Baz Çifti Çözünürlük DNA metilasyon Değerlendirme Temsil bisülfit sıralamayı İndirimli pekiştirilmiş

Bu prosedürün genel amacı, baz çifti çözünürlüğü D-N-A-C-P-G, sülfit dönüşümü ile sitozin ile birleştirilmiş kısıtlama enzim sindirimine dayalı metilasyon analizi için sıralama kitaplıkları oluşturmaktır. Bu, önce yüksek kaliteli DNA'nın bir kısıtlama enzimi olan MSP sindiriminin gerçekleştirilmesi, ardından son onarım, metillenmiş adaptörlerin kuyruğu ve ligasyonu ile gerçekleştirilir. Bir sonraki adım, sülfit dönüşümünden sonra seçilen parçaların boyutu üzerinde sülfit dönüşümü ile gerçekleştirilmesidir.

Fragmanlar PCR kullanılarak amplifiye edilir. Son adım, kalite kontrol ve sıralamanın yapılması, ardından veri görselleştirme ve analizinin yapılmasıdır. Sonuç olarak, bi sülfit dizilemesinin geliştirilmiş indirgenmiş temsili, CG açısından zengin genomik lokuslarda sitidin metilasyon modellerinin kantitatif baz çifti çözünürlüğünü tespit eder.

Bu tekniğin mikrodiziler gibi diğer DNA metilasyon yöntemlerine göre ana avantajı, baz çifti çözünürlüğünde ve biyolojik olarak ilgili bölgelerde yüksek kapsamlı D-N-A-C-P-G metilasyon verileri üretmek için küçük girdi malzemesi miktarlarını kullanabilmesidir. Bu yöntem için ilk olarak, geleneksel tahlillerde kapsanan bölgelerin ötesindeki epigenetik kalıpları keşfetmekle ilgilendiğimizde aklımıza geldi. Mikrodizilerden, diğer yeni nesil tekniklerden üretilen verilerle entegre edilebilecek baz çifti çözünürlüklü DNA metilasyon verilerinin üretilmesine geçiş yapmak için bu tekniği geliştirmekle ilgilendik.

Bu yöntem, epigenetik alanındaki temel soruları cevaplamaya yardımcı olabilir. Örneğin, normal kontrollere veya diğer hastalık durumlarına kıyasla biyolojik örneklerde epigenetik modelleme ve heterojenlik. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, prosedürün uzunluğu, çok sayıda özel gereksinim ve Mamie düşüşü oluşturulan kütüphanelerin benzersiz sıralama özellikleri nedeniyle bunu zor bulacaktır.

Laboratuvarımızdaki bir araştırma uzmanı, bu protokolü başlatmak için prosedürün gösterilmesine yardımcı olacaktır. İlk olarak, bir MSP bir kısıtlama enzimi sindirimi, bir künt uç onarım reaksiyonu ve üç ana uçta tek bir nükleotid ilavesi geçirmiş genomik DNA örneklerinin saflaştırılmış alikotlarını hazırlayın. Bu noktada, DNA ürünleri, 10 mikrolitre A-A-L-D-N-A örneğini 0.2 mililitrelik bir PCR tüpüne aktarmaya başlamak ve tüpü buz üzerine yerleştirmek için adaptör ligasyonlarına hazır olacaktır.

Ek olarak, adaptör moleküllerinin bir kısmını buzun üzerine yerleştirin. Ardından, ligasyon reaktifi karışımını buz üzerinde hazırlayın. Hem ligasyon reaktifini hem de adaptör moleküllerini DNA örneğine ekleyin ve karıştırmak için birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin.

Bir PCR tüpünü bir termal döngüleyiciye yerleştirin ve ligasyon reaksiyonunun ertesi gün gece boyunca 16 santigrat derecede ilerlemesine izin verin. Manyetik boncuk veya silika kolon bazlı katı faz DNA ekstraksiyon kiti kullanarak ligasyon ürünlerini saflaştırın. Arıtma işleminin son adımında.

30 mikrolitre DNA içermeyen su ekleyerek DNA'yı güçlendirin. Saflaştırılmış DNA ürünü, toplam 25 nanogram veya daha büyük DNA ile başlayan numuneler için ihtiyaç duyulana kadar eksi 20 santigrat derecede saklanabilir. PI gibi otomatik bir jel ekstraksiyon aparatı kullanın ve uzunlukları 150 baz çifti ile 400 baz çifti arasında olan bağlanmış ürünleri seçmek için hazırlayın.

