Name: Periferik kan Hematopoetik Progenitör Hücreleri İnsan Sinir Kök Hücre Doğrudan İndüksiyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Öğrenin, periferik kan CD34+ hücrelerinden viral vektörlerle sinir kök hücreleri doğrudan indüksiyon yöntemini. Bu teknik, nöron, astrosit ve oligodendrosit elde ederek rejeneratif tıpta hasta özgü hücre kaynağı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Yetişkin Tüm Blood 1. Zenginleştirme Hematopoetik Progenitor Hücreleri Not: hematopötik projenitör hücreleri ve CD34 + hücreleri yoğunluk gradyan santrifüj göre yöntemler kullanılarak kordon kanı, lökoferez malzeme ve tam kan da dahil olmak üzere çeşitli kaynaklardan elde edilmiş periferal kan mononükleer hücreleri (PBMC), saflaştırılabilir. Burada listelenen yöntem örnek olarak tam kan kullanır. <ol><li> Tüm kandan PBMC izole edilmesi: <ol><li> Ekin merkezi delikten pipetleme SepMate tüpüne lenfosit ayırma ortamı 4,5 ml ilave edilir. </li><li> % 2 insan serumu içeren steril DPBS eşit hacimde kan örneği seyreltin (hac / hac). Örneğin, DPBS +% 2 insan serumu, 5 ml numune 5 mi seyreltin. </li><li> Tüpün yan aşağı pipetleme seyreltilmiş örnek ekleyin. Merkezi delikten doğrudan örnek dökmek için değil dikkat edin. </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1200 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Dikkatle PMBC katmanın üzerinde süpernatant kaldırmak. </li><li> Yeni bir tüp içine PBMC katmanı (bulutlu) toplayın. </li><li> Frenden ile oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 150 x g&#39;de,% 2 insan tüpüne serum ve santrifüj içeren Dulbecco fosfat-tamponlu salin (DPBS) 15 ml ilave edilir. </li><li> Süpernatant atılır ve% 2 insan serumu ihtiva eden DPBS 15 ml pelletini. Hücrelerin sayısını. </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 690 x g&#39;de santrifüjleyin. Tüpten tüm süpernatantı. </li><li> 15 1% antibiyotik içeren Iscove değiştirilmiş Dulbecco ortamı (IMDM) ml (h / h) ve% 10 insan serumu, 1 x 10 7 hücre yeniden süspanse hücreleri (hac / hac). </li><li> CD34 + hücreleri izole önce% 5, 37 ° C&#39;de CO2 kuluçka hücreleri O / N inkübe edin. </li></ol></li><li> CD34 Multisort Kit kullanılarak PBMC&#39;lerden CD34 + hücrelerinin pozitif seçim: NOT: Hızlı çalışın ve soğuk hücreleri yapmak için önceden soğutulmuş çözümleri kullanmak ve kuafajı önlemekkit talimat başına hücre yüzeyinde ve non-spesifik hücre etiketleme antikorların. <ol><li> 50 ml&#39;lik bir tüp içinde, tüm PMBCs toplayın ve ortamdaki toplam hücre sayısı. </li><li> 10 dakika için 300 xg&#39;de hücreleri santrifüjleyin. Tamamen tüm süpernatantı. </li><li> 10 8 boncuk tampon maddesi içinde 300 ul başına hücre (DPBS ihtiva eden% 0.5 insan serumu (h / h) ve 2 mM EDTA) &#39;ye kadar yeniden süspanse edin. </li><li> FcR Engelleme Reaktif 100 ul ekleyin ve CD34 MultiSortMicroBeads 100 ul ekleyin. </li><li> İyice karıştırın ve buzdolabında 30 dakika süreyle kuluçkalayın (2-8 ° C). </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de kordon 10 8 hücre başına tampon ve santrifüj 2 ml ekleyerek hücreleri yıkayın. Tamamen süpernatantı. </li><li> Tampon 500 ul 10 8 hücrelere kadar yeniden süspanse edin. </li><li> Bir MACS Ayırıcı manyetik alan MACS LS kolonu yerleştirin ve boncuk tamponu, 3 ml ile durulama kolon hazırlanmıştır. </li><li> Cente üzerine hücre süspansiyonu Uygulasütun r. Etiketsiz hücreleri tercih eğer içinden toplanabilir akacaktır. </li><li> Yıkama kolon boncuk tamponu, 3 ml ile üç kez. </li><li> Ayırıcıdan gelen sütun çıkarın ve 15 ml&#39;lik bir tüp üzerine yerleştirin. </li><li> Kolona boncuk tampon 5 ml ekleyin ve hemen sütuna pistonu iterek manyetik etiketli hücreleri dışarı floş. </li><li> Hücre süspansiyonunun 1 ml&#39;si başına Multisort salıcı ayıraç 20 ul ekle. İyice karıştırın ve buzdolabında 10 dakika süreyle kuluçkalayın (2-8 ° C). </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 xg&#39;de hücreleri 10 7 hücre başına boncuk tamponu 2 ml ve santrifüj - 1 ekleyin. Tamamen süpernatantı. </li><li> 10 7 hücre başına boncuk tampon 50 ul süspanse hücreleri. </li><li> 10 7 hücre başına Multisort Durdurma Reaktifi 30 ul eklenir ve buzdolabında 15 dakika inkübe edilir. </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 