazırlık protokolü belirli reaktifler tavsiye edildiği birçok önemli adım vardır. Son-tamir aşamada, dört nükleotid dNTP karışımı kullanılması, MspI enzimatik yıldız aktivitesi ve orijinal DNA örneğinde bulunan kesilmiş DNA fragmanları kaynaklananlar CG çıkıntı ihtiva eden herhangi bir ürünlerin son-tamir sağlar. Bu sonuçlar gelişmiş CpG temsil sonuçlanır. Bağlama adımı azından sağlamak için, yüksek konsantrasyon ligazı (2,000,000 birim / ml) ve metilli adaptörler kullanmak kritik olduğunu ligasyon, Reactiüzerinde etkilidir ve Bisülfit dönüşümü doğru veri uyum için gerekli adaptör dizileri etki etmez. PCR adımında, bisülfit ile muamele edilen GC açısından zengin DNA fragmanlarının büyütme yeteneğine sahip bir polimeraz kullanılarak yüksek özgüllük için gereklidir. Son olarak, fazla adaptörleri ve primer eleme sağlamak için, (örneğin: Agencourt AMPure XP) SPRI boncuk arındırma ligasyonu ve PCR ürünü, izolasyonların sütun dayalı tahliller yerine tavsiye edilir. Yüksek kaliteli veri oluşturmak için, verimli bisülfit dönüşümü sağlamak için önemlidir. sunulan denetim kullanıcıya dizileme önce dönüşüm etkinliğini belirlemek için yeteneği sunar. Bir alternatif olarak, lamda DNA gibi insan dışı bir DNA, bir iç kontrol (spike Giriş) olarak kullanılabilir. Nedeniyle türlerin farklılıkları için, bir kontrol, bu tür doğrudan alt baş dizisi dahil edilebilir (örneğin Yu kullanıldığı haliyle, ve ark. 34). Ancak, başak-in i isekullanılan s, bu benzersiz büyütülmüş ve bağımsız olarak kütüphane dizileme önce dizilenmiştir sürece kütüphane sekanslama önce dönüşüm etkinliğini belirlemek için kullanılamaz. tespit dönüşüm oranları CpG olmayan bölgelerinde metilasyon durumunun dayanmaktadır. Bu (örneğin embriyonik kök hücreleri), CpG olmayan bağlam ve paralel numuneler veya bu amaç için kullanılabilir dönüşüm verimliliği için değerlendirmek başka bir şekilde yüksek sitosin metilasyon bağlamında kullanılmak üzere uygun olmayabilir. ERRBS kütüphaneleri sekanslanması için benzersiz olan adrese birkaç uyarılar bulunmamaktadır. sıralandı kütüphane fraksiyonların ilk üç üsleri nedeniyle MspI tanıma kesim sitesine neredeyse eşit olmayan rastgele (C ^ CGG Şekil 4B, C bakınız). Düşük kalite önemli veri kaybı potansiyeli Bu sonuçlar sıralama sırasında belirgin yüksek küme yoğunluğu rağmen yoksul küme lokalizasyonu kaynaklanan okur. Bu engeli aşmak için,özel kontrol şeritli olarak bağımsız bir kulvarda (phix kontrolü veya diğer kütüphane türü) yüksek karmaşıklık kütüphane bulunmaktadır. Yüksek karmaşıklık kütüphaneleri sıralandı ilk dört üsleri A, C, T ve G dengeli bir temsilini içeren uçları var. Uygun kontrol hatları, RNA-seq, ChIP-seq, tüm genom dizileme, ya da sıralama makine üreticisi (örn phix Kontrol v3) tarafından sunulan bir kontrol olarak kütüphaneler bulunmaktadır. İlgili sıralama çalıştırmak için bir kontrol şeritte olarak belirlenmiş, bu küme pozisyonları tespit etmek sıralamanın ilk dört üsleri sırasında kullanılmaktadır matris üretimi için temel olarak hizmet verebilir. yüksek kalitede tarafından CpG site başına ortalama kapsama çıkaracağız yakalanan okur 5.2 (n = 4). Seçenek olarak ise, bu teknik bir sorun, aynı zamanda, daha önce tarif edildiği gibi 23 koyu dizilim yaklaşımı kullanılarak aşılabilir. Diğer sıralama kriterleri üreticinin protokolleri başına standart operasyon prosedürlerini izleyin. CpG c başına Nihayet, kapsamaVeri analizi için hosen ilgi biyolojik soruların kullanıcı tarafından ve kısmen yönlendirileceksiniz. 10x kapsama eşiği yüksek kapsama analizi yaklaşımı, ancak bu eşik bu ilgi olmalıdır düşürülebilir tanıyor. ERRBS veri analizi tam bir tartışma, ancak farklı şekilde metilatlı sitozinler ve bölgeler açık kaynak araçları 31,51-53 kullanılarak tespit edilebilir, bu makalenin kapsamı dışındadır. Ek analiz düşünceler ve yaklaşımlar 54,55 iyi tarif edilmiştir, ve okuyucu planlanan analize en uygun araçlar için literatür taraması teşvik edilmektedir. Diğer yayınlanmış yöntemlere kıyasla, ERRBS tekrarlanabilirliği açıklanan verim yüksek oranlı olarak gerçekleştirilen dört günlük protokolünü sunmaktadır. Bu MassARRAY EpiTYPER 26 standart altın oranla onaylanmıştır, maliyet-etkin, yüksek kapsama veri ve çeşitli giriş malzeme için uyarlanabilirve sıralama yaklaşımlar (düşük frekanslı klinik örnek işleme ve diğer hücre tipleri için uygun) tutarlar. Bu genom bağlayıcı transkripsiyon faktörü, kromatin remodeling, epigenetik işaretleri ve diğer ilgi sitozin değişiklikler profilleme diğer tekniklerle analiz biyolojik ilgili loci taban çifti çözünürlük sunuyor ve bütünleştirici kullanılabilir. Bu çalışmalarda ERRBS veri kullanımı geniş kapsamlı bir moleküler yaklaşım katkı ve boyutsal biyolojik modellerinde ve insan hastalığının çalışmada analizi yüksek olanak sağlayabilmektedir.

