Name: Pretargeted PET Görüntüleme Bioorthogonal Ters Elektron Talep Diels-Alder Katılma Harnessing (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-03T15:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Keşfedin, kolorektal kanser için biyoortogonal ters elektron talep Diels-Alder siklokatılma kullanarak ön hedeflemeli PET görüntüleme stratejisi geliştirin. Bu yöntem, yüksek kontrastlı tümör görüntüleme ve düşük radyasyon dozu sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, yararlı konuşmalar için Prof. Ralph Weissleder, Dr. Pat Zanzonico ve Dr. NagaVaraKishore Pillarsetty'ye ve finansman için NIH'ye teşekkür eder (BMZ: 1K99CA178205-01A1)

ETİK TABLOSU: anlatıldığı in vivo hayvan deneyleri Tüm onaylanmış protokole ve Memorial Sloan Kettering Kanser Merkezi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) etik kurallar altında göre yapıldı. Tz-Bn-Nota 1. Sentezi <ol><li> Küçük bir tepkime kabında, 600 ul NaHCO 3 tamponu (0.1 M, pH 8.1) içinde 7 mg NH2 -Bn-nota (1.25 x 10 -2 mmol) ile çözülür. Çözeltinin pH kontrol edin. Gerekirse, CO 3 0.1 M Na-2 az miktar kullanılarak 8.1 solüsyonun pH derecesinin ayarlanması. </li><li> 1.7 ml mikrosantrifüj tüpü içinde 0.5 mg Tz-NHS (1.25 x 10 -3 mmol) NH2 -Bn-NOTA solüsyonu ekleyin. Not: Tz-NHS, kuru ya tartıldı ve kuru DMF ya da DMSO (&lt;50 ul) içindeki bir stok çözeltisi eklenebilir. </li><li> Elde edilen reaksiyon çözeltisi, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca reaksiyona girmesine izinHafif ajitasyon ile. </li><li> 30 dakika sonra, reaksiyona girmeyen NH2 -Bn-nota çıkarmak için ters-fazlı C18 HPLC kromatografisini kullanarak ürünü temizler. Tz-NHS ve Tz-Bn-NOTA en 525 nm dalga boyunda gözlemlenmiştir ise NH2 -Bn-NOTA, 254 nm bir dalga boyunda izlenebilir. NOT: Tutma süreleri açıkça her laboratuvar (pompalar, sütunlar, tüp, vb) HPLC ekipman kurulumu son derece bağlıdır. Bununla birlikte, bir örnek sunmak için ise 0 gradyanı: 100 MeCN / H2O 100 (her ikisi de% 0.1 TFA ile birlikte): 0 MeCN / H2O içinde 25 dakika ve analitik bir 4.6 x 250 mm C18 kolon kullanılmıştır , Tz-Bn-nota, Tz-NHS ve NH2 tutma süreleri -Bn-NOTA sırasıyla yaklaşık 15 dakika, 16.5 dakika ve 10 dakika olacaktır. Ürün tek bir çalışma ya da bir yarı-hazırlayıcı veya hazırlayıcı C18 HPLC kolonu kullanılarak birden çok çalışır, ya da diğer reaksiyon bileşenlerine de saflaştırılabilir. 1H-NMR, analistenen analitik HPLC ve ESI-MS tamamlanmış Tz-Bn-NOTA ön-maddelerin saflığının doğrulanması için kullanılır ve yöntemlerdir. 11 </li><li> Sıvı azot kullanılarak toplanan HPLC yıkama sıvısı dondurun. </li><li> Opak alüminyum folyo dondurulmuş toplama tüpü sarın. </li><li> Bir liyofilize damar O donmuş toplama tüpü yerleştirin / N HPLC mobil faz kaldırmak için. </li><li> -80 ° C&#39;de karanlıkta saflaştırılmış ürünü (bir katı parlak pembe) saklayın. NOT: Bu prosedür kabul edilebilir bir durak noktasıdır. tamamlandıktan Tz-Bn-NOTA ön-madde, bu koşullar altında en az 1 yıl stabildir. </li></ol> HuA33-TCO immünokonjugatın 2. Hazırlık <ol><li> 1.7 ml mikrosantrifüj tüpü içinde, 1 mg / ml kuru DMF TCO-NHS&#39;nin (2,7 mM) çözeltisi hazırlayın. </li><li> 1.7 ml mikrosantrifüj tüpü içinde, bir 2 mg / ml fosfat tamponlu tuzlu su, 1 ml huA33 arasında (13.3 uM) çözeltisi, pH 7.4 (0.01 M PO 4 3- hazırlamak </sub&gt; 0.154 M NaCI). </li><li> Az miktar 0.1 M Na-2 CO 3 (&lt;5 ul) kullanılarak, 8,8-9,0 antikor solüsyonun pH derecesinin ayarlanması. PH değerini izlemek için bir mikroelektrot ile pH kağıdı veya pH metre ya kullanın ve pH, 9.0 üzerinde yükselmeye izin vermemek için dikkatli olun. </li><li> Antikor çözeltisi doğru pH değerinde sonra, aktive edilmiş ester 8 molar eşdeğer tekabül TCO-NHS bir çözelti hacminin ilave edin. Örneğin, 2 mg / ml huA33 antikor çözeltisi (1.33 x 10 -8 mol huA33), 1 ml için 1 mg / ml bir TCO-NHS çözeltisi (1.07 x 10 -7 mol TCO-NHS), 7.9 ul ekleyin. Çözelti içinde hacme göre% 5 DMF aşılmamalıdır. </li><li> Yavaşça mikrosantrifüj tüpü birkaç kez ters yüz edilerek çözelti karıştırılır. </li><li> Opak alüminyum folyo mikrosantrifüj tüp sarın. </li><li> Çözelti, hafif çalkalama ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübasyona izin verin. </li><li> Oda sıcaklığında 1 saat sonra, bir önceden paketlenmiş tek SIZ kullanılarak elde edilen immünokonjugat arındırmakE dışlama kullanımlık tuz alıcı sütun. Depolama sırasında sütun üzerinde mevcut olan herhangi bir koruyucu çıkarmak için satıcı tarafından tarif edildiği gibi İlk olarak, boyut dışlama sütununa yıkayın. Daha sonra, boyut dışlama sütununa reaksiyon karışımına ilave edildi, 1.5 ml% 0.9 steril tuzlu su ile sütun durulama ve daha sonra, yıkama sıvısı olarak% 0.9 steril tuzlu su içinde 2 ml kullanılarak ürün toplamak. NOT: Bu adım, bir 2 ml solüsyon olarak tamamlanan huA33-TCO verecektir. </li><li> UV-Vis spektrofotometre üzerinde bileşke huA33-TCO konsantrasyonunu ölçün. </li><li> Daha yüksek bir konsantrasyonu, arzu edildiği takdirde, 50,000 molekül ağırlığı kesmesi olan bir santrifüj filtre birimi kullanılarak huA33-TCO çözelti konsantre edilir. NOT: huA33 ve diğer iyi bilinen antikor (örneğin, bevasizumab, trastuzumab, setuksimab, ve J591) &#39;in bir dizi konsantre edilmeden çok dayanıklı iken, toplama ve çökelme diğer durumlarda konsantrasyonuna bağlı olabileceğine dikkat etmek önemlidir. Araştırmacılar bu proced çalışılıyorYeni bir antikor ile ure edebiyat veya antikor konsantre olsun veya olmasın ile ilgili söz konusu antikorun kendi bilgi güvenmeli. </li><li> Karanlıkta 4 ° C&#39;da tamamlanmıştır huA33-TCO immüno saklayın. NOT: Bu prosedür kabul edilebilir bir durak noktasıdır. tamamlandıktan mAb TCO konjügat, bu saklama koşulları altında en az 3 ay boyunca stabil olmalıdır. </li></ol> Tz-Bn-Nota 3. 