xg&#39;de hücreleri boncuk tampon 5 ml ilave edilir ve santrifüj. Süpernatantı atın. </li></ol></li></ol> CD34 + Hücreleri Bağlı Sinir Kök Hücre 2. türetilmesi <ol><li> CD34 + hücreleri, kültür: Not: buzdolabında saklandığında Taze hazırlanmış ortam 7 gün içinde kullanılmalıdır. Önemli CD34 hücreleri kaybı 24 saat sonra gözlenen olabilir ama hücre sayısı sürekli azalır veya çoğalma varsa hücrelerinin çoğalması önemli özellikle gün 5. sonra, fark olmalı, kötü, orta veya CD34 hücrelerinin kalitesini ve hücreleri ya ima bir sonraki aşama için kullanılmamalıdır. <ol><li> CD34 süspanse Kültür CD34 + hücreleri (insan trombopoietin ihtiva eden (StemSpan SFEM ortamı SCF (TPO, 100 ng / ml), fms-benzeri tirosin kinaz 3 (Flt-3) ligandı (100 ng / ml) ve kök hücre faktörü orta muhafaza 100 ng / ml), interlökin-6 (IL-6, 20 ng / ml) ve interlökin-7 (IL-7, 24-çukurlu plaka içinde 20 ng / ml)) (en fazla 3 x 10 5 / kuyuda % 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C&#39;de oyuk başına ortam) 1 ml&#39;lik. </li><li> After 24 saat, yüzen hücreleri toplamak ve herhangi bir bağlı hücre ve hücre enkaz kurtulmak için oda sıcaklığında 110 xg&#39;de hücreleri santrifüj. Süpernatant atılır ve ilave 5 gün için% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C&#39;de, yeni bir 24 oyuklu plaka (de kadar, 1 x 10 5 /) taze CD34 muhafaza ortamı ve tohum, 1 ml süspansiyon hücrelerin. </li><li> CD34 + hücreleri kuyularda (Şekil 1A) alt kısmında yüzen sırasında dikkatli bir şekilde yüzer üst yarısını aspire ortamı her gün yarısı değiştirin. </li></ol></li><li> Sendai virüsü transfeksiyonu: <ol><li> 5. günde, CD34 hücreleri toplamak ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 170 xg&#39;de hücreleri santrifüj. Süpernatantı atın. </li><li> De 1 ml ortam maddesi, 24 oyuklu bir plakada 1 x 10 5 / taze ortam içinde tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> Ilk 10 saniye boyunca bir 37 ° C su banyosu içinde tüpler taban daldırılmasıyla bir cytotune-iPS Sendai yeniden programlama kiti çözülme ve daha sonra tamamen çözülmet RT. Kısaca tüpleri santrifüj ve buz üzerine koydu. Ilgili lot için Analiz Sertifikası (COA) listelenen her virüsün tavsiye hacmini karıştırılmasıyla Sendai virüsü karışımı hazırlayın. İçişleri Bakanlığı 15 tavsiye edilir. </li><li> CD34 hücrelerinin her oyuğuna Sendai virüsü karışımı ekleyin. Hafifçe sallayarak kuyu karıştırın. CO,% 5, 37 ° C&#39;de 2 kuluçka hücreleri inkübe edin. </li><li> 24 saat sonra transfeksiyon verimliliği gözlemleyin. Hücre gruplar ve küre oluşumu başarılı transfeksiyon (Şekil 1B) için göstergeler olduğuna dikkat edin. </li><li> Dikkatli bir orta üst yarısını aktararak kuyunun orta yarısı değiştirin. Yeni bir kuyudaki hücre küre ise, taze ortam ile aynı miktarını ekleyin. </li><li> Adım 2.2.6 yineleyerek gün orta her değiştirin. </li></ol></li><li> Sinir kök hücre indüksiyon: Not: Hücre koşullarına bağlı olarak, yaklaşık 5 ila 7 gün sonra transfeksiyon, tek tabaka yapışan hücreler 30 ulaşacak -% 50 kaynaşma (Şekil 1C). <ol><li> Besin Karışımı, F-12 1x N2 ek,% 0.1 (a / h) sığır serum albümini içeren (DMEM / F12), ((Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı yüzen hücreler ve küreler içeren süpernatanlarm çıkarın ve nöral projenitör ortamın 1 ml ilave BSA),% 1 (h / h) antibiyotikler, bazik fibroblast büyüme faktörü ve 20 ng / ml (bFGF), ve yapışkan hücreler içine, epidermal büyüme faktörü (EGF)), 20 ng / ml olmuştur. </li><li> İsteğe bağlı olarak, hafifçe pipetleme hücre küreler ayırmak ve 10 dakika boyunca 170 xg&#39;de hücreleri santrifüj. Süpernatantı ve geri kadar komut başına Matrigel ile kaplanmış bir yeni 24 oyuklu bir plaka içerisinde, sinirsel kök ortamı, 1 ml süspansiyon hücrelerin. </li><li> % 80 konfluent genellikle 1 hafta sonra, - hücreler 60 ulaşana kadar her gün orta değiştirin. </li><li> Süpernatantı atın ve nöral kök hücre ortamı (serum serbest ortamda, MGK SFM) 1 ml ekleyin. Ardından hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri ayırmakÇok nazik pipetleme. </li><li> Hücreleri çıkarın ve 6 oyuklu plakanın bir kuyuya hepsi tohum. Nöral kök hücre ortamının bir 1 mi, her oyuğa 2 mi ortam yapmak ekleyin. CO,% 5, 37 ° C&#39;de 2 kuluçka hücreleri inkübe edin. </li><li> Geçen gün orta her değiştirin. </li><li> Hücreler% 60 izdiham ulaştığında, ayırmak ve 1 hücreleri Replate: 2.3.4 ve 2.3.6 adımları izleyerek 3 oranında. </li></ol></li><li> Nöral kök hücrelerin dondurulması: <ol><li> Nöral kök hücre ortamına% 20 dimetil sülfoksit (DMSO) ilave edilerek orta dondurma nöral kök hücre hazırlayın. Buz üzerinde dondurma orta tutun. </li><li> Hafifçe pipetleme ve ardından hücre kazıyıcı kullanarak, 6-çukurlu plaka içindeki hücreleri ayırmak. Hücreleri saymak. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 170 xg&#39;de hücreleri santrifüjleyin. Süpernatantı atın. </li><li> 1 x 10 6 / ml nöral kök hücre ortamı hücrelerin tekrar. Hücrelere orta dondurma aynı hacimde ekleyin. </li><li> 1 ml (5 x 1 eklemeBir dondurarak saklama viali hücre 0 5 toplam hücre). Talimat aşağıdaki Bay Froster dondurma kabı kullanarak hücrelerin dondurun. </li></ol></li></ol> 3. Sinir Hücre Farklılaşması <ol><li> Nöronal hücre farklılaşması: <ol><li> Nöral kök hücreler% 80 izdiham ulaştığınızda, bir lastik polis ile nöral kök hücreleri ayırmak ve daha sonra yavaşça pipetleme ayırmak. </li><li> Hücre sayımı ve nöral kök hücre ortamı içinde 1 x 10 5 ug / ml konsantrasyonu ayarlanır. </li><li> Nöronal farklılaşma için, poli-D-lisin / laminin kaplanmış kapak hücreleri plaka, 1 x 10 5/24-yuvalı plakalar içinde kayar. CO,% 5, 37 ° C&#39;de 2 kuluçka hücreleri inkübe edin. </li><li> Sinir farklılaştırma ortamının orta yerine (DMEM 1x N2 ek, 1 x B27 ek, 300 ng / ml cAMP, 0.2 mM C vitamini, nörotrofik faktör (BDNF edilen 10 ng / ml beyin) ve 10 ng / ml, glial hücre içeren / F12 türetilmiş nörotrofik faktör (GDNF)) after 24 saat. CO,% 5, 37 ° C&#39;de 2 kuluçka hücreleri inkübe edin. </li><li> 2 hafta boyunca haftada iki kez nöral farklılaşma ortamı değiştirin. </li></ol></li><li> Astroglial farklılaşma: <ol><li> Pipetle nöral kök hücreleri ayırmak. </li><li> Hücre sayımı ve 5 x 10 4 hücre / ml hücre konsantrasyonunu ayarlamak. 24 oyuklu plakalar üzerine hücreleri Tohum. CO,% 5, 37 ° C&#39;de 2 kuluçka hücreleri inkübe edin. </li><li> % 10 fetal sığır serumu (FBS) ile DMEM / F12 ortamı yerine ve% 5 CO2 inkübatörü içinde 37 ° C&#39;de kuluçkalayın. </li><li> 2 hafta boyunca haftada iki kez orta değiştirin. Hücreler 2 hafta önce izdiham ulaşmak, adımlar 3.2.1 ve 3.2.2 Aşağıdaki hücrelerin Replate. </li></ol></li><li> Oligodendrosit farklılaşması: <ol><li> Pipetle nöral kök hücreleri ayırmak. </li><li> Oligodendrosit farklılaştırılmaktadır 1 ml hücreleri ve tohum poli-L-ornitin kaplı 24 oyuklu plakalar üzerine 1 x 10 5 hücre sayımN2 ek içeren DMEM / F12, trombosit türevli büyüme faktörü-AA (PDGF-AA) 10 ng / ml, nörotrofin-3 (NT-3), 2 ng / ml, sonik kirpi 2 ng / ml içeren tirme ortamı ( Sus), ve triiodotironin (T3 3 nM). CO,% 5, 37 ° C&#39;de 2 kuluçka hücreleri inkübe edin. </li><li> 2 hafta boyunca haftada iki kez orta değiştirin. </li><li> DMEM / 1xN2 takviyesi ile F12 ve T3 3 nM ve kültür miyelin bazik proteini (MBP) üretimi için bir hafta daha hücreler ortam değiştirin. </li></ol></li></ol> 4. İmmünofloresan Boyama <ol><li> % 4 paraformaldehid (PFA) ile değiştirin. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> PFA atın ve PBS% 0.1 Triton X-100 (PBS-T) ile 3 kez, her biri 5 dakika süre ihtiva ile yıkayın. </li><li> PBS oda sıcaklığında 10 dakika süre ile,% 0.5 Triton X-100 içeren hücreler geçirgenliği. </li><li> PBS-T, oda sıcaklığında 20 dakika süreyle% 4 keçi serumu içeren hücreler bloke eder. </li><li> Karşılık gelen birinci Antibo kuluçkaya bırakılırsoğuk bir odada, oda sıcaklığında ya da O / N, 2 saat boyunca% 0.1 BSA içeren PBS-T ile sulandırılmış kalıplar. </li><li> PBS-T, her biri 5 dakika süre ile 3 kez hücreleri yıkayın. Karanlıkta bir karıştırıcı üzerinde 1 saat boyunca% 0.1 BSA içeren PBS-T 400 seyreltme: 1 kullanarak bir fluorokrom ile birleştirilmiş ikincil antikor tekabül eden hücreleri inkübe edin. </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika süre ile 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) içeren PBS-T hücreleri yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika her biri PBS-T ile hücreler iki kez daha yıkanır. </li><li> Bir mikroskop kullanılarak etiketli hücreleri gözlemleyin ve almak fotoğraflar (Şekil 3). </li></ol>