Sitosin (5-metilsitosin) DNA metilasyonu, biyolojik süreçlerin çeşitli memeli hücrelerinde önemli dahil, ancak baskılı X kromozomu inaktivasyonu, geliştirme ve gen ifadesinin 1-8 düzenlenmesi ile sınırlı değildir epigenetik işaretidir. Malign ve diğer bozukluklar DNA metilasyon desen çalışması hastalığa özgü desenleri tespit ve hastalık patogenezinde ve potansiyel biyomarker keşifler 9-17 anlayışına katkıda bulunmuştur. DNA metilasyonu durumu epigenom sorguya birçok protokol vardır. Bu afinite göre ayrılabilir, kısıtlayıcı enzim bazlı ve aşağı mikrodizi veya sıralama platformları kullanan Bisülfit dönüşümü-ölçülür. Ayrıca, bu genel kategoriler de dahil olmak üzere, ancak, Kombine bisülfit Kısıtlama Analizi 18 ile sınırlı ve Temsil bisülfit sıralamayı (RRBS 19) İndirimli olmayan köprü, birkaç protokoller vardır. </p&gt; RRBS başlangıçta Meissner et al. 19,20 tarafından tarif edilmiştir. protokol maliyeti 21,22 etkilidir nicel baz çifti çözünürlük verileri sonuçlandı bisülfit sıralama, ardından GC-zengin genomik bölgeleri zenginleştirmek için bir adım tanıttı. GC-zengin bölgeler MspI (C ^ CGG) kısıtlama enzimi tarafından hedeflenen, ve sitozin metilasyonu polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) amplifikasyonu ardından sitosinlerin bisülfit dönüşüm (urasile değiştirilmemiş sitosinlerin Deaminasyon), tarafından çözümlenir. RRBS gen promoterleri ve tüm genom sekanslama için gerekli bir kısmını CpG adalarının kısmını içermektedir; Ancak RRBS CpG kıyıları ve biyolojik alaka diğer arası bölgelerde sınırlı kapsama vardı. Çeşitli gruplar bu genomik bölgelerin 23-25 ​​metodoloji ve sonuç kapsama üzerine geliştirmek orijinal rapordan bu yana RRBS protokolleri güncellendi yayınladı var. Geliştirilmiş İndirimli Temsil bisülfit aşağıya bakınızencing (ERRBS) RRBS göre kütüphane hazırlık değişiklikler ve alternatif veri uyum yaklaşımı 26 içermektedir. ERRBS üretilen veriler temsil CpG&#39;lerin daha yüksek bir sayısı ile sonuçlandı ve genomik bölgelerinin kapsamı 26 sorguya artmıştır. Bu yöntem, insan hastaya ve diğer hayvan örneklerinde 26-30 DNA metilasyon modelleri gidermek için kullanılmıştır. ERRBS protokolü tamamlanması ve temsili insan DNA&#39;sı kullanılarak oluşturulan veriler için gerekli adımlar teklifleri ayrıntıları tarif edildiği gibi (örnekler, daha önce rapor de tanımlanan hasta numunelerinin 31 elde edilir ve normal bir insan vericiden bir CD34 + kemik iliği numunesi edildi). Protokol numune başına işleme süresini azaltır ve kütüphane büyüklüğü seçiminde fazla ayrıntı için sağlayan otomatik bir boyut seçim süreci içerir. Protokol, bilinen moleküler biyoloji teknikleri, bir dizi bir araya getirir. Yüksek molekül ağırlıklı DNA ağırlık sindirilirson-tamir A-atık ve metillenmiş bağlanmasının ardından metilasyona duyarlı restriksiyon enzimi (MspI) i. GC açısından zengin parçalarının boyutları seçimi bisülfit dönüşümü ve dizileme için önceki PCR tarafından takip edilir. Bisülfit dönüşüm önce yapılmış 32 tarif ve veri analizi ve uygulamaları detaylı yorum öneriler ve referanslar okuyucuların kullanımı için dahil edilir, ancak bu yazının kapsamı, ötesinde olmuştur. protokol, dört gün boyunca yapılan ve küçük girişi (50 ng veya daha az) malzeme miktarlarına müsait olabilir. diferansiyel metilasyon Alanı ve bölgesi belirlemeleri için değil, aynı zamanda epigenetik polimorfizm tespiti için sadece yeterli CpG site başına yüksek içerisinde tarif edilen verimler veri olarak protokol ve ark. 33 Landan tarafından tarif edildiği gibi.

