Periferik kan Hematopoetik Progenitör Hücreleri İnsan Sinir Kök Hücre Doğrudan İndüksiyon

Bu prosedürün genel amacı, kan hücrelerinden nöral kök hücreleri doğrudan indüklemektir. Bu, ilk olarak CD 34 pozitif hematopoietik progenitör hücrelerin kandan zenginleştirilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, CD 34 hücrelerinin sendi virüsü içeren transkripsiyonel faktörler ile transfekte edilmesidir.

Daha sonra, nöral kök hücreler seçici ortam kullanılarak türetilir. Son adım, indüklenen nöral kök hücreleri nöronlara, astroglialara ve oligodendrositlere ayırmaktır. Sonuçta, elde edilen hücreleri karakterize etmek için immünofloresan mikroskobu kullanılır.

Bu tekniğin mevcut yönteme göre en büyük avantajı, örneğin nöronların doğrudan fibroblasttan kalma süresi, ayrıca IPS üretimi, bu yöntemin sıkıcı IPS üretimi ve hesaplama sürecini atlaması, ancak yine de nöronlarla ilişki kurabilen, farklılaşabilen büyük miktarda nöronal hücre sağlamasıdır. Bu yöntem için ilk olarak, ekli transfekte edilmiş CT 34 hücrelerinin aslında primer kültürlenmiş nöro progenik hücrelere çok benzer olduğunu fark ettiğimde aklıma geldi, bu da prosedürün hayatımdan bir teknisyen olan Marines olacağını gösteriyor. CD 34 hücrelerini periferik kan mononükleer hücrelerinden metin protokolündeki talimatlara göre izole ettikten sonra, CD 34 hücrelerini Resus ile kültürleme işlemine başlayın, CD 34 hücrelerini CD 34 ortamında süspanse edin, daha sonra hücreleri üç kez 24 oyuklu bir plakaya tohumlayın bir mililitre ortamda kuyu başına 10 ila beşinci hücre.

% 5 karbondioksit içeren 37 santigrat derece doku kültürü inkübatöründe 24 saat inkübe ettikten sonra, yüzen hücreleri toplayın ve hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında 110 kez G'de santrifüjleyin. Daha sonra süpernatanı atın ve hücreleri taze CD 34 bakım ortamında yeniden süspanse edin. Bir mililitre ortamda oyuk başına 10 ila beşinci hücreye bir kez 24 oyuklu yeni bir plaka görün, beş gün daha% 5'lik bir karbondioksit inkübatöründe 37 santigrat derecede inkübe edin ve ortamın yarısını her gün değiştirin.

Süpernatantın üst yarısını, CD 34 hücreleri beşinci günde burada gösterildiği gibi kuyuların dibinde iken dikkatlice aspire ederek. Kaplamadan sonra, CD 34 hücrelerini toplayın ve hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 170 kez G'de santrifüjleyin, süpernatanı atın, hücreleri daha önce olduğu gibi yeniden süspanse edin ve bir mililitre ortamda oyuk başına 10 ila beşinci hücreye bir kez 24 oyuklu taze bir plaka tohumlayın. Ardından, bir cyto tune IPS Sendi yeniden programlama kitini çözün.

Tüplerin altlarını önce 37 santigrat derece su banyosuna 10 saniye daldırarak ve ardından oda sıcaklığında tamamen çözerek. Tüpleri kısaca santrifüjleyin ve buzun üzerine koyun. Sendai virüsü karışımını, ilgili parti için analiz sertifikasında listelenen her bir virüsün önerilen hacmini karıştırarak hazırlayın.

15'lik bir enfeksiyon çokluğu önerilir. Sendai virüsü karışımını CD 34 hücrelerinin her bir kuyusuna ekleyin. Daha sonra plakayı hafifçe sallayarak kuyuları karıştırın.

Hücreleri 24 saat sonra% 5'lik bir karbondioksit inkübatöründe 37 santigrat derecede inkübe edin. İletim verimliliğini gözlemleyin. Burada gösterilenler gibi hücre kümelerinin ve kürelerin başarılı transdüksiyonun göstergeleri olduğuna dikkat edin.

Daha sonra hücreleri, doku kültürü inkübatöründe, bağlı hücreler görünene ve burada her gün gösterildiği gibi% 30 ila 50 birleşmeye ulaşana kadar beş ila yedi gün boyunca inkübe edin. Ortamın üst yarısını dikkatlice başka bir kuyuya aktararak ortamın yarısını değiştirin. Hücre küreleri yenisine aktarılırsa, eşit miktarda taze ortam ekleyin.

Ters çevrilmiş mikroskobu kullanarak hücrelerin eş akıcılığını kontrol edin. Hücreler% 30 ila% 50 birleştiğinde, süpernatanı aspire edin ve rezerve edin ve daha sonra süpernatan santrifüjündeki küreleri kullanarak bir yedek plaka yapmak için her bir kuyucuğa bir mililitre nöral progenitör ortam ekleyin, yedek süpernatan 10 dakika boyunca 170 kez G'de. Daha sonra süpernatanı aspire edin ve peleti matrigel kaplı 24 oyuklu bir plakada nöral progenitör orta plakada yeniden süspanse edin.

Daha önce olduğu gibi, hücreler% 60 ila 80 birleşmeye ulaşana kadar her gün bir hücre plakasındaki ortamı değiştirin. Genellikle bir hafta sonra. Hücreler gerekli birleşme noktasına ulaştığında, süpernatanı aspire edin ve her birine bir mililitre nöral kök hücre ortamı ekleyin.

Daha sonra bir hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri ayırın ve ardından çok nazik pipetleyin. Daha sonra, hücreleri 24 oyuklu plakanın bir oyuğundan altılı bir oyuğa aktarın. Kuyu plakası.

Kuyuya bir mililitre daha orta ekleyin ve tüm kuyucuklar için prosedürü tekrarladıktan sonra, altı kuyulu plakayı 37 santigrat derece% 5 karbondioksit inkübatörüne yerleştirin. Hücreler %60 birleşmeye ulaşana kadar her gün ortamın tam hacmini değiştirin, bu süreden sonra hücreleri farklılaşmamış nöral kök hücrelerin bir kısmını dondurmak için gösterildiği gibi bir ila üç oranında ayırın ve yeniden düzenleyin. İlk olarak, nöral kök hücre ortamına %20 dimetil sülf oksit veya DMSO ekleyerek kök hücre dondurma ortamını hazırlayın ve buz üzerine yerleştirin.

Daha sonra altı oyuklu plakadaki hücreleri ayırın. Hücre sıyırıcı ve nazik pipetleme kullanma. Bir hücre sayımı için süspansiyonun bir kısmını ayırın ve daha sonra hücreler dönerken oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 170 kez G'de santrifüjleyin, bir hemo, sitometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak süspansiyon alikotundaki hücreleri sayın ve mililitre başına altı hücreye bir kez 10 hücre konsantrasyonu vermek için gereken ortamın hacmini hesaplayın.

Döndürme bittikten sonra, süpernatanı atın ve peleti nöral kök hücre ortamında mililitre başına 10 ila altı hücre arasında bir kez yeniden süspanse edin. Daha sonra, bir mililitrelik bir hacimde eşit hacimde dondurma ortamı pipeti, beş kez 10 ila beşinci hücrelere bir kriyo şişesine ekleyin ve hücreleri üreticinin talimatlarına göre bir dondurma kabında dondurun. Altı oyuklu plakadaki nöral kök hücreler %80 birleşime ulaştığında, onları bir lastik polis memuru kullanarak ayırın ve ardından nazikçe pipetleme ile ayırın.

Hücre süspansiyonunu steril bir tüpe koyun. Bir hemo, sitometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın ve hücre süspansiyonunun konsantrasyonunu nöral kök hücre ortamı ile mililitrede 10 ila beşinci hücreye ayarlayın. Daha sonra, istenen sayıda kuyucuk için prosedürü tekrarladıktan sonra, hücre süspansiyonunun bir mililitresini bir poliD lizin ve 24 oyuklu bir plakanın bir oyuğunda laminat kaplı kapak kızağı üzerine pipetleyin.

Daha önce olduğu gibi 24 saat inkübe edin. Kuluçka süresi geçtikten sonra, ortamı aspire edin ve nöral farklılaşma ile değiştirin. Medium, 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte iki hafta boyunca inkübe edin ve ortamı iki hafta sonra haftada iki kez değiştirin.

Nöronal kök hücreler burada gösterildiği gibi tamamen farklılaşmalı ve immünofloresan boyama gibi sonraki uygulamalar için hazır olmalıdır. İlk iki görüntü, nöral kök hücrelerin yuva yaptığını ve SOX ikisini ifade ettiğini göstermektedir. Üçüncü görüntü, OCT dördünün ifade edilmediğini gösterirken, DPI nükleer bir işaretleyici olarak kullanılır ve ölçek çubuğu 200 mikronu temsil eder.

Videoda özetlenen farklılaşma protokolünü takip ettikten sonra, farklılaşmış nöronlar nöronal belirteç beta üç tübülin'i eksprese eder. İnsan nöral kök hücreleri de glial hücrelere farklılaştırılabilir. Astrositlere farklılaştığında, hücreler astrositik işaretleyici GFAP'yi eksprese eder.

Son olarak, bu görüntüde, hücreler oligodendrositlere farklılaştırılmış ve oligodendrosit markörünü ifade etmiştir. O dört. Bir kez ustalaştıktan sonra, periferik kandan indüklenmiş insan nöral kök hücrelerinin üretilmesi yaklaşık üç hafta içinde yapılabilir.

Düzgün bir şekilde gerçekleştirilirse, nöro kök hücreler nöronları daha da farklılaştırabilir ve uzun ve karmaşık IPS oluşturma süreçleri nedeniyle yöntemi belirsizleştirebilir ve geliştirildikten sonra hastaya özgü nöronal kültürler oluşturmak için kolay bir seçenek olabilir. Bu teknik, sinirbilim alanındaki araştırmacıların, özellikle bireysel hasta örneklerinden elde edilen belirli bozukluklardaki genetik farklılıkları daha iyi temsil edebilecek çeşitli nörolojik bozukluklar için bireysel hücre kültürü modellemesini keşfetmeleri için yol açar.