64 Cu Radyo-etiketlenmesi NOT: protokolün Bu adım işlenmesini ve radyoaktivite manipülasyonu içerir. Veya radyoaktivite ile başka bir işi yapan - - Bu adımları gerçekleştirmeden önce araştırmacılar kendi kurumun Radyasyon Güvenliği Bölümü ile başvurmalısınız. Iyonize radyasyona maruziyeti en aza indirmek için mümkün olan tüm adımları atın. <ol><li> 1.7 ml mikrosantrifüj tüpü içinde, 0.5 mg / ml (723 uM) t-Bn-nota bir solüsyon hazırlanır. </li><li> 1.7 mi microC olarakentrifuge tüp, 0.2 M NH4OAc, pH 5.5 tampon maddesi, 400 ul Tz-Bn-NOTA çözeltisi (5 ug) ve 10 ul ekle. </li><li> Uygun radyokimyasal not tutma adına, ölçmek ve önce ve aşağıda protokol (3.4-3.8) olarak izleyen adımlardan sonra bir doz kalibratörü kullanılarak numune radyoaktivite miktarı kaydedin. Bu radyokimyasal verimi doğru kararlılıkla yardımcı olacaktır. </li><li> Tz-Bn-NOTA çözeltisine 64 Cu 2,000 uCi (74 MBq) ekleyin. Not: Genellikle, [64 Cu] CuCl 2 0.1 N HCI küçük bir hacimde (&lt;30 ul) temin edilir, ve bu nedenle sadece küçük miktarlarda (&lt;10 | il), bu stok çözeltisi, radyo-etiketleme reaksiyonu için ihtiyaç vardır. [64 Cu] CuCI 2 stokunun büyük hacimler gerekiyorsa, Radyoetiketleme reaksiyonu genel reaksiyon hacmi artan hoşgörülü olduğunu. Bununla birlikte, radyo-etiketleme, reaksiyon çözeltisinin pH&#39;ı sağlamak için dikkatle izlenmelidiro pH 4.0 altına düşmemesi. </li><li> Çözelti, hafif çalkalama ile oda sıcaklığında 10 dakika inkübasyona izin verin. </li><li> Kuluçkadan 10 dakika sonra, ters-fazlı C18 HPLC kromatografisini kullanarak ürünü temizler. Alıkoyma süreleri Açıkçası her laboratuvar (pompalar, sütunlar, tüp, vb) HPLC ekipman kurulumu son derece bağlıdır. Bununla birlikte, bir örnek sunmak için, eğer bir gradyan 5:95 MeCN / H2O 95 (her ikisi de% 0.1 TFA ile birlikte): 5 MeCN / H2O: 15 dak boyunca kullanılan, 64 Cu TZ retansiyon süresi Serbest, kompleks 64 Cu yaklaşık 2-4 dk çözücü ön Zehir olurken Bn-NOTA civarında 9.8 dakika olmalıdır. </li><li> Bir dönen buharlaştıncı kullanarak, HPLC yıkama sıvısı çıkarın. </li><li> % 0.9 steril tuzlu su içinde 64 Cu-Tz-Bn-NOTA ürün içinde yeniden çözülür. NOT: 64 Cu 12.7 saat fiziksel yarılanma ömrü göz önüne alındığında, bu prosedürde kabul edilebilir bir durak noktası değildir. 64 sentezini Cu-Tz-Bn-DEĞİL gerçekleştirinBir radyoligandın enjeksiyonundan hemen önce ve Adım 4.5 hemen 3.7 Adım takip. </li></ol> Vivo Pretargeted PET Görüntüleme 4. NOT: Protokol Bölüm 3 gibi, protokol, bu adımı işlenmesini ve radyoaktivite manipülasyonu içerir. Bu adımları gerçekleştirmeden önce araştırmacılar kendi kurumun Radyasyon Güvenliği Bölümü ile başvurmalısınız. Iyonize radyasyona maruziyeti en aza indirmek için mümkün olan tüm adımları atın. <ol><li> Ve bir kadın atimik çıplak fare, deri altı implantı 1 x 10 6 SW1222 kolorektal kanser hücreleri bu (9-12 gün aşılamadan sonra) 100-150 mm 3 xenograftlarının içine büyümeye izin verin. 11 </li><li> % 0.9 steril tuzlu su içinde 0.5 mg / ml&#39;lik bir konsantrasyona kadar Protokolü Bölüm 2 huA33-TCO çözeltisi bir kısım seyreltin. </li><li> Ksenograft taşıyan fare kuyruk venine huA33-TCO çözeltisi 200 ul (100 ug) enjekte. </li><li> Fare tümör huA33-TCO birikimi için 24 saat izin verin. </li><li> % 0.9 steril tuzlu su içinde, 1.5 mCi / ml &#39;lik bir konsantrasyona kadar 64 Cu-Tz-Bn-NOTA radyoligand seyreltin. </li><li> Kuyruk damarına (6.7 MBq / nmol bir özgül etkinliğe varsayarak, 64 Cu-Tz-Bn-nota 1.6 nmol;, 11.1 MBq 300 uCi) 64 Cu-Tz-Bn-NOTA radyoligand çözeltisi 200 ul enjekte nakil doku taşıyan kobay fareler. </li><li> Istenen görüntüleme zaman noktasında (örneğin, 2, 6, 12 ya da 24 saat sonra enjeksiyon), bir% 2 izofluran ile anestezi fare: oksijen gazı karışımı ile gerçekleştirilmektedir. </li><li> Küçük hayvan PET tarayıcı yatağının üzerinde fare yerleştirin. Oksijen gazı karışımı:% 1 izofluran kullanarak tarama sırasında anestezi koruyun. Tarayıcı yatakta hayvan yerleştirerek önce, ayak-tutam yöntemi kullanılarak anestezi doğrulamak ve anestezi sırasında kurumasını önlemek için fare gözlerine veteriner merhem uygulayın. </li><li> Statik aracılığıyla fare PET veri elde350-700 keV enerji penceresi ve 6 nsaniye bir tesadüf zamanlama penceresini kullanarak 20 milyon tesadüf olaylar minimum tarayın. Görüntü yakalanmasını tamamladıktan sonra, gözetimsiz fare bırakmayın ve bilinci kazanmış kadar diğer fareler ile bir kafese koymayın. </li></ol>