<table><tbody><tr><td>MspI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0106M</td><td>100.000 birim/ml</td></tr><tr><td>NEBuffer 2</td><td>New England Biolabs</td><td>B7002S</td><td>MspI enzimi için reaksiyon tamponu; protokol adımı 1.2</td></tr><tr><td>Fenol çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4557</td><td>10&nbsp ile dengelenmiştir; mM Tris HCl, pH&nbsp; 8.0; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p4557</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432'deki</td><td>güvenlik ve kullanım talimatlarına bakın http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/c2432</td></tr><tr><td>Glikojen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1767</td><td>19-22 mg/ml</td></tr><tr><td>NaOAc</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7899</td><td>3 M, pH 5.2</td></tr><tr><td>Etanol'deki</td> <td>güvenlik ve kullanım talimatlarına bakınSigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>200 kanıt, moleküler biyoloji için</td></tr><tr><td>Tampon EB</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td>10 mM Tris-Cl, pH 8.5</td></tr><tr><td>tris (hidroksimetil) aminometan (Tris)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>1 M, pH 8.5 çözeltisi hazırlayın</td></tr><tr><td>Tris-Etilendiamintetraasetik asit (TE)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>T9285</td><td>Üreticinin tavsiyelerine</td></tr> <tr><td>göre 1 x tampon çözeltisine seyreltinT4 DNA Ligaz Reaksiyon Tamponu</td><td>New England Biolabs</td><td>B0202S</td><td>10x konsantrasyon</td></tr><tr><td>Deoksinükleotid trifosfat (dNTP) Çözelti Karışımı</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L</td><td>Her nükleotid 10 mM</td></tr><tr><td>T4 DNA Polimeraz</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203L</td><td>3.000 birim/ml</td></tr><tr><td>DNA Polimeraz I, Büyük (Klenow) Parça</td><td>New England Biolabs</td><td>M0210L</td><td>5.000 birim/ml</td></tr><tr><td>T4 Polinükleotid Kinaz</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201L</td><td>10.000 birim/ml</td></tr><tr><td>QIAquick PCR Saflaştırma Kiti</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>Protokol adımı 2.3'te DNA ürün saflaştırması için kullanılır</td></tr><tr><td>2'-deoksiadenosin 5'-trifosfat (dATP)</td> <td>Promega</td><td>U1201</td><td>100 mM</td></tr><tr><td>Klenow Fragmanı (3'&rarr; 5' exo-)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0212L</td><td>5.000 birim/ml</td></tr><tr><td>MinElute PCR Saflaştırma Kiti</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>Protokol adımı 3.3'te DNA ürün saflaştırması için kullanılır</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligaz</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202M</td><td>2.000.000 birim/ml</td></tr><tr><td>Metilasyon Adaptörü Oligo Kiti</td><td>Illumina</td><td>ME-100-0010</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>Manyetik boncuk saflaştırma adımlarını (adım 4.3 ve 8.2) uygulayan protokol bölümlerinde kullanılır. Kullanmadan önce oda sıcaklığına dengeleyin.</td></tr><tr><td>Pippin Prep Jel Kasetleri, %2 Agaroz, boya içermez</td><td>Sage Science</td><td>CDF2010</td>, <td>iç standartlara sahip</td></tr><tr><td>Sertifikalı Düşük Aralıklı Ultra Agaroz</td><td>Bio-Rad</td><td>161-3106</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Borat-EDTA (TBE) tamponu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4415</td><td></td></tr><tr><td>Etidyum bromür çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>50 bp DNA Merdiveni</td><td>NEB</td><td>N3236S</td><td></td></tr><tr><td>100 bp DNA Merdiveni</td><td>NEB</td><td>N3231S</td><td></td></tr><tr><td>Jel Yükleme Boyası, Turuncu (6x)</td><td>NEB</td><td>B7022S</td><td></td></tr><tr><td>Neşter&nbsp; Bıçak&nbsp; Hayır.&nbsp; 11</td><td>Fisher Scientific</td><td>3120030</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Jel Ekstraksiyon Kiti</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>EZ DNA Metilasyon Kiti</td><td>Zymo Research</td><td>D5001</td><td>Protokol adımında kullanılır 6.2</td></tr><tr><td>EZ DNA Metilasyon-Yıldırım Kiti</td><td>Zymo Research</td><td>D5030</td><td>Adım 6.2 için Alternatif</td></tr><tr><td>Evrensel Metillenmiş İnsan DNA Standardı</td><td>Zymo Research</td><td>D5011</td><td>Bisülfit dönüşüm kontrolü olarak kullanılır</td></tr><tr><td>FastStart Yüksek Sadakatli PCR Sistemi</td><td>Roche</td><td>03553426001</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA Yüksek Hassasiyetli Test Kiti</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>Q32854</td><td>Floresan bazlı bir DNA kantitasyon testi; protokol adımları 1.1, 9.1 ve 10.1'de kullanılır</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Mıknatıs Ömrü</td><td>Teknolojileri</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek Hassasiyetli DNA Kiti</td><td>Agilent Teknolojileri</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>2100 Biyoanalizör</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PhiX Control v3</td><td>Illumina</td><td>FC-110-3001</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 2500</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pippin Hazırlık</td><td>Adaçayı Bilim</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Florometre</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>Q32872</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq SR Küme Kiti v3-cBot-HS</td><td>Illumina</td><td>GD-401-3001</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq SBS Kiti v3-HS</td><td>Illumina</td><td>FC-401-3002</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq RNA Örnek hazırlama</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2001</td><td>Kitaplıkları çoğullamak için kullanılan barkodlu adaptörler; Bkz. Çoğullama protokolü için ek dosya.</td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vorteks Karıştırıcı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kuru Blok Isıtıcı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Termal Döngüleyici</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Su Banyosu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jel elektroforez sistemi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektroforez güç kaynağı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jel doc</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV veya mavi ışık transilluminatörü</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