<ol><li>Azari, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+immature+neuronal+cells+from+neural+stem+cell+progeny%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Purification of immature neuronal cells from neural stem cell progeny.</a> PLoS ONE. 6, e20941(2011).</li>
<li>Azari, H., Sharififar, S., Fortin, J. M., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuroblast+assay%3A+an+assay+for+the+generation+and+enrichment+of+neuronal+progenitor+cells+from+differentiating+neural+stem+cell+progeny+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The neuroblast assay: an assay for the generation and enrichment of neuronal progenitor cells from differentiating neural stem cell progeny using flow cytometry.</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Zhang, N., An, M. C., Montoro, D., Ellerby, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Human+Huntington%27s+Disease+Cell+Model+from+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoSCurr%22%5BJournal%5D)">Characterization of Human Huntington's Disease Cell Model from Induced Pluripotent Stem Cells.</a> PLoSCurr. 2, RRN1193(2010).</li>
<li>Park, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-Specific+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Disease-Specific Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Cell. 134 (5), 877-886 (2008).</li>
<li>Song, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+differentiation+of+patient+specific+iPS+cells+as+a+novel+approach+to+study+the+pathophysiology+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Neural differentiation of patient specific iPS cells as a novel approach to study the pathophysiology of multiple sclerosis.</a> Stem Cell Research. 8 (2), 259-273 (2012).</li>
<li>Vierbuchen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+fibroblasts+to+functional+neurons+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors.</a> Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).</li>
<li>Pfisterer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+human+fibroblasts+to+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 10343-10348 (2011).</li>
<li>Lee, S. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Generation+of+Neurosphere-Like+Cells+from+Human+Dermal+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Direct Generation of Neurosphere-Like Cells from Human Dermal Fibroblasts.</a> PLoS ONE. 6, e21801(2011).</li>
<li>Thier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Conversion+of+Fibroblasts+into+Stably+Expandable+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Direct Conversion of Fibroblasts into Stably Expandable Neural Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 10 (4), 473-479 (2012).</li>
<li>Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Südhof, T. C., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+mouse+fibroblasts+to+self-renewing%2C+tripotent+neural+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 2527-2532 (2012).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+neural+stem+cells+from+human+adult+peripheral+CD34%2B+cells+for+an+autologous+model+of+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Derivation of neural stem cells from human adult peripheral CD34+ cells for an autologous model of neuroinflammation.</a> PLoS ONE. 8, e81720(2013).</li>
<li>Jin, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+Sendai+virus+provides+a+highly+efficient+gene+transfer+into+human+cord+blood-derived+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Recombinant Sendai virus provides a highly efficient gene transfer into human cord blood-derived hematopoietic stem cells.</a> Gene Ther. 10 (3), 272-277 (2003).</li>
<li>Ban, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+transgene-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+%28iPSCs%29+by+temperature-sensitive+Sendai+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 14234-14239 (2011).</li>
<li>Goolsby, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+progenitors+express+neural+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic progenitors express neural genes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 14926-14931 (2003).</li>
</ol>