<ol><li>Wu, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+and+antimatter%3A+The+resurgence+of+immuno-PET%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">Antibodies and antimatter: The resurgence of immuno-PET.</a> Journal of Nuclear Medicine. 50, 2-5 (2009).</li>
<li>Zeglis, B. M., Lewis, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+the+construction+of+radiometallated+bioconjugates+for+positron+emission+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Dalton+Transactions%22%5BJournal%5D)">A practical guide to the construction of radiometallated bioconjugates for positron emission tomography.</a> Dalton Transactions. 40, 6168-6195 (2011).</li>
<li>Hollander, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bispecific+antibodies+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Bispecific antibodies for cancer therapy.</a> Immunotherapy. 1, 211-222 (2009).</li>
<li>Liu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+pretargeting+in+mice+using+99mTc-labeled+morpholino%2C+a+DNA+analog%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tumor pretargeting in mice using 99mTc-labeled morpholino, a DNA analog.</a> Journal of Nuclear Medicine. 43, 384-391 (2002).</li>
<li>Boerman, O. C., van Schaijk, F. G., Oyen, W. J. G., Corstens, F. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pretargeted+radioimmunotherapy+of+cancer%3A+Progress+step+by+step%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pretargeted radioimmunotherapy of cancer: Progress step by step.</a> Journal of Nuclear Medicine. 44, 400-411 (2003).</li>
<li>Goldenberg, D. M., Sharkey, R. M., Paganelli, G., Barbet, J., Chatal, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+pretargeting+advances+cancer+radioimmunodetection+and+radioimmunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Antibody pretargeting advances cancer radioimmunodetection and radioimmunotherapy.</a> Journal of Clinical Oncology. 24, 823-834 (2006).</li>
<li>Sharkey, R. M., Chang, C. H., Rossi, E. A., McBride, W. J., Goldenberg, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pretargeting%3A+taking+an+alternate+route+for+localizing+radionuclides%5BTitle%5D)+AND+%22Tumor+Biology%22%5BJournal%5D)">Pretargeting: taking an alternate route for localizing radionuclides.</a> Tumor Biology. 33, 591-600 (2012).</li>
<li>Sharkey, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+delivery+of+radionuclides+for+imaging+and+therapy+of+cancer+using+pretargeting+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Improving the delivery of radionuclides for imaging and therapy of cancer using pretargeting methods.</a> Clinical Cancer Research. 11, 7109-7121 (2005).</li>
<li>Schultz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tetravalent+single-chain+antibody-streptavidin+fusion+protein+for+pretargeted+lymphoma+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A tetravalent single-chain antibody-streptavidin fusion protein for pretargeted lymphoma therapy.</a> Cancer Research. 60, 6663-6669 (2000).</li>
<li>Lewis, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+evaluation+of+pretargeted+64Cu+for+tumor+imaging+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vivo evaluation of pretargeted 64Cu for tumor imaging and therapy.</a> Journal of Nuclear Medicine. 44, 1284-1292 (2003).</li>
<li>Zeglis, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pretargeted+PET+imaging+strategy+based+on+bioorthgonal+Diels-Alder+click+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">A pretargeted PET imaging strategy based on bioorthgonal Diels-Alder click chemistry.</a> Journal of Nuclear Medicine. 54, 1389-1396 (2013).</li>
<li>Blackman, M. L., Royzen, M., Fox, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrazine+ligation%3A+fast+bioconjugation+based+on+inverse+electron+demand+Diels-Alder+reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Tetrazine ligation: fast bioconjugation based on inverse electron demand Diels-Alder reactivity.</a> Journal of the American Chemical Society. 130, 13518-13519 (2008).</li>
<li>Devaraj, N. K., Upadhyay, R., Hatin, J. B., Hilderbrand, S. A., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+sensitive+pretargeted+labeling+of+cancer+cells+through+a+tetrazine%2Ftrans-cyclooctene+cycloaddition%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie-International+Edition%22%5BJournal%5D)">Fast and sensitive pretargeted labeling of cancer cells through a tetrazine/trans-cyclooctene cycloaddition.</a> Angewandte Chemie-International Edition. 48, 7013-7016 (2009).</li>
<li>Devaraj, N. K., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomedical+applications+of+tetrazine+cycloadditions%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Biomedical applications of tetrazine cycloadditions.</a> Accounts of Chemical Research. 44, 816-827 (2011).</li>
<li>Devaraj, N. K., Weissleder, R., Hilderbrand, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrazine-based+cycloadditions%3A+application+to+pretargeted+live+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tetrazine-based cycloadditions: application to pretargeted live cell imaging.</a> Bioconjugate Chemistry. 19, 2297-2299 (2008).</li>
<li>Keliher, E. J., Reiner, T., Turetsky, A., Hilderbrand, S., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-yielding%2C+two-step+18F+labeling+strategy+for+18F-PARP1+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22ChemMedChem%22%5BJournal%5D)">High-yielding, two-step 18F labeling strategy for 18F-PARP1 inhibitors.</a> ChemMedChem. 6, 424-427 (2011).</li>
<li>Reiner, T., Earley, S., Turetsky, A., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioorthogonal+small-molecule+ligands+for+PARP1+imaging+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Bioorthogonal small-molecule ligands for PARP1 imaging in living cells.</a> ChemBioChem. 11, 2375-2377 (2010).</li>
<li>Reiner, T., Keliher, E. J., Earley, S., Marinelli, B., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+in+vivo+imaging+of+a+18F-labeled+PARP1+inhibitor+using+a+chemically+orthogonal+scavenger-assisted+high-performance+method%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Synthesis and in vivo imaging of a 18F-labeled PARP1 inhibitor using a chemically orthogonal scavenger-assisted high-performance method.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50, 1922-1925 (2011).</li>
<li>Taylor, M. T., Blackman, M., Dmitrenko, O., Fox, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+synthesis+of+highly+reactive+dienophiles+for+the+tetrazine-trans-cyclooctene+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Design and synthesis of highly reactive dienophiles for the tetrazine-trans-cyclooctene ligation.</a> Journal of the American Chemical Society. 133, 9646-9649 (2011).</li>