baz Çifti Çözünürlük dna metilasyon değerlendirme temsil bisülfit sıralamayı İndirimli pekiştirilmiş

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing for Assessment of DNA Methylation at Base Pair Resolution

DNA metilasyon motifi eşleme ağır normal ve hastalıklı dokularda incelenmiştir. Çeşitli yöntemler hücrelerinde sitozin metilasyonu desenleri sorgulamak için kurulmuştur. Tüm genom dizileme bisülfit İndirimli temsil GC-zengin genomik loci nicel baz çifti çözünürlüğü sitozin metilasyonu kalıplarını tespit için geliştirilmiştir. Bu bisülfit dönüşümü, ardından, bir kısıtlama enzimi kullanımını birleştirilmesiyle gerçekleştirilir. Geliştirilmiş Düşük Temsil bisülfit dizileme (ERRBS) kapalı biyolojik ilgili genomik lokusları arttırır ve insan, fare ve diğer organizmalardan DNA sitozin metilasyonu profil kullanılmıştır. ERRBS kütüphanesi hazırlanmasında kullanım için, düşük molekül ağırlıklı parçaları üretmek için DNA, sınırlama enzimi özümlemesi ile başlatılır. Bu parçalar, yeni nesil dizileme için standart kütüphane yapımı tabi tutulur. Nihai amplificati önce metillenmemiş sitozinlerin bisülfit dönüşümüadım kapalı genomik loci sitozin metilasyon seviyelerinin nicel taban çözünürlüğü sağlar. protokol dört gün içinde tamamlanabilir. Belirlenmiş bir dizilim kontrol şeridini kullanarak sıralandı ilk üç üsleri düşük karmaşıklık rağmen, ERRBS kütüphaneleri yüksek kaliteli veri elde. Haritalama ve biyoinformatik analizi, daha sonra yapılır ve verim verileri kolayca genom platformlarda çeşitli entegre edilebilir. ERRBS bu mümkün araştırma uygulamaları bir dizi insan klinik örnekleri ve uygulanabilir işlemek için yapım küçük giriş malzeme miktarlarını kullanabilir. üretilen bir video ERRBS protokol kritik adımları gösterir.

Geliştirilmiş İndirgenmiş Temsil Bisülfit Dizileme, sitozin bisülfit dönüşümü ile birleştirilmiş restriksiyon enzim sindirimine dayalı DNA metilasyon analizi için dizileme kitaplıklarının hazırlanması için bir yöntemdir. Bu protokol 50 ng başlangıç materyali gerektirir ve GC açısından zengin genomik bölgelerde baz çifti çözünürlük verileri verir.

Baz Çifti Çözünürlük DNA metilasyon Değerlendirme Temsil bisülfit sıralamayı İndirimli pekiştirilmiş

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine ...