Ethereum bromür veya siber yeşil gibi DNA görselleştirme boyalarını agros kasetinden çıkardığınızdan emin olun, çünkü çatallı adaptöre bağlı parçaların DNA göç özelliklerini değiştirebilirler. Pippin %2 boya içermeyen bir aros kaseti üzerinde DNA elektroforezini ayarlamak için protokolün bu adımı için standart agros jel bazlı boyut seçim protokolleri de kullanılabilir. Pippin Prep konsolunda yeni bir protokol oluşturun ve tercih edilen kaset olarak %2 DF işaretçisi L seçeneğini seçin.

Ardından dahili standartları kullan seçeneğini etkinleştirin ve referans şerit numarasının 150 baz çifti ve 400 baz çifti arasında değişen DNA parçalarını izole etmek için şerit numaralarıyla eşleştiğini doğrulayın. Toplama modu olarak aralık seçeneğini seçin ve aşağıdaki limit parametrelerini girin: baz çifti başlangıcı için 135, baz çifti sonu için 410 ve baz çifti pençeleri için 240. Bu, aparata elektroforetik alanı elektro elüsyon çıkış portuna hizalaması talimatını verir.

Bu aralıktaki DNA parçaları çıkışın yakınına seyahat ettiğinde. Protokol dosyasını kaydettikten sonra, cihaz kurulumundan sonra Pippen Prep'in standart çalıştırma prosedürlerini izleyerek cihazın jel kasetini ve numune yükleme kuyularını hazırlayın. Karışımları jel kasetine yüklemek için belirli bir ligasyon sonrası numunenin 30 mikrolitrelik bir alikotuna 10 mikrolitre DNA markörü ekleyerek DNA numunelerini elektroforez için hazırlayın.

İlk olarak, her numuneden 40 mikrolitre elektroforez tamponunu çıkarın. Ardından, her 40 mikrolitre numune işaretleyici karışımını ayrı kuyucuklara pipetleyerek hacmi değiştirin. Konsola döndüğünüzde, kaydedilen protokolü yükleyin ve elektroforezi başlatmak için başlat düğmesine basın.

Program 240 baz çiftine ulaştığında, duraklatma adımı, bir pipet ile her çıkış portundan 40 mikrolitre ouit'i manuel olarak toplayın. Bu kesirleri daha düşük kitaplık kesri olarak etiketleyin. Alt kütüphane fraksiyonlarını topladıktan sonra, 40 mikrolitre taze elektroforez tamponu ekleyerek çıkış portlarını hemen yıkayın.

Tamponu en az üç kez yukarı ve aşağı pipetleyin ve ardından ağı aspire edin. Çıkışlardan kısa uzunluktaki DNA türlerinin tüm izlerini çıkarmak için bu yıkamayı iki kez daha tekrarlayın. Şimdi numuneye 40 mikrolitre elektroforez tamponu ekleyin.

Elucian portlarını iyice kapatın ve elucian işlemine devam etmek için çalıştır düğmesine basın. 410 baz çifti ayarında Ellucian programının tamamlanmasının ardından, tüm çıkış portlarından 40 mikrolitre Inuit toplayın ve bu fraksiyonları üst kütüphane fraksiyonu olarak etiketleyin. Bu noktada, her iki kütüphane fraksiyonu da jel saflaştırılır ve zaten bi sülfit dönüşümü için kullanılır.

Ticari olarak temin edilebilen bir kit kullanarak, her iki kitaplık fraksiyonunda da bi sülfit dönüştürme testini gerçekleştirin. Dönüştürme işleminin son adımında, DNA örneklerini 40 mikrolitre DNA içermeyen suda elüte edin. Bisülfit dönüşümünden sonra, elde edilen DNA kütüphanesi fragmanları, her bir DNA molekülünün adaptör uçlarında hibritleşen primerler kullanılarak bir zenginleştirme PCR amplifikasyonuna tabi tutulacaktır.

Zenginleştirme PCR'ye hazırlanmak için önce 160 mikrolitre PCR ana karışımı ekleyin, sülfürle dönüştürülmüş bir numunenin her 40 mikrolitrelik alikotuna ekleyin. Daha sonra elde edilen 200 mikrolitrelik karışımı dört adet 50 mikrolitrelik alikotlara bölün. Ayrı PCR tüplerinde.

Tüpleri bir termal döngüleyiciye yerleştirin ve dönüştürülen DNA şablonunu çoğaltın. Zenginleştirmeden sonra, dört PCR sonrası ürünü 1,5 mililitrelik tek bir tüpe çekin ve DNA'yı ticari bir PCR temizleme kiti ile saflaştırın. PCR ürünlerini saflaştırmak için bir manyetik boncuk katı faz ekstraksiyon kiti kullanılıyorsa, önce birleşik alt kitaplıklı PCR ürünlerini boncuklardaki toplam hacimlerinin 1,7 katı ile karıştırarak standart çalıştırma prosedürlerini değiştirin.