<li>Selvaraj, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrazine-trans-cyclooctene+ligation+for+the+rapid+construction+of+integrin+alpha%28v%29beta%283%29+targeted+PET+tracer+based+on+a+cyclic+RGD+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+and+Medicinal+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">Tetrazine-trans-cyclooctene ligation for the rapid construction of integrin alpha(v)beta(3) targeted PET tracer based on a cyclic RGD peptide.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 21 (3), 5011-5014 (2011).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+18F+labeling+of+cysteine-containing+peptides+and+proteins+using+tetrazine-trans-cyclooctene+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Imaging%22%5BJournal%5D)">Efficient 18F labeling of cysteine-containing peptides and proteins using tetrazine-trans-cyclooctene ligation.</a> Molecular Imaging. 12, 121-128 (2013).</li>
<li>Han, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+bioorthogonal+and+highly+efficient+conjugation+method+for+quantum+dots+using+tetrazine-norbornene+cycloaddition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Development of a bioorthogonal and highly efficient conjugation method for quantum dots using tetrazine-norbornene cycloaddition.</a> Journal of the American Chemical Society. 132, 7838-7839 (2010).</li>
<li>Zeglis, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+strategy+for+the+construction+of+radiometalated+antibodies+for+positron+emission+tomography+based+on+inverse+electron+demand+Diels-Alder+click+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Modular strategy for the construction of radiometalated antibodies for positron emission tomography based on inverse electron demand Diels-Alder click chemistry.</a> Bioconjugate Chemistry. 22, 2048-2059 (2011).</li>
<li>Zeng, D., Zeglis, B. M., Lewis, J. S., Anderson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+growing+impact+of+bioorthogonal+click+chemistry+on+the+development+of+radiopharmaceuticals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">The growing impact of bioorthogonal click chemistry on the development of radiopharmaceuticals.</a> Journal of Nuclear Medicine. 54, 829-832 (2013).</li>
<li>Reiner, T., Zeglis, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inverse+electron+demand+Diels-Alder+reaction+in+radiochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Labeled+Compounds+and+Radiopharmaceuticals%22%5BJournal%5D)">The inverse electron demand Diels-Alder reaction in radiochemistry.</a> Journal of Labeled Compounds and Radiopharmaceuticals. 57, 285-290 (2014).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrazine-trans-cyclooctene+ligation+for+the+rapid+construction+of+18-F+labeled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Tetrazine-trans-cyclooctene ligation for the rapid construction of 18-F labeled probes.</a> Chemical Communications. 46, 8043-8045 (2010).</li>
<li>Karver, M. R., Weissleder, R., Hilderbrand, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+evaluation+of+a+series+of+1%2C2%2C4%2C5-tetrazines+for+bioorthogonal+conjugation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Synthesis and evaluation of a series of 1,2,4,5-tetrazines for bioorthogonal conjugation.</a> Bioconjugate Chemistry. 22, 2263-2270 (2011).</li>
<li>Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioorthogonal+chemistry%3A+fishing+for+selectivity+in+a+sea+of+functionality%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Bioorthogonal chemistry: fishing for selectivity in a sea of functionality.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48, 6973-6998 (2009).</li>
<li>Bosch, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+strained+alkynes+for+Cu-free+click+reaction+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nuclear+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of strained alkynes for Cu-free click reaction in live mice.</a> Nuclear Medicine and Biology. 40, 415-423 (2013).</li>
<li>Rossin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+chemisry+for+pretargeted+tumor+imaging+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">In vivo chemisry for pretargeted tumor imaging in live mice.</a> Angewandte Chemie International Edition. 49, 3375-3378 (2010).</li>
<li>Ackerman, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A33+antigen+displays+persistent+surface+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+and+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">A33 antigen displays persistent surface expression.</a> Cancer Immunology and Immunotherapy. 57, 1017-1027 (2008).</li>
<li>Carrasquillo, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((124I-huA33+antibody+PET+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">124I-huA33 antibody PET of colorectal cancer.</a> Journal of Nuclear Medicine. 52, 1173-1180 (2011).</li>
<li>Sakamoto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+I+radioimmunolocalization+trial+of+humanized+monoclonal+antibody+huA33+in+patients+with+gastric+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">A phase I radioimmunolocalization trial of humanized monoclonal antibody huA33 in patients with gastric carcinoma.</a> Cancer Science. 97, 1248-1254 (2006).</li>
<li>Rossin, R., Lappchen, R., vanden Bosch, S. M., LaForest, R., Robillard, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diels-Alder+reaction+for+tumor+pretargeting%3A+In+vivo+chemistry+can+boost+tumor+radiation+dose+compared+with+directly+labeled+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">Diels-Alder reaction for tumor pretargeting: In vivo chemistry can boost tumor radiation dose compared with directly labeled antibody.</a> Journal of Nuclear Medicine. 54, 1989-1995 (2013).</li>
<li>Rossin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+reactive+trans-cyclooctene+tags+with+improved+stability+for+Diels-Alder+chemistry+in+living+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Highly reactive trans-cyclooctene tags with improved stability for Diels-Alder chemistry in living systems.</a> Bioconjugate Chemistry. 34, 1210-1217 (2014).</li>
<li>Emmetiere, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((18F-labeled-bioorthogonal+liposomes+for+in+vivo+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">18F-labeled-bioorthogonal liposomes for in vivo targeting.</a> Bioconjugate Chemistry. 24, 1784-1789 (2013).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Bu pretargeted PET görüntüleme stratejisinin temel avantajı, doğrudan etiketli antikorlar tarafından üretilen arka plan radyasyon dozunun sadece bir kısmını hedef-arka görüntü kontrast ile tümörlerin ortaya çıkarma yeteneğine sahip olmasıdır. Örneğin, burada açıklanan kolorektal kanser görüntüleme sisteminde, akut biyolojik dağılım deneylerden elde edilen veriler, doğrudan etiketli 64 Cu-NOTA-huA33 ve 89 Zr-DFO-huA33 ile birlikte 64 Cu-tabanlı pretargeting stratejisi için dozimetre hesap...

Son otuz yılda, pozitron emisyon tomografisi (PET) kanser tanı ve tedavisinde vazgeçilmez bir klinik bir araç haline gelmiştir. Antikorlar uzun kanser biyomarkerların onların zarif yakınlık ve özgüllük nedeniyle tümörlere pozitron yayan radyoizotop teslimi için umut verici vektörleri olarak kabul edilmiştir. Antikorların 1,2 Ancak, nispeten yavaş in vivo farmakokinetiği çoklu-gün radyoizotop kullanılmasını zorunlu kılmaktadır fiziksel yarı-ömürleri. Kısmi vücut BT aksine - - Bu kombinasyon hastalarda hedef olmayan organlar, radioimmunoconjugates intravenöz ve bu nedenle enjekte edilir çünkü özel klinik önemi olan önemli bir komplikasyon yüksek radyasyon dozları verebilir sonucu emilen dozlarda vücudun her yerinde, sorguya dokuların bakılmaksızın. Bu sorunu aşmak için, önemli çaba develo ithaf edilmiştirAynı anda kendi içsel farmakokinetik sınırlamaları süpürgelik ederken böylece antikorların avantajlı özelliklerini yararlanarak, radyoizotop ve hedefleme parçasını ayrıştırarak PET görüntüleme stratejilerinin pment. Bu stratejiler, - genellikle pretargeting ya da birkaç aşamalı hedefleme olarak adlandırılan - tipik haliyle dört adımı kullanır: (1) bir antijen ve bir radyo-iki bağlayabilen bir antikorun uygulanması; (2) hedef doku ve kan onun izni antikorun birikimi; (3) bir küçük moleküllü radyoligandın yönetimi; ve (4), fazla radyoligandın hızlı bir temizlenme ile. Bazı durumlarda, 3-8 ve ardından antikorun Radyoligandın in vivo bağlanması, ek bir temizleme maddesi, herhangi bir antikorun atılımını hızlandırmak amacıyla, aşama 2 ve 3 arasında enjekte Bu tümör bağlamak için henüz ve kanda kalır. 5 Genel olarak, tw konuşmapretargeting stratejilerin o tipleri edebiyatının en yaygındır. Her iki klinik öncesi modellerde başarılı olmuş olsa da, onlar da kendi klinik uygulanabilirliği engellemiştir anahtar sınırlamaları sahip. İlk strateji, streptavidin-konjuge antikor ve biyotin ile modifiye edilmiş radyo etiketlerin arasında yüksek afinite ile dayanır; Bununla birlikte, streptavidin ile modifiye edilmiş antikorların bağışıklık çeviri ilişkin endişe verici bir sorun olduğu görülmüştür. 5,6,9,10 İkinci strateji, aksine, bir kanser, her iki bağlanma genetik olarak inşa edilmiş, bispesifik antikorları kullanır Bu ikinci yol kesinlikle yaratıcı iken biyobelirteç antijen ve küçük molekül radyoaktif işaretli hapten. 3,11-14, geniş uygulanabilirliği sistemi modülerlik karmaşıklığı, gider ve eksikliği ile sınırlıdır. Son zamanlarda, biz geliştirdik ve (ters elektron talebi Diels-Alder dayalı I bir pretargeted PET görüntüleme metodolojisini yayınladıEDDA) trans -cyclooctene (TCO) ve tetrazin (Tz arasındaki sikloadisyon reaksiyonu;. Gösterildiği gibi Şekil 1) 11 reaksiyon kendisi yıllardır bilinen olsa da, IEDDA kimya, bir tıklama kimya bioconjugation tekniği olarak son yıllarda bir rönesans yaşadı Ralph Weissleder, Joseph Fox, ve peptidler, antikorlar ve nanopartiküller ile floresan görüntüleme dahil 12-15 IEDDA Siklokatılma ayarları geniş bir yelpazede uygulanmıştır. diğerleri arasında Peter Conti gruplarının büyüleyici çalışmaları yanı sıra nükleer görüntüleme .. 27 bioorthogonal Ve tıklama kimya türde bir dizi ise - eleştirel - radiohalogens ve radiometals hem 16-26 ligasyon, verimli, yüksek, temiz, hızlı (k 1&gt; 30.000 M -1 sn -1), seçici ve bir - Cu-katalize azid-alkin siklokatılma, gerilme-terfi azid-alkin siklokatılma ve Staudinger lig dahilations -. o bütün organizmalar uygulamaları pretargeting çok uygundur IEDDA kimya yapar hızlı reaksiyon kinetiği ve bioorthogonality eşsiz kombinasyonu, hem de bioorthogonal olan bu doğrultuda 28,29, bu son raporuna dikkat etmek önemlidir bizim laboratuarlar pretargeting için IEDDA kimya uygulamak için ilk değildi:. IEDDA ile pretargeted görüntüleme ilk rapor Rossin çalışmaları, vd ortaya çıktı ve bir 111 yılında etiketli tetrazin kullanan bir SPECT metodolojisi özellikli 30. Yukarıda ele alındığı gibi, pretargeting yöntemi dört oldukça basit adımları içerir (Şekil 2) sahiptir. Eldeki protokolde, 64 Cu NOTA etiketli tetrazin radyoligand ve huA33 antikorun bir TCO modifiye edilmiş konjügat kullanmaktadır kolorektal kanser, PET görüntülemesi için bir pretargeted strateji tarif edilecektir. Ancak, bu yöntemin sonuçta modülerliği kendi gr biridirtrans--cyclooctene kısım olarak eatest varlıklar olmayan içe antikora eklenebilir ve tetrazin radyoaktif muhabir çeşitli eklenebilir.

<table><tbody><tr><td>Tetrazin NHS Ester</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>764701</td><td>Mağazası -80 ° C'de; C</td></tr><tr><td>Trans-siklookten NHS Ester</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>764523</td><td>Mağazası -80 &° C'de; C</td></tr><tr><td>p-NH2-Bn-NOTA</td><td>Makrosiklik</td><td>B-601</td><td>-80 &°C'de saklayın; Ç</td></tr></tbody></table>

pretargeted pet görüntüleme bioorthogonal ters elektron talep diels-alder katılma harnessing

Harnessing the Bioorthogonal Inverse Electron Demand Diels-Alder Cycloaddition for Pretargeted PET Imaging

Enfes afiniteleri ve özgüllükleri nedeniyle, antikorlar, PET görüntüleme için kanser hücrelerine radyoizotopların verilmesi için son derece umut verici vektörler haline gelmiştir. Bununla birlikte, antikorların uzun fiziksel yarılanma ömrüne sahip radyonüklidlerle etiketlenmesi gerekliliği, genellikle hedef olmayan dokulara yüksek arka plan radyasyon doz oranları ile sonuçlanır. Bu sorunu aşmak için, ters elektron talebi Diels-Alder siklo ekleme reaksiyonuna dayalı önceden hedeflenmiş bir PET görüntüleme stratejisi kullandık. Metodoloji, antikoru radyoaktiviteden ayırır ve böylece farmakokinetik dezavantajlarından kaçınırken antikorların olumlu özelliklerinden yararlanır. Sistem dört adımdan oluşur: (1) bir mAb-trans-siklookten (TCO) konjugatının enjeksiyonu; (2) antikorun tümörde biriktiği ve kandan temizlendiği bir lokalizasyon süresi; (3) radyoaktif işaretli tetrazinin enjeksiyonu; ve (4) bileşenlerin in vivo tıklama ligasyonu ve ardından fazla radyoligandın temizlenmesi. Eldeki çalışmada sunulan örnekte, yüksek tümör-arka plan kontrastına sahip SW1222 kolorektal kanser tümörlerini tanımlamak için 64Cu-NOTA etiketli tetrazin radyoligand ve transsiklookten konjuge insanlaştırılmış antikor (huA33) başarıyla kullanıldı. Ayrıca, ön hedefleme metodolojisi, doğrudan 64Cu veya 89Zr ile etiketlenmiş radyoimmünokonjugatlar tarafından oluşturulan hedef olmayan dokuya radyasyon dozunun sadece bir kısmında yüksek kaliteli görüntüler üretir. Sonuç olarak, bu protokolün modülerliği, trans-siklookten kısmı herhangi bir içselleştirici olmayan antikora eklenebildiğinden ve tetrazin çok çeşitli radyoizotoplara bağlanabildiğinden, en büyük varlıklarından biridir.

Deneyin ilk üç adım - Tz-Bn-Nota, huA33 için TCO konjugasyonun sentezi ve Tz-Bn-Nota Radyoaktif (Şekil 3 ve 4) inşa - son derece güvenilir. Yukarıda tanımlanan prosedüre durumunda, Tz-Bn-NOTA yapısı yüksek verim ve saflıkta sentezlendi. ~ huA33 antikoru 4.2 ± 0.6 TCO / mAb ile değiştirilmiş olan, ve Tz-Bn-NOTA,&gt;% 85 bozulma düzeltilmiş verim, ve bir spesifik aktivite&gt;% 99, radyokimyasal saflık saflaştırılmış radyoligand vermek üzere 64 Cu ile radyo-etiketli olduğu 6.7 M...

Biyoortogonal ters elektron talebi Diels-Alder sikloilavesi, kanser için etkili ve modüler önceden hedeflenmiş bir PET görüntüleme stratejisi oluşturmak için kullanılmıştır. Bu protokolde, bu metodolojinin adımları, kolorektal kanser hedefli antikor huA33 ve 64Cu etiketli bir radyoligand kullanan bir model sistem bağlamında açıklanmaktadır.

Pretargeted PET Görüntüleme Bioorthogonal Ters Elektron Talep Diels-Alder Katılma Harnessing

Due to their exquisite affinity and specificity, antibodies have become extremely promising vectors for the delivery of radioisotopes to cancer cells for ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, PET görüntüleme için Tetrazine ve trans-cyclo-octine arasındaki biyo-ortogonal bir reaksiyonu kullanarak kanserli dokuyu önceden hedeflemektir. Bu işlem, tümör taşıyan bir fareye trans-cyclo-octine ile işaretlenmiş bir antikor enjekte edilerek ve ardından antikorun tümörde yavaşça birikip kandan temizlendiği bir bekleme süresi bırakılarak gerçekleştirilir. Aynı hayvana bir tetrazine radyoligand enjekte edilir.Radyoligand, tümörde TCO ile etiketlenmiş bir antikorla klikleme reaksiyonuna girer ve küçük bir molekül olduğu için kandan hızla temizlenir. Elde edilen küçük hayvan PET görüntüsü, yüksek kontrast ve yüksek tümör-arka plan aktivite oranları ile tümörün net bir şekilde belirlendiğini gösterir. Bu tekniğin, doğrudan etiketlenmiş antikorlarla yapılan PET görüntüleme gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, hastaya verilen radyasyon dozunun yalnızca bir kısmıyla yüksek kontrastlı görüntüler sağlamasıdır.Bu tekniğin etkileri terapiye kadar uzanmaktadır; çünkü ön hedefleme teknikleri, sağlıklı organlara ve sağlıklı dokulara verilen dozlar çok düşük kalırken, tümörlere çok yüksek miktarlarda radyasyon iletebilmektedir. Bu tekniği, laboratuvarımızdaki teknisyen Catherine Kaza ile birlikte uygulamalı olarak göstereceğim. Sentez reaksiyonu, 7 mg NH₂-BN-Notta'nın, pH 8,1'de 600 µL 0,1 molar sodyum bikarbonat içerisinde çözülmesiyle başlar.pH değerini kontrol edin ve gerekirse pH'ı 8,1'e ayarlamak için 0,1 molar sodyum karbonatın küçük alikotlarını kullanın. Ardından, bu çözeltiyi bir mikro santrifüj tüpündeki 0,5 miligram TZ NHS üzerine ekleyin. Bu reaksiyonun, oda sıcaklığında hafif ajitasyonla yarım saat boyunca inkübe edilmesini sağlayın.TZ NHS stok çözeltisi yarım saat sonra DMF veya DMSO içinde çözülebilir. Reaktif olmayan NH iki BN notta'yı uzaklaştırmak için ürünü ters faz C 18 HPLC ile saflaştırın; bu madde 254 nanometrede saptanacaktır. TZ NHS ve TZ BN Notta'nın takibi için en uygun dalga boyu 525 nanometredir.Numunenin alıkonma süresi kullanılan ekipmana göre değişiklik gösterecektir; ancak 25 dakika boyunca %0'dan %100'e ve tekrar %100'den %0'a asetonitril-su gradyanı ve 4,6 x 250 mm'lik bir C 18 analitik kolon kullanıldığında, üç bileşik için alıkonma süreleri sırasıyla 16,5, 15 ve 10 dakika olacaktır. Toplanan HPLC elüatını sıvı azot ile dondurun ve ardından tüpü opak folyo ile sarın. Daha sonra, dondurulmuş tüpü bir liyofilizasyon kabına yerleştirin ve gece boyunca liyofilizöre bırakın.Tamamlanan TZ bn no top öncüsünün saflığını doğrulamak için HPLC mobil fazını uzaklaştırın; proton NMR, analitik HPLC ve/veya ESI kütle spektrometrisi kullanın. Bu reaksiyona, bir mikro santrifüj tüpünde DMF içinde 2.7 millimolar T-C-O-N-H-S çözeltisi hazırlayarak başlayın ve ikinci bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Bir mililitre PBS pH 7.4 içinde iki milligrams/milliliter HUA 33 çözeltisi hazırlayın.Ardından, 0.1 molar sodyum karbonatın küçük miktarlarda eklenmesiyle, çözeltinin pH değerini 8.8 ile 9.0 arasına ayarlayın, ancak bu değerin üzerine çıkmayın. Sonrasında, aktive edilmiş esterin sekiz molar eşdeğerine karşılık gelen hacimde T-C-O-N-H-S ekleyin. Çözeltiyi birkaç kez tersyüz ederek nazikçe karıştırın ve alüminyum folyoyla sarın.Ardından tübü, hafif ajitasyonla oda sıcaklığında yaklaşık bir saat inkübe olacak şekilde hazırlayın. Bir saat sonra, immünkonjugatı reaksiyondan saflaştırmak için önceden paketlenmiş tek kullanımlık bir boyut dışlama tuz giderme kolonu kullanın. Kolona bir mililitre reaksiyon karışımı ve ardından 1,5 mililitre %0,9 steril salin ekleyin.Ardından, humanize edilmiş HUA 33 TCO ürününü iki mililitre %0,9'luk salin ile elüye edin. Ürünün konsantrasyonunu bir UV-vis spektrometresi ile ölçün. Konsantrasyon istenilenden düşükse, ürünü 50.000 moleküler ağırlıklı bir santrifüj filtresi ile konsantre edin.Bir mikrosantrifüj tüpünde 0,5 mg/mL TZ BN notta çözeltisi hazırlayarak başlayın. İkinci bir mikrosantrifüj tüpüne, hazırlanan TZ BN Notta çözeltisinden 10 µL'yi 400 µL pH 5,5'de 0,2 molar amonyum asetat tamponuna ekleyin. Gelecek olan her adımdan önce ve sonra örneğinizdeki radyoaktivite miktarını ölçtüğünüzden ve kaydettiğinizden emin olun.Bu, radyokimyasal verimlerin doğru hesaplanması ve kayıtların tutulması için gereklidir. Şimdi, TZ BN Notta çözeltisine 2000 micro curies bakır 64 ekleyin. Bu karışımı oda sıcaklığında, hafif ajitasyon ile 10 dakika boyunca inkübe edin.Ürünü saflaştırmak için ters faz C 18 HPLC kullanın; ürünleri, %0,1 TFA ile 15 dakika boyunca %5'ten %95'e ve ardından %95'ten %5'e asetonitril-su gradyenti kullanarak seyreltin. Radyoetiketli tz, BN nota 9,8. dakikada elüe olurken, serbest bakır 64, 2 ila 4 dakika arasında çözücü önüyle birlikte elüe olacaktır. HPLC elüentini uzaklaştırmak için döner evaporatör kullandıktan sonra, radyoetiketli ürünü %0,9 steril salin içinde çözün ve ardından ürünü mümkün olan en kısa sürede kullanın. Bu prosedür, hazırlanan HEA 33 TCO solüsyonunun bir alikotunun %0,9 steril salin içinde 0,5 mg/mL konsantrasyona seyreltilmesiyle başlar.Ardından, çözeltinin 200 µL'sini ksenogreft taşıyan farenin kuyruk venine enjekte edin. İnsanileştirilmiş a 33 TCO'nun 24 saat boyunca dolaşmasına ve tümörde birikmesine izin verin. 24 saat sonra, 0,9% steril salin içerisinde 1,5 mCi/mL konsantrasyonundaki bakır 64 işaretli TZ BN Notta'yı hazırlayın.Ardından, hazırlanan radyoligand çözeltisinin 200 microliters miktarı, istenen zamanda fareye kuyruk veni enjeksiyonu ile uygulanır. Fare anestezi altına alınır ve küçük hayvan PET tarayıcısının tablasına yerleştirilir. Anestezi, bir burun konisi aracılığıyla sürdürülmeli ve anestezinin sağlandığı ayak parmağı sıkma testi ile doğrulanmalıdır.Kurumayı önlemek için ince bir tabaka oftalmik pomad uygulayın. Şimdi, 350 ile 700 kilo elektron volt arasında 60 milyon çakışan olayla ve altı nanosaniyelik bir çakışma zamanlamasıyla statik tarama kullanarak evcil hayvan verilerini edinin; görüntülemeden sonra, fareyi yeniden diğer farelerle birlikte olabileceği kafesine döndürmeden önce bilincini geri kazanmasını bekleyin. 33 antijeni eksprese eden SW 1222 kolorektal kanser taşıyan timik nude fareler.Ksenogreftler, açıklanan protokol kullanılarak incelenmiştir. Hem akut biyodağılım hem de PET görüntüleme deneyleri, ön hedefleme stratejisinin kolorektal kanser ksenogreftini mükemmel görüntü kontrastı ve yüksek tümör-arka plan aktivite oranları ile belirleyebildiğini ortaya koymaktadır. Birkaç saatlik süre boyunca, radyoligand dışkı yoluyla temizlenmekte ve tümör-arka plan aktivite oranları oldukça yükselmektedir.Bu ön hedefleme yaklaşımındaki bazı değişkenlerin, herhangi bir görüntüleme stratejisinde olduğu gibi optimize edilmesi gerekmiştir. 100 µg yerine 300 µg antikor-TCO konjugatının uygulanması ve bekleme süresinin 24 saatten 12 saate düşürülmesi, farenin kalbinde görülen radyoaktivitenin artmasına neden olmuştur. Her iki durumda da, erken zaman noktalarındaki tumoral tutulumla oldukça net bir şekilde gösterildiği üzere, tıklama reaksiyonu tümörde gerçekleşmeye devam etmiştir.Ancak, klik reaksiyonunun istenmeyen bir şekilde kanda da gerçekleştiği açıkça görülmektedir. Bu prosedür uygulanmaya çalışılırken, tüm ön hedefleme değişkenleri arasında hassas bir denge kurulmalıdır. TCO immünokonjugatının kütlesinin yanı sıra enjeksiyonlar arasındaki zaman aralığının optimize edilmesi oldukça önemlidir.Radyoaktivite ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın; deney sırasında uygun KKD kullanımı ve radyasyonun her zaman zırhlandığından emin olunması gibi önlemler alınmalıdır.

harnessing-bioorthogonal-inverse-electron-demand-diels-alder

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu video, tümörleri tedavi etmek için immünokonjugatların ve ardından radyoligandların uygulandığı önceden hedeflenmiş radyoimmünoterapi veya PRIT tekniğini açıklar. Bu radyoimmünoterapi, sağlıklı dokulara radyasyon dozlarını azaltır ve antikor bazlı vektörlerle uyumlu olmayan çok düşük yarı ömre sahip radyonüklidleri kullanır.

Önceden Hedeflenmiş Radyoimmünoterapi: Terapötik Radyonüklidlerin Tümörlere Hedefe Yönelik Verilmesi İçin Bir Yöntem

Biz sıralı on-chip bioorthogonal Siklokatılma kimya ve antikor-antijen yakalama kullanarak, küçük moleküllerin hızlı, geri dönüşümlü immobilizasyon ve Yüzey Plazmon Rezonans (SPR) çalışmaları için işlevselleştirilen nanoparçacık meclisleri için bir yöntem mevcut.

Tersi Küçük Moleküller veya Biosensor Uygulamaları için Çok bileşenli Yapılar hareketsiz için microfluidic On-chip Yakalama sikloeklenme Tepki

Çok günlük radyoaktif yarılanma ömrü ve uygun bozunma özellikleri nedeniyle, pozitron yayan radyometal 89Zr, PET görüntüleme için antikor bazlı radyofarmasötiklerde kullanım için son derece uygundur. Bu protokolde, 89Zr işaretli antikorun biyokonjugasyonu, radyosentezi ve klinik öncesi uygulaması anlatılacaktır.

Bioconjugation ve radiosynthesis<sup&gt; 89</sup&gt;, Zr-DFO-etiketli antikorlar

125-etiketli azid sentezi ve bir bakır içermeyen tıklama reaksiyonu kullanılarak dibenzocyclooctyne (DBCO) -grubu ile konjüge edilmiş 13-mil ölçekli altın nanopartiküllerinin radyo-etiketlenmesi için ayrıntılı bir işlem tarif edilmektedir.

Bir Kullanarak Altın Nanopartiküller Verimli Radyoaktif bir Optimize Protokolü<sup&gt; 125</sup&gt; I-etiketli Azid Protez Grubu

Burada, ön hedefleme ve biyoortogonal kimya için tridentat 99mTc(I) şelat-tetrazin türevlerinin radyoetiketleme ve in vivo testi için bir protokol açıklıyoruz.

Hazırlama ve Değerlendirilmesi<sup&gt; 99m</sup&gt; Bioorthogonal Kimya Kullanarak Öncesi hedeflemek için üç dişli Şelatlar Tc-etiketli

[18F] 3F4AP'in yarı otomatikleştirilmiş radyokimyasal sentezini ve kalite kontrol prosedürlerini gösteririz.

Otomatik Radyokimyasal Sentez [<sup&gt; 18</sup&gt; F] 3F4AP: Demyelinizan Hastalıkların Görüntülenmesine Yönelik Yeni Bir PET İzleyici

Facile Floresans tahlil kanonik olmayan amino-asit (ncAAs) memeli hücrelerinde proteinlerin içine birleşmeyle amino-asil-tRNA-sentetaz/tRNA çiftleri verimliliğini değerlendirmek için sunulmuştur. G-protein birleştiğinde reseptörleri (GPCRs) çalışmaya ncAAs uygulanması siteleri ve bioorthogonal GPCR canlı hücreleri üzerinde etiketleme bağlama fotoğraf-çapraz eşleme dahil olmak üzere açıklanır.

Kimyasal ve genetik eklenmesi en iyi duruma getirme GPCRs fotoğraf-çapraz eşleme ve canlı memeli hücreleri Bioorthogonal kimyada probları

Pozitron emisyon tomografi (PET) görüntüleme siteleri birden çok erken araştırma klinik deneylere katılan sağlam ve çok yönlü radiotracer üretim yeteneklerini gerekir. Radiotracer [18F] kullanarak Clofarabine örnek olarak, esnek, kaset tabanlı radiosynthesizer kullanarak bir radiotracer sentezi otomatikleştirmek ve klinik kullanım için sentez doğrulamak nasıl göstermek.

Klinik üretim için bir pozitron emisyon tomografi (PET) Radiotracer sentez protokolü'nün Otomasyon

Sentez ve karakterizasyonu bir trans- cyclooctene (TCO) bu protokolünü açıklar-modifiye antikor ve 177Lu etiketli tetrazine (Tz) radioligand pretargeted radioimmunotherapy (PRIT) için. Buna ek olarak, bu iki yapıları kullanımı vivo içinde biodistribution ve boyuna terapi çalışmaları kolorektal kanser, bir fare modeli için ayrıntıları.

Pretargeted Radioimmunotherapy ters elektron talep Diels-Alder reaksiyonu üzerinde dayalı

İki foton uyarma floresan mikroskobu (2PEF) ile entegre olan döteryum-oksit (ağır suD2O) problu uyarılmış Raman saçılımı (DO-SRS) mikroskobu kullanılarak amino asitler tarafından düzenlenen hücrelerdeki metabolik aktiviteleri doğrudan görselleştirmek için bir protokol sunuyoruz.

Aromatik Amino Asitler Tarafından Düzenlenen Hücre Metabolizmasının Biyoortogonal Kimyasal Görüntülenmesi

Bu protokol, "döngü yöntemi" [11 C] metilasyonu yoluyla dört karbon-11radyoizleyici hazırlamak için ayrıntılı bir prosedür sunar. [11C]ER-176'yı sentezleme prosedürünü, üç ek radyoizleyici için verilerle açıklıyoruz: [11C]MRB, [11C]mHED ve [11C]PiB. Döngü yöntemi, geleneksel reaksiyon kabı [11C] metilasyonuna karşı artan radyokimyasal verimlerle verimli bir sentez sağlar.

Döngü Yöntemini Kullanarak Klinik Araştırmalar için Karbon-11 Radyoligandlarının Verimliliğini ve Radyoetiketleme Verimlerini Artırma

Keşfedin, kolorektal kanser için biyoortogonal ters elektron talep Diels-Alder siklokatılma kullanarak ön hedeflemeli PET görüntüleme stratejisi geliştirin. Bu yöntem, yüksek kontrastlı tümör görüntüleme ve düşük radyasyon dozu sağlar.

Pretargeted PET Görüntüleme Bioorthogonal Ters Elektron Talep Diels-Alder Katılma Harnessing

Daha fazla video keşfet