Bu prosedürün genel amacı, baz çifti çözünürlüğü D-N-A-C-P-G, sülfit dönüşümü ile sitozin ile birleştirilmiş kısıtlama enzim sindirimine dayalı metilasyon analizi için sıralama kitaplıkları oluşturmaktır. Bu, önce yüksek kaliteli DNA'nın bir kısıtlama enzimi olan MSP sindiriminin gerçekleştirilmesi, ardından son onarım, metillenmiş adaptörlerin kuyruğu ve ligasyonu ile gerçekleştirilir. Bir sonraki adım, sülfit dönüşümünden sonra seçilen parçaların boyutu üzerinde sülfit dönüşümü ile gerçekleştirilmesidir.Fragmanlar PCR kullanılarak amplifiye edilir. Son adım, kalite kontrol ve sıralamanın yapılması, ardından veri görselleştirme ve analizinin yapılmasıdır. Sonuç olarak, bi sülfit dizilemesinin geliştirilmiş indirgenmiş temsili, CG açısından zengin genomik lokuslarda sitidin metilasyon modellerinin kantitatif baz çifti çözünürlüğünü tespit eder.Bu tekniğin mikrodiziler gibi diğer DNA metilasyon yöntemlerine göre ana avantajı, baz çifti çözünürlüğünde ve biyolojik olarak ilgili bölgelerde yüksek kapsamlı D-N-A-C-P-G metilasyon verileri üretmek için küçük girdi malzemesi miktarlarını kullanabilmesidir. Bu yöntem için ilk olarak, geleneksel tahlillerde kapsanan bölgelerin ötesindeki epigenetik kalıpları keşfetmekle ilgilendiğimizde aklımıza geldi. Mikrodizilerden, diğer yeni nesil tekniklerden üretilen verilerle entegre edilebilecek baz çifti çözünürlüklü DNA metilasyon verilerinin üretilmesine geçiş yapmak için bu tekniği geliştirmekle ilgilendik.Bu yöntem, epigenetik alanındaki temel soruları cevaplamaya yardımcı olabilir. Örneğin, normal kontrollere veya diğer hastalık durumlarına kıyasla biyolojik örneklerde epigenetik modelleme ve heterojenlik. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, prosedürün uzunluğu, çok sayıda özel gereksinim ve Mamie düşüşü oluşturulan kütüphanelerin benzersiz sıralama özellikleri nedeniyle bunu zor bulacaktır.Laboratuvarımızdaki bir araştırma uzmanı, bu protokolü başlatmak için prosedürün gösterilmesine yardımcı olacaktır. İlk olarak, bir MSP bir kısıtlama enzimi sindirimi, bir künt uç onarım reaksiyonu ve üç ana uçta tek bir nükleotid ilavesi geçirmiş genomik DNA örneklerinin saflaştırılmış alikotlarını hazırlayın. Bu noktada, DNA ürünleri, 10 mikrolitre A-A-L-D-N-A örneğini 0.2 mililitrelik bir PCR tüpüne aktarmaya başlamak ve tüpü buz üzerine yerleştirmek için adaptör ligasyonlarına hazır olacaktır.Ek olarak, adaptör moleküllerinin bir kısmını buzun üzerine yerleştirin. Ardından, ligasyon reaktifi karışımını buz üzerinde hazırlayın. Hem ligasyon reaktifini hem de adaptör moleküllerini DNA örneğine ekleyin ve karıştırmak için birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin.Bir PCR tüpünü bir termal döngüleyiciye yerleştirin ve ligasyon reaksiyonunun ertesi gün gece boyunca 16 santigrat derecede ilerlemesine izin verin. Manyetik boncuk veya silika kolon bazlı katı faz DNA ekstraksiyon kiti kullanarak ligasyon ürünlerini saflaştırın. Arıtma işleminin son adımında.30 mikrolitre DNA içermeyen su ekleyerek DNA'yı güçlendirin. Saflaştırılmış DNA ürünü, toplam 25 nanogram veya daha büyük DNA ile başlayan numuneler için ihtiyaç duyulana kadar eksi 20 santigrat derecede saklanabilir. PI gibi otomatik bir jel ekstraksiyon aparatı kullanın ve uzunlukları 150 baz çifti ile 400 baz çifti arasında olan bağlanmış ürünleri seçmek için hazırlayın.Ethereum bromür veya siber yeşil gibi DNA görselleştirme boyalarını agros kasetinden çıkardığınızdan emin olun, çünkü çatallı adaptöre bağlı parçaların DNA göç özelliklerini değiştirebilirler. Pippin %2 boya içermeyen bir aros kaseti üzerinde DNA elektroforezini ayarlamak için protokolün bu adımı için standart agros jel bazlı boyut seçim protokolleri de kullanılabilir. Pippin Prep konsolunda yeni bir protokol oluşturun ve tercih edilen kaset olarak %2 DF işaretçisi L seçeneğini seçin.Ardından dahili standartları kullan seçeneğini etkinleştirin ve referans şerit numarasının 150 baz çifti ve 400 baz çifti arasında değişen DNA parçalarını izole etmek için şerit numaralarıyla eşleştiğini doğrulayın. Toplama modu olarak aralık seçeneğini seçin ve aşağıdaki limit parametrelerini girin: baz çifti başlangıcı için 135, baz çifti sonu için 410 ve baz çifti pençeleri için 240. Bu, aparata elektroforetik alanı elektro elüsyon çıkış portuna hizalaması talimatını verir.Bu aralıktaki DNA parçaları çıkışın yakınına seyahat ettiğinde. Protokol dosyasını kaydettikten sonra, cihaz kurulumundan sonra Pippen Prep'in standart çalıştırma prosedürlerini izleyerek cihazın jel kasetini ve numune yükleme kuyularını hazırlayın. Karışımları jel kasetine yüklemek için belirli bir ligasyon sonrası numunenin 30 mikrolitrelik bir alikotuna 10 mikrolitre DNA markörü ekleyerek DNA numunelerini elektroforez için hazırlayın.İlk olarak, her numuneden 40 mikrolitre elektroforez tamponunu çıkarın. Ardından, her 40 mikrolitre numune işaretleyici karışımını ayrı kuyucuklara pipetleyerek hacmi değiştirin. Konsola döndüğünüzde, kaydedilen protokolü yükleyin ve elektroforezi başlatmak için başlat düğmesine basın.Program 240 baz çiftine ulaştığında, duraklatma adımı, bir pipet ile her çıkış portundan 40 mikrolitre ouit'i manuel olarak toplayın. Bu kesirleri daha düşük kitaplık kesri olarak etiketleyin. Alt kütüphane fraksiyonlarını topladıktan sonra, 40 mikrolitre taze elektroforez tamponu ekleyerek çıkış portlarını hemen yıkayın.Tamponu en az üç kez yukarı ve aşağı pipetleyin ve ardından ağı aspire edin. Çıkışlardan kısa uzunluktaki DNA türlerinin tüm izlerini çıkarmak için bu yıkamayı iki kez daha tekrarlayın. Şimdi numuneye 40 mikrolitre elektroforez tamponu ekleyin.Elucian portlarını iyice kapatın ve elucian işlemine devam etmek için çalıştır düğmesine basın. 410 baz çifti ayarında Ellucian programının tamamlanmasının ardından, tüm çıkış portlarından 40 mikrolitre Inuit toplayın ve bu fraksiyonları üst kütüphane fraksiyonu olarak etiketleyin. Bu noktada, her iki kütüphane fraksiyonu da jel saflaştırılır ve zaten bi sülfit dönüşümü için kullanılır.Ticari olarak temin edilebilen bir kit kullanarak, her iki kitaplık fraksiyonunda da bi sülfit dönüştürme testini gerçekleştirin. Dönüştürme işleminin son adımında, DNA örneklerini 40 mikrolitre DNA içermeyen suda elüte edin. Bisülfit dönüşümünden sonra, elde edilen DNA kütüphanesi fragmanları, her bir DNA molekülünün adaptör uçlarında hibritleşen primerler kullanılarak bir zenginleştirme PCR amplifikasyonuna tabi tutulacaktır.Zenginleştirme PCR'ye hazırlanmak için önce 160 mikrolitre PCR ana karışımı ekleyin, sülfürle dönüştürülmüş bir numunenin her 40 mikrolitrelik alikotuna ekleyin. Daha sonra elde edilen 200 mikrolitrelik karışımı dört adet 50 mikrolitrelik alikotlara bölün. Ayrı PCR tüplerinde.Tüpleri bir termal döngüleyiciye yerleştirin ve dönüştürülen DNA şablonunu çoğaltın. Zenginleştirmeden sonra, dört PCR sonrası ürünü 1,5 mililitrelik tek bir tüpe çekin ve DNA'yı ticari bir PCR temizleme kiti ile saflaştırın. PCR ürünlerini saflaştırmak için bir manyetik boncuk katı faz ekstraksiyon kiti kullanılıyorsa, önce birleşik alt kitaplıklı PCR ürünlerini boncuklardaki toplam hacimlerinin 1,7 katı ile karıştırarak standart çalıştırma prosedürlerini değiştirin.Daha sonra kombine üst kitaplık PCR ürünlerini, boncuklardaki toplam hacimlerinin 1.1 katı ile karıştırın. Ardından, saflaştırma işleminin