Çalışma, NIH okul içi fonları tarafından finanse edilmektedir.

Doğrudan periferik hematopoetik progenitör hücrelerden sinir kök hücreleri üretmek için detaylı bir protokol sağlanır. Fibroblast hücreleri ile karşılaştırıldığında, insan periferal kan daha erişilebilir. Sunulan protokol fazla 1 x 10 5 hematopoietik progenitör hücreler veya CD34 pozitif hücreleri kullanarak, tam kan, 10 ml zenginleştirilebilir. LuM trombosit toplayıcı U kirlenme genellikle önlenebilir olmasa da, kolayca düşük hızlı santrifüj ile azaltılabilir ve nöral kök hücre ü...

In vitro nöronal kültürler nörolojik hastalıkların çalışmaları için temel bir araç olarak kullanılmıştır. Birincil hayvan (çoğunlukla, kemirgen) bir sinir kültürlerinin 1, 2 ve gliom ve diğer tümörlerinden türetilmiş insan nöral hücre çizgileri, en yaygın olarak kullanılan bu tür çalışmalar bulunmaktadır. Bununla birlikte, kemirgen ve insan hücreleri arasında önemli farklılıklar olduğu kabul edilmiştir. Kemirgenler dayalı birçok bulgular insanlara tercüme edilemez. Ayrıca, kitle genomik bilgiler ve nispeten kolay gen düzenleme ve tüm genom sıralamasını analiz hızlı gelişmeler, eğilim daha dişli birkaç insan nöronal kılan, hastalık eğilimli genler keşfetmek ve belirli hastalıklarda işlevlerini ve rollerini ortaya koymayı amaçlayan bir hücre hatları, sadece kullanım sınırlıdır. Teorik olarak, hasta sinir sisteminin örneklerinden elde edilen insan primer sinir kültürleri en iyi seçimdir ama elde etmek imkansız; dolayısıyla alternatif metODS gereklidir. Son yıllarda, bazı yaklaşımlar iki en ayırt olmak, takip edilmiştir. Üretilmesi uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSC) kullanılarak fare ve insan somatik hücre tekniğin geliştirilmesi eden 3, 4, nöral hücreler, bunlardan 5-7 den daha farklı olabilir. Ancak, üreten ve IPSC karakterize yoğun emek, teknikleri, ve zaman giriş talepleri, hatta bazen engelleyici. Kısa bir süre sonra, bir başka yaklaşım doğrudan somatik hücre 8, 9 ile ilgili nöronal hücrelerini transforme etmek üzere geliştirilmiştir. Elde edilen nöronlar proliferatif olmayan olduğu için, yoğun çalışmalar ve hücre büyük miktarda gerektirir ilaç tarama, içinde bunun uygulanmasını kısıtlar. Her iki teknikler, nöral kök doğrudan türetme avantajları almak için / somatik hücrelerden progenitör hücreleri hala iPSC üretimi ve karakterizasyonu ama yazarlara sıkıcı sürecini atlar çeşitli gruplar 10-12 tarafından araştırılmaktadırdes sonra nöral farklılaşma için nöral kök hücrelerin iyi bir sayı. Biz daha önce hematopoetik progenitör hücrelerin içine Yamanaka transkripsiyon faktörlerinin giriş izleyen, nöral kök hücreler doğrudan ortamı 13 seçerek bir nöral progenitör hücre kullanılarak oluşturulan olabileceğini göstermiştir. Burada, biz detaylı yöntem rapor.

<table><tbody><tr><td>Lenfosit ayırma ortamı</td><td>Lonza</td><td>17-829E</td><td>1x</td></tr><tr><td>SepMate</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>15415</td><td>15 ml</td></tr><tr><td>İnsan serumu</td><td>Invitrogen</td><td>34005-100</td><td></td></tr><tr><td>Antibiyotikler</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>1%</td></tr><tr><td>CD34 MultiSort Kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-056-701</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Cellgro</td><td>46-034-Cl</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>MACS LS sütunu</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan SFEM ortamı</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>9650</td><td>1x</td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Kalite Biyolojikler</td><td>112-035-101</td><td>1x</td></tr><tr><td>TPO</td><td>Peprotech</td><td>300-18</td><td>100 ng/ml</td></tr><tr><td>Flt-3</td><td>Peprotech</td><td>300-19</td><td>100 ng/ml</td></tr><tr><td>SCF</td><td>Peprotech</td><td>300-07</td><td>100 ng/ml</td></tr><tr><td>IL-6</td><td>Peprotech</td><td>200-06</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>IL-7</td><td>Peprotech</td><td>200-07</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>IPS Sendai Yeniden Programlama Kiti</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A1378001</td><td></td></tr><tr><td>Hücre sıyırıcı</td><td>Sarstedt</td><td>83.183</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>CryoTube şişeleri</td><td>Thermo</td><td>368632</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty kap</td><td>Thermo</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>12400-024</td><td>1x</td></tr><tr><td>N2 takviyesi</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>17502-048</td><td>1x</td></tr><tr><td>Sığır serum albümini</td><td>Sigma</td><td>A2934</td><td>%0.1 (a/h)</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>B27 takviyesi</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>17504-044</td><td>1x</td></tr><tr><td>NSC serum içermeyen ortam</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A1050901</td><td>1x</td></tr><tr><td>Poli-D-lizin/laminin kaplı lamel</td><td>BD Bioscences</td><td>354087</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma</td><td>A9501</td><td>300 ng/ml</td></tr><tr><td>C Vitamini</td><td>Sigma</td><td>A0278</td><td>0,2 mM</td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td>10 ng/ml</td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td>10 ng/ml</td></tr><tr><td>Poli-L-ornitin</td><td>Sigma</td><td>P4957</td><td>1x</td></tr><tr><td>PDGF-AA</td><td>Peprotech</td><td>100-13A</td><td>10 ng/ml</td></tr><tr><td>NT-3</td><td>Peprotech</td><td>450-03</td><td>2 ng/ml</td></tr><tr><td>Shh</td><td>Peprotech</td><td>1314-SH/CF</td><td>2 ng/ml</td></tr><tr><td>T3</td><td>Sigma</td><td>T6397</td><td>3 nM</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>%4</td></tr> <tr><td>PBS</td><td>Kalite Biyolojik</td><td>119-069-101</td><td>1x</td></tr><tr><td>Keçi serumu</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td>%4</td></tr> <tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Fare monoklonal anti-Nestin</td><td>Millipore</td><td>AB5922</td><td>1:1.000 seyreltme</td></tr><tr><td>Anti-SOX2 antikor</td><td>Uygulanan Kök Hücre</td><td>ASA0120</td><td>Kullanıma hazır</td></tr><tr><td>Fare anti-&beta; III-tubulin antikoru</td><td>Promega</td><td>G712A</td><td>1: 1.000 seyreltme</td></tr><tr><td>Tavşan anti-GFAP antikoru</td><td>Sigma</td><td>G4546</td><td>1:100 seyreltme</td></tr><tr><td>Anti-O4 antikoru</td><td>R& D Sistemleri</td><td>MAB1326</td><td>IgM; 1 ng/ml</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 keçi anti-tavşan antikoru</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>A11012</td><td>1:400 seyreltme</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 keçi anti-fare antikoru</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>A11001</td><td>1:400 seyreltme</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 keçi anti-fare IgM antikoru</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>A21042</td><td>1:250 seyreltme</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>1 &mu; g/ml</td></tr></tbody></table>

periferik kan hematopoetik progenitör hücreleri İnsan sinir kök hücre doğrudan İndüksiyon

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

İnsan hastalıkları spesifik nöronal kültürler insan nörolojik hastalıklar için in vitro bir model oluşturmak için gereklidir. Ancak, birincil insan yetişkin nöral kültürlere erişim eksikliği benzersiz zorluklar yükseltir. Uyarılmış pluripotent kök hücrelerin son gelişmeler (iPSC) hastaya özel IPSC yoluyla deri fibroblastlar nöral kültürleri türetmek için alternatif bir yaklaşım sağlar, ancak bu süreç emek yoğundur, özel uzmanlık ve kaynakların büyük miktarda gerektirir, ve birkaç ay sürebilir. Bu nörolojik hastalıkların çalışma Bu teknolojinin geniş bir uygulama önler. Bu sorunlardan bazılarının üstesinden gelmek için, biz iPSC derivasyon işlemini atlayarak, doğrudan insan yetişkin periferal kanından sinir kök hücreleri elde etmek için bir yöntem geliştirdik. Insan yetişkin periferal kanından zenginleştirilmiş hematopötik projenitör hücrelerin in vitro olarak kültürlendi ve Ekim transkripsiyonel faktörler Sox2 içeren Sendai virüsü vektörleri ile transfekte3/4, Klf4 ve c-Myc. ayrıca, temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) vasküler endotel büyüme faktörü (VEGF) içeren insan nöral projenitör ortamı kullanılarak seçilmektedir hücrelerinde morfolojik değişiklikler transfeksiyon ile sonuçlanır. Elde edilen hücreler, Nestin ve Sox2 gibi nöral kök hücre işaretçileri için ekspresyonu ile karakterize edilir. Bu nöral kök hücreler ayrıca nöronların, astroglial ve belirtilen farklılaşma medya oligodendrositlere ayırt edilebilir. Kolayca erişilebilir insan periferal kan örnekleri kullanarak, bu yöntem, nörolojik bozukluklar, in vitro model için nöral hücrelere daha fazla farklılaşması için nöral kök hücrelerini elde etmek için kullanılabilir ve bu hastalıkların patojenezinde ve tedavi ile ilgili çalışmalar ilerleyebilir.

<html> CD34 hücrelerinin kalitesi nöral kök hücre naklinin başarısı için kritik öneme sahiptir. Yüksek kaliteli CD34 hücreleri kültür ilk birkaç gün boyunca çoğalırlar ve sadece kültür damarları (Şekil 1A) alt üzerinde yüzen, sigara yapışık, homojen yuvarlak hücreler olarak görünür. Hücre genişletmek spesifik olmayan hücre agrega hücre kültürü sırasında oluşabilecek ise, zaman (Şekil 1B) üzerinden genişletir agrega, ve dernek başarılı enfeksiyon sonuçları gevşek. Yapışık hücreler genelli...

Bir yöntem de periferik kan hücrelerinden zenginleştirilen hematopoietik projenitör hücrelerinden insan nöral kök hücrelerini elde etmek için geliştirilmiştir.

Periferik kan Hematopoetik Progenitör Hücreleri İnsan Sinir Kök Hücre Doğrudan İndüksiyon

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

Bu prosedürün genel amacı, kan hücrelerinden doğrudan nöral kök hücreler indüklemektir. Bu işlem, öncelikle kandan CD 34 pozitif hematopoetik progenitör hücrelerin zenginleştirilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise, CD 34 hücrelerinin transkripsiyon faktörleri içeren sendi virüsü ile transfekte edilmesidir.Ardından, seçici ortam kullanılarak nöral kök hücreler türetilir. Son adım, indüklenmiş nöral kök hücrelerin nöronlara, astroglialara ve oligodendrositlere farklılaştırılmasıdır. Nihayetinde, elde edilen hücreleri karakterize etmek için immünofloresan mikroskopi kullanılır.Bu tekniğin, fibroblastlardan doğrudan nöron türetme veya iPS üretimi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, zahmetli iPS üretimi ve hesaplama sürecini devre dışı bırakırken, yine de nöronlara farklılaşabilen çok miktarda nöronal hücre sağlamasıdır. Bu yöntemle ilgili fikrim, transfekte edilmiş ve yapışmış CD 34 hücrelerinin, primer kültür nörojenik hücrelere çok benzer özellikler gösterdiğini fark ettiğimde ortaya çıktı; bu prosedür laboratuvarımdan bir teknisyen olan Marines tarafından uygulanacaktır. Metin protokolündeki talimatlara uygun olarak periferik kan mononükleer hücrelerinden CD 34 hücrele

direct-induction-human-neural-stem-cells-from-peripheral-blood

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Biz insan nöronal atalarıdır ve sinir onarımı için gelişmekte olan MSS nöronal hücre tipleri büyük bir arz türetme sağlayan küçük moleküller ile tanımlanan koşullar altında tutulan pluripotent insan embriyonik kök hücreleri doğrudan neuroblasts indüksiyonu için bir protokol kurduk.

Küçük Molekül İndüksiyon Pluripotent İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İnsan Nöronal atalarıdır ve Nöronlar Verimli türetilmesi

Burada tek bir lentiviral yeniden programlanması vektörü kullanılarak periferal kan 3-4 ml insan iPSCs üretimi için basit ve etkili bir protokol göstermektedir. Hazır kan hücrelerinin yeniden programlanması daha geniş bir araştırma toplum için erişilebilir kılarak IPSC teknoloji kullanımı hızlandırmak için vaat ediyor.

STEMCCA lentiviral Vektör Kullanma Çevresel Blood İnsan İsteyerek Pluripotent Kök Hücre Üretimi

Bu video, periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMNC'ler) Sendai virüsü kullanılarak indüklenmiş nöral kök hücrelere (iNSC'ler) yeniden programlanmasını göstermektedir. Sendai virüsü, hücreleri yeniden programlamak için verimli ve güvenli bir araç sunan, entegre olmayan bir virüstür.

Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinden (PBMNC'ler) İndüklenmiş Nöral Kök Hücrelerin (iNSC'ler) Üretilmesi: PBMNC'leri iNSC'lere Yeniden Programlamak için Sendai Virüsü Tabanlı Bir Prosedür

Bu video, genetik olarak değiştirilmiş hematopoietik progenitör hücrelerin nöronal kök hücrelere doğrudan yeniden programlanmasını göstermektedir. Hematopoietik progenitör hücreler tarafından eksprese edilen transkripsiyon faktörleri, dönüşümlerini kolaylaştıran bir dizi moleküler olayı tetikler. İndüklenmiş nöronal kök hücreleri seçmek ve büyütmek için daha spesifik ortamlar kullanılır.

Hematopoetik Progenitör Hücrelerin Nöral Kök Hücrelere Doğrudan Yeniden Programlanması

Uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi otolog nakli türetilmesi için ilginç umutları sağlar. Ancak, pluripotent devlet ve zahmetli yeniden farklılaşma yoluyla ilerleme hala klinik çeviri engellemektedir. Burada erişkin insan fibroblast türetme ve uyarılmış nöral progenitör hücrelerin içine doğrudan dönüşüm ve nöral soy içine sonradan farklılaşmayı açıklar.

Yetişkin İnsan Fibroblastları türetilmesi ve Genişletilebilir Sinir Progenitör Hücreler içine Doğrudan Dönüşüm

Bu protokol, transkripsiyon faktörlerinin zorlanmış ekspresyonu yoluyla insan pluripotent kök hücrelerinden hemojenik endotel ve multipotansiyel hematopoietik progenitörlerin verimli indüksiyonunu açıklar.

İnsan Pluripotent Kök Hücreleri Transkripsiyon Faktörleri aşırı ifadesinin doğrudan Hemogenic Endotelyumunun uyarılması ve Kan

Periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC'ler) indüklenmiş pluripotent kök hücrelere (iPSC'ler) yeniden programlanması için bir protokol öneriyoruz. Transdüksiyon kan hücrelerini santrifüjleme ile matris kaplı plakalara kaplayarak, iPSC'ler yüzen hücrelerden başarılı bir şekilde indüklenir. Bu teknik, PBMC'ler ve CBMC'ler gibi hücreler için basit ve etkili bir yeniden programlama protokolü önerir.

Sendai Virüs ve santrifüj kullanılarak Kan Hücreleri indüklenmiş pluripotent kök hücre Üretimi

Bu protokol, insan yetişkin periferik kan hücrelerinden entegrasyon gerektirmeyen iPSC'lerin verimli bir şekilde üretilmesi için ayrıntılı bir yöntemi açıklar. Yeniden programlama faktörlerini ifade etmek için dört oriP/EBNA bazlı epizomal vektörün kullanılmasıyla, KLF4, MYC, BCL-XL veya OCT4 ve SOX2, 1 mL periferik kandan binlerce iPSC kolonisi elde edilebilir.

Epizomal vektörlerin kullanılması insan periferik kan mononükleer hücrelerinden entegrasyon içermeyen uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Protokol, çevresel kan mononükleer hücrelerin yeniden programlanması ile sinirsel kök hücrelerini Sendai virüs enfeksiyonu, dopaminerjik nöronlar içine inscs farklılaşma, tek taraflı-lesioned içine da öncüleri transplantasyon teşvik sunar Parkinson hastalığı fare modelleri ve PD tedavisi için iNSC-türetilen DA öncüleri güvenlik ve etkinliğini değerlendirilmesi.

Periferik mononükleer hücrelerden Indüklenen nöral kök hücrelerin üretimi ve transplantasyon çalışmaları için Dopaminergic neuron precursors doğru farklılaşma

Burada, bir besleyici ve Xeno-ücretsiz durumda insan pluripotent kök hücrelerinden hemogenik endotelyum tam olarak oluşturmak için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem hastalık modelleme ve terapötik bileşikler için tarama geniş uygulamalara sahip olacaktır.

Bir besleyici içinde ınsan pluripotent kök hücrelerinden hemogenik endotelyum farklılaşma-ve Xeno-ücretsiz tanımlı koşul

Burada, dört miyeloid soya immünotipik karakterizasyon ve sitokin kaynaklı cd34+ hematopoetik kök ve ataat hücrelerinin farklılaşması için bir protokol sıyoruz. Bu protokolün uygulamaları cd34+ hücrelerin miyeloid farklılaşması üzerinde miyeloid hastalık mutasyonları veya küçük moleküllerin etkisi üzerine araştırmalar içerir.

İnsan Kordon Kanı Kaynaklı CD34 Pan-miyeloid Farklılaşması+ Hematopoetik Kök ve Progenitor Hücreleri

Öğrenin, periferik kan CD34+ hücrelerinden viral vektörlerle sinir kök hücreleri doğrudan indüksiyon yöntemini. Bu teknik, nöron, astrosit ve oligodendrosit elde ederek rejeneratif tıpta hasta özgü hücre kaynağı sağlar.

Periferik kan Hematopoetik Progenitör Hücreleri İnsan Sinir Kök Hücre Doğrudan İndüksiyon

Daha fazla video keşfet