Daha sonra kombine üst kitaplık PCR ürünlerini, boncuklardaki toplam hacimlerinin 1.1 katı ile karıştırın. Ardından, saflaştırma işleminin son adımında yıkama hacimlerinin her birinin 800 mikrolitre olarak değiştirilmesi gereken %70 etanol yıkama adımlarına kadar üreticinin protokolünü izleyin. DNA'yı 50 mikrolitre DNA serbest elüsyon tamponu ile güçlendirin.

Saflaştırılmış kütüphaneleri, çift sarmallı DNA için seçici olan floresan bazlı bir test kullanarak, her bir kütüphane fraksiyonu için zenginleştirme sonrası DNA içeriği miktarını ölçmek için ihtiyaç duyulana kadar negatif 20 santigrat derecede saklayın. Ayrıca, zenginleştirme sonrası kütüphane boyutunu ve kalitesini bir biyoanalizör ile değerlendirin. Baz çiftleri cinsinden ifade edilen ortalama DNA uzunluğunu kullanarak belirli bir kütüphane fraksiyonunun etkin DNA molaritesini hesaplayın.

Molarite bilindikten sonra, karşılık gelen her bir üst ve alt kütüphane fraksiyonunu iki nanomolar nihai konsantrasyona kadar seyreltmek için DNA'nın serbest suyunu kullanın. Her biri 20 mikrolitrede iki nanomolar delikli kitaplık karışımı oluşturmak için alt ve üst kitaplık çiftlerini tek bir tüpte birleştirin. Havuza alınan örnek artık bir sıralama çalıştırması için hazırdır.

E-R-R-B-S dahil olmak üzere dizileme ile ilgili tahlillerde, üst ve alt kütüphane moleküllerinin kalitesi ve boyut dağılımı, nihai dizileme verilerinin kalitesini belirlemede anahtar faktörlerdir. Geleneksel manuel jel ekstraksiyon protokolleriyle karşılaştırıldığında, E-R-R-B-S protokolünde kullanılan otomatik jel ekstraksiyon aparatı, tutarlı bir boyut dağılımı üretecek ve çapraz numune kontaminasyonu potansiyelini en aza indirecektir. Daha sonra, tüm DNA zincirlerinden gelen ham verileri dizilemek için BIS sülfite dönüştürülmüş kütüphane moleküllerini gönderdikten sonra, herhangi bir iplik için, her bir nükleotid konumu için veri kalitesinin, ilk üç nükleotidden hemen sonra önemli ölçüde arttığını gösterir.

Bu üç nükleotid için konsensüs dizisi, kütüphane moleküllerinin büyük çoğunluğu için CGG ile ayarlandığından, veriler, E-R-R-B-S protokolünün, ağırlıklı olarak kuşatılmış arzu edilen bir dizi genomik fragman içeren bir kütüphane koleksiyonu ürettiğini göstermektedir. MSP ile bir kısıtlama özeti kuşbakışı bakış açısıyla sona erer. E-R-R-B-S protokolü, tüm genom boyunca sitidin metilasyon bölgelerinin baz çifti çözünürlük verilerini verebilir.

Örneğin, kromozom 12 burada gösterilmiştir. Protokol, genom çapında CPG'lerin azaltılmış bir temsilini kapsar. Bu videoyu izledikten sonra, temel çözünürlüklü D-N-A-C-P-G metilasyon verilerinin oluşturulması için E-R-R-B-S kütüphanelerinin nasıl hazırlanacağını iyi anlamış olmalısınız, bir kez ustalaştıktan sonra bu teknik dört günde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, yüksek kaliteli DNA ile başlamayı, açıklanan tüm adımları dahil etmeyi, önerilen parametreleri kullanarak bi sülfat dönüşümünün ve dizisinin verimliliğini doğrulamayı unutmamak önemlidir. Fenil ve kloroform ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu prosedür gerçekleştirilirken kimyasal bir başlıkta çalışmak ve uygun atık bertarafına sahip olmak gibi yaygın önlemler her zaman alınmalıdır.

Bu prosedürü takiben. Bulguları doğrulamak için spyro dizileme veya kütle dizisi epitipi gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Ayrıca, tespit edilen DNA metilasyon modellerinin biyolojik önemini belirlemek için gen ekspresyonu profillemesi yapılabilir.

Sınırlı miktarda girdi malzemesinden baz çifti çözünürlüklü DNA, metilasyon modelleri üretme yeteneği, daha önce hiç mümkün olmayan nadir hücre popülasyonlarının profillenmesini sağlamıştır. Ayrıca, epigenetik aracılı regülasyon ve hastalığın heterojenliğinin araştırılması için büyük klinik örnek kohortlarının profillenmesini de mümkün kılmıştır.