son adımında yıkama hacimlerinin her birinin 800 mikrolitre olarak değiştirilmesi gereken %70 etanol yıkama adımlarına kadar üreticinin protokolünü izleyin. DNA'yı 50 mikrolitre DNA serbest elüsyon tamponu ile güçlendirin.Saflaştırılmış kütüphaneleri, çift sarmallı DNA için seçici olan floresan bazlı bir test kullanarak, her bir kütüphane fraksiyonu için zenginleştirme sonrası DNA içeriği miktarını ölçmek için ihtiyaç duyulana kadar negatif 20 santigrat derecede saklayın. Ayrıca, zenginleştirme sonrası kütüphane boyutunu ve kalitesini bir biyoanalizör ile değerlendirin. Baz çiftleri cinsinden ifade edilen ortalama DNA uzunluğunu kullanarak belirli bir kütüphane fraksiyonunun etkin DNA molaritesini hesaplayın.Molarite bilindikten sonra, karşılık gelen her bir üst ve alt kütüphane fraksiyonunu iki nanomolar nihai konsantrasyona kadar seyreltmek için DNA'nın serbest suyunu kullanın. Her biri 20 mikrolitrede iki nanomolar delikli kitaplık karışımı oluşturmak için alt ve üst kitaplık çiftlerini tek bir tüpte birleştirin. Havuza alınan örnek artık bir sıralama çalıştırması için hazırdır.E-R-R-B-S dahil olmak üzere dizileme ile ilgili tahlillerde, üst ve alt kütüphane moleküllerinin kalitesi ve boyut dağılımı, nihai dizileme verilerinin kalitesini belirlemede anahtar faktörlerdir. Geleneksel manuel jel ekstraksiyon protokolleriyle karşılaştırıldığında, E-R-R-B-S protokolünde kullanılan otomatik jel ekstraksiyon aparatı, tutarlı bir boyut dağılımı üretecek ve çapraz numune kontaminasyonu potansiyelini en aza indirecektir. Daha sonra, tüm DNA zincirlerinden gelen ham verileri dizilemek için BIS sülfite dönüştürülmüş kütüphane moleküllerini gönderdikten sonra, herhangi bir iplik için, her bir nükleotid konumu için veri kalitesinin, ilk üç nükleotidden hemen sonra önemli ölçüde arttığını gösterir.Bu üç nükleotid için konsensüs dizisi, kütüphane moleküllerinin büyük çoğunluğu için CGG ile ayarlandığından, veriler, E-R-R-B-S protokolünün, ağırlıklı olarak kuşatılmış arzu edilen bir dizi genomik fragman içeren bir kütüphane koleksiyonu ürettiğini göstermektedir. MSP ile bir kısıtlama özeti kuşbakışı bakış açısıyla sona erer. E-R-R-B-S protokolü, tüm genom boyunca sitidin metilasyon bölgelerinin baz çifti çözünürlük verilerini verebilir.Örneğin, kromozom 12 burada gösterilmiştir. Protokol, genom çapında CPG'lerin azaltılmış bir temsilini kapsar. Bu videoyu izledikten sonra, temel çözünürlüklü D-N-A-C-P-G metilasyon verilerinin oluşturulması için E-R-R-B-S kütüphanelerinin nasıl hazırlanacağını iyi anlamış olmalısınız, bir kez ustalaştıktan sonra bu teknik dört günde yapılabilir.Bu prosedürü denerken, yüksek kaliteli DNA ile başlamayı, açıklanan tüm adımları dahil etmeyi, önerilen parametreleri kullanarak bi sülfat dönüşümünün ve dizisinin verimliliğini doğrulamayı unutmamak önemlidir. Fenil ve kloroform ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu prosedür gerçekleştirilirken kimyasal bir başlıkta çalışmak ve uygun atık bertarafına sahip olmak gibi yaygın önlemler her zaman alınmalıdır.Bu prosedürü takiben. Bulguları doğrulamak için spyro dizileme veya kütle dizisi epitipi gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Ayrıca, tespit edilen DNA metilasyon modellerinin biyolojik önemini belirlemek için gen ekspresyonu profillemesi yapılabilir.Sınırlı miktarda girdi malzemesinden baz çifti çözünürlüklü DNA, metilasyon modelleri üretme yeteneği, daha önce hiç mümkün olmayan nadir hücre popülasyonlarının profillenmesini sağlamıştır. Ayrıca, epigenetik aracılı regülasyon ve hastalığın heterojenliğinin araştırılması için büyük klinik örnek kohortlarının profillenmesini de mümkün kılmıştır.

enhanced-reduced-representation-bisulfite-sequencing-for-assessment

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video metillenmiş DNA immunoprecipitation (MeDIP) için protokol göstermektedir. MeDIP seçici (anti-5 mC) 5-methylcytosine özgüllüğü antikorlar kullanılarak genomik DNA örneği metillenmiş DNA parçaları ayıklar iki günlük bir işlemdir.

Metillenmiş DNA Immunoprecipitation

DNA metilasyon analizi için altın standart bisülfit dönüştürülen DNA genom dizileri. Bu yöntem, asidik koşullar altında deaminasyon bisülfit 5-methylcytosine (5-MEC) ile karşılaştırıldığında sitozin artan duyarlılık yararlanır. Unmethylated cytosines hedef genomik DNA PCR sonra metil cytosines ayırt edilebilir.

DNA Metilasyonu: bisülfit modifikasyonu ve Analiz

Erken yaşam stresinin üzerine DNA metilasyon ve gen ekspresyon değişiklikleri incelemek için bir iş akışı gösterilir. Yeni doğmuş farelerin ve ayrık beyin dokularında izolasyonu anneden ayrılma başlayarak, eş zamanlı olarak izleyen bisülfit sıralama ve RT-PCR analizi için beyin dokusu yumruklar DNA ve RNA izole etmek için bir protokol temsil eder.

Beyin Küçük, Anatomik tanımlı alanları DNA metilasyon ve Gen İfade Optimize Analizi

Bu video, gastrointestinal kanser örneklerinden genomik DNA'nın bisülfit modifikasyonu prosedürünü göstermektedir. Teknik, genlerin metilasyon paternleri arasındaki ilişkiyi araştırmak ve karsinogeneze katkılarını belirlemek için faydalıdır.

Genomik DNA'nın Bisülfit Dönüşümü: Gastrointestinal Kanser Dokusundan Alınan Genomik DNA Örneklerinde DNA Metilasyonunu İncelemek İçin Bir Yöntem

Bisülfit amplikon dizilemesi (BSAS), hedeflenen genomik ilgi bölgelerinde sitozin metilasyonunu ölçmek için bir yöntemdir. Bu yöntem, baza özgü bir seviyede DNA metilasyonunun mutlak kantitasyonunu üretmek için yeni nesil dizilemeden önce hedef bölgelerin PCR amplifikasyonu ile eşleştirilmiş bisülfit dönüşümünü kullanır.

DNA Metilasyon Analizi nesil Dizilimine tarafından hedef

Burada bir protokol Metil-Bağlama DNA Yakalama sıralama (MBDCap seq veya MBD-seq) teknolojisi ve sonraki biyoinformatik analiz boru hattı kullanılarak büyük ölçekli klinik hasta tarama çalışmalarında genom DNA metilasyonu araştırmak için sunuyoruz.

Hasta Dokularda metil-bağlayıcı DNA yakalama Dizi

Bu çalışma, kronik lenfositik lösemi (KL) hastalarında farklı şekilde metilasyona uğramış CpG bakımından zengin bölgelerin tanımlanması için optimize edilmiş bir metil-CpG-bağlanma alanı (MBD) sıralama protokolünü ve bir hesaplama hattını açıklamaktadır.

Kronik Lenfositik Lösemi Hastalarında Metil-CpG-Bağlayıcı Alan Yakalamaya Dayalı Bir Yöntem Kullanarak Kapsamlı DNA Metilasyon Analizi

Burada, mitokondriyal DNA (mtDNA) metilasyon doğru miktar bir iletişim kuralını mevcut. Bu protokol için bir enzimatik sindirim DNA BamHI tahmindi mtDNA metilasyon düzeyi mtDNA ikincil yapı tarafından neden önlemek için kullanılan bioinformatic analiz boru hattı ile birleştiğinde ile açıklanmaktadır.

Mitokondrial DNA metilasyonu doğru algılanması için metodoloji

Burada, protokolü ve metil-Seq, kronik stres pozlama ile ilişkili epigenetik değişiklikleri tanımlamak için bir fare modeli kullanarak bir epigenomic platform uygulanması açıklanmaktadır. Sonuçları sıçan metil-Seq platformu sıçanlarda stres maruz kaynaklanan metilasyonu farklılıklar tespit kapasitesine sahip olduğunu göstermektedir.

Stres pozlama ile ilişkili epigenetik değişiklikleri tanımlamak için bir fare metil-Seq Platform

Bu çalışma, mikroarray teknolojileri tarafından elde edilen DNA metilasyon verilerini yönetmek için iş akışını açıklamaktadır. Protokol, numune hazırlamadan veri analizine kadar olan adımları gösterir. Tüm prosedürler ayrıntılı olarak açıklanmıştır ve video önemli adımları göstermektedir.

DNA Metilasyonunun Biyoinformatik Analizine Örnek Hazırlama: Obezite ve İlgili Özellik Çalışmaları için Dernek Stratejisi

Öğrenin, epigenetik araştırmalar için baz çifti çözünürlüklü DNA metilasyon analizi yöntemini. Restriksiyon enzimi sindirimi ve bisülfit dönüşümü kullanan bu teknik, az miktarda başlangıç materyaliyle yüksek kapsamlı veri üretir.

Baz Çifti Çözünürlük DNA metilasyon Değerlendirme Temsil bisülfit sıralamayı İndirimli pekiştirilmiş

Daha fazla video keşfet