Tek iplikli DNA Fayans Complex iki boyutlu şekiller Self-montaj

Aşağıdaki deneyin genel amacı, tek sarmallı karolarla karmