Ön Talamusun Çekirdek Derin Beyin Stimülasyon sonra Sıçan Hippocampus Gen İfade Değişim Analizi

Bu prosedürün genel amacı, anterior talamik çekirdeğin derin beyin stimülasyonunu gerçekleştirmek ve sıçan hipokampüsündeki gen ekspresyonu değişikliklerini incelemektir. Bu, önce hayvanın uyuşturulmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra, hayvan ameliyat için hazırlanır.

Kafa derisinde bir kesi yapılır ve kafatası ortaya çıkarılır. Daha sonra bgma'ya göre doğru pozisyonda frez delikleri açılır. DBS elektrotları yerleştirilir ve stimülasyon gerçekleştirilir.

Son olarak, hayvana ötenazi yapılır ve beyin parçalara ayrılır. Hipokampusu çıkarmak için, doku RNA ekstraksiyonu için işlenir ve CDNA hazırlığı ve QPCR gerçekleştirilir. Sonuç olarak, sonuçlar derin beyin stimülasyonunun sıçan hipokampusundaki gen ekspresyonunu etkilediğini göstermektedir.

Bu yöntem, derin beyin stimülasyon cerrahisinde, derin beyin stimülasyon cerrahisinin terapötik etkisinin altında yatan moleküler mekanizmalar nelerdir gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin etkileri sadece epilepsinin değil, aynı zamanda Parkinson hastalığı, Alzheimer hastalığı ve distoni gibi diğer nöronal durumların tedavisine de uzanır. DPS, birçok nöron bozukluğunu tedavi etmek için cerrahi bir yaklaşım olarak ortaya çıktığından, ameliyata hazırlanmak için, tezgahı örtmek için cerrahi pedler kullanın ve biyolojik olarak tehlikeli bir atık bertarafının mevcut olduğundan emin olun.

Sıçanı tartın ve metin protokolüne göre anestezi dozunu hesaplayın, stereotaktik bir cerrahi çerçevenin elektrot tutucusuna iki elektrot takın ve sabitleyin ve bir mikroskopla elektrotun uçlarını uygun hizalama açısından inceleyin. Elektrot ucuna sert yüzeylerde dokunmamaya dikkat ederek elektrotları üç milimetre aralıklarla sabitleyin. Ketamin ksilazin enjekte edin.

İntraperitoneali hayvana karıştırın ve ayak parmağı kıstırma refleksini, solunum hızını ve solunumun derinliğini ve düzenliliğini kontrol ederek hayvanın cerrahi bir anestezi düzlemine ulaştığını onaylayın. Hayvanı stereotaktik çerçeveye sabitleyin ve yerleştirin. Aşırı kurumaya karşı korumak için hayvanın gözlerine göz kayganlaştırıcı uygulayın ve kafa derisini her biri Betadine ve alkol veya steril salin olmak üzere üç alternatif ovma ile dezenfekte edin.

Hayvanı sirkülasyonlu bir ılık su yastığına yerleştirin veya hayvanın vücut ısısını optimum seviyede tutmak için ısıtma lambaları kullanın. Paxos ve Watson sıçan beyin atlasına dayanarak, anterior talamik çekirdeği veya NT anterior posterior negatif 1.6 milimetreyi hedeflemek için aşağıdaki stereotaktik koordinatları kullanın. Medya lateral 1.5 milimetre ve dorso ventral 5.2 milimetre.

Ardından, kafatasını ortaya çıkarmak için kafa derisi sagitalinde bir kesi yapın Bir çift ekartör kullanarak, kafatasını ortaya çıkarmak için kesilen kafa derisini sabitleyin. Daha sonra etanole batırılmış steril çubuklarla, dikişleri net bir şekilde ortaya çıkarmak için kesilen bölgeyi temizleyin. Bgma'yı bulun ve frez deliklerinin konumunu yönlendirmek için pazarlamak için siyah bir işaretleyici kullanın.

Yaklaşık 1,5 milimetrede iki işaret daha yapın. Sagital sütürden her iki tarafta lateral olarak ve koronal sütürün 1.6 milimetre posteriorunda ortam. Şimdi iki frez deliği yapmak için, matkabın ucunu dezenfekte etmek için etanol kullanın.

45 derecelik bir açıyla tutulan bir matkap kullanarak, her iki frez deliğinin merkezinde aşırı ısıyı önlemek için iki delik arasında geçiş yaparak frez deliklerini sık sık delin. Dura açığa çıkana kadar delmeye devam edin. Ucu L şeklinde bükülmüş bir iğne kullanarak, elektrotun yerleştirilmesini engelleyecek kırık kemik parçalarını çıkarın.

Kemik parçalarını çıkarırken alttaki dura ve/veya beyin dokusuna zarar vermemeye dikkat edin. Çift elektrot düzeneğini stereotaktik çerçevenin dönen koluna sabitleyin ve kolu 90 derecelik bir açıyla sabitleyin. Stereotaktik çerçevedeki ayarlamaları kullanarak, sol elektrodu tam olarak bgma'nın üzerine yerleştirin.

Medya için stereotaktik ayarlamaları kullanma. Yanal konumlandırma, sol elektrotu hassas bir şekilde bgma'nın sol tarafına 1,5 milimetre hareket ettirdi, öyle ki şimdi koronal sütür boyunca mükemmel bir şekilde hizalanmış, ancak birbirinden aralıklı iki elektrot var. BGMA'dan yanal olarak 1,5 milimetre ortam.

Daha sonra anterior posterior stereotaktik ayarlamalarla, elektrotları koronal sütürün 1.6 milimetre arkasına hareket ettirin. Daha sonra dorsal ventral ayarlamalarla, önce frez deliklerinin doğru yerde yapılıp yapılmadığını kontrol etmek için elektrotları indirin, böylece elektrotlar frez deliklerinin pürüzlü kenarlarına dokunmadan kolaylıkla yerleştirilebilir. Eğer öyleyse, elektrotları kafatasının yüzeyinden 5,2 milimetre derinliğe yerleştirin.

Elektrotları kablolar aracılığıyla 130 hertz, 2,5 volt ve 90 mikrosaniye darbe genişliğinde ayarlanmış bir stimülatöre bağlayın. İstenilen bir süre boyunca yüksek frekanslı stimülasyon sağlayın. Tek taraflı veya iki taraflı stimülasyon yapmak.

Stimülasyon yapıldıktan sonra elektrotları dikkatlice çıkarın ve üç sıfır dikiş veya steril cerrahi zımba ile insizyonu dikin, buprenorfini deri altına uygulayın ve hayvanı normal aktivitesine dönene kadar izleyin ve ardından barınma tesisine geri koyun. Beyni, bir tıraş bıçağı kullanarak buz üzerinde önceden soğutulmuş akrilik bir beyin matrisine yerleştirin. Beyin kordonunu beynin en ön kenarından yaklaşık yedi ila sekiz milimetre uzakta kesin.

Yaklaşık beş milimetre kalınlığında bir beyin diliminin çıkarılabilmesi için ilk kesimin arkasına doğru ikinci bir kesim yapın. Beyin dilimini bir tıraş bıçağı kullanarak buz gibi PBS'li bir Petri kabına aktarın, iki yarım küre kesiti kesin ve hangi bölümün sırasıyla sol ve sağ taraflara karşılık geldiğine dikkat edin. İnce forseps ve makas kullanarak, hipokampus flaşını dikkatlice çıkarın, dokuyu kuru buz üzerinde dondurun ve burada gösterilen metin protokolüne göre gerçekleştirilen sonraki RNA adımlarına hazır olana kadar eksi 20 santigrat derecede saklayın, belirtilen zaman noktalarında kontrol geni beta aktin ile karşılaştırıldığında BDNF'nin nispi ekspresyon seviyeleridir.

DBS stimülasyonu sonrası. BDNF yukarı regülasyonu, DBS ameliyatından hemen sonra, stimülasyondan üç saat sonra pik ekspresyon ile birlikte gözlenir. Bu gözlem, gelişmiş bir BDNF ekspresyonunun ve bunun sonucunda ortaya çıkan nöroproteksiyonun, epileptik hastalar için DBS'nin terapötik yararına katkıda bulunabileceğini düşündürmektedir.

Bu panel, DBS'den üç saat sonra uyarılmamış kontrollere kıyasla uyarılmış hayvanlarda gelişmiş ekspresyon gösteren GABA reseptörü G-A-B-R-D'nin ekspresyonunu göstermektedir. GABA agonistlerinin etkili nöbet baskılayıcılar olarak kullanıldığı göz önüne alındığında, DBS sonrası artmış G-A-B-R-D ekspresyonunun GABA için olası bir rolü ve DBS'nin anti-epileptik etkisini ima ettiğini gözlemlemek ilginçtir. Bu prosedürü takiben.

Batı bloğu, kromatin immünopresipitasyon ve diğer birçok standart moleküler biyolojik tahlil gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Bu, protein ekspresyonundaki değişiklikler, translasyon sonrası modifikasyonlar, belirli gen promotör bölgelerinde transkripsiyon faktörü doluluğu vb. ile ilgili soruları yanıtlamaya yardımcı olur. Bu videoyu izledikten sonra, sıçanlarda derin beyin stimülasyonu ameliyatının nasıl yapıldığını iyi anlamış olmalısınız.

Hipokampal dokuyu izole edin ve gen ekspresyonu değişiklikleri için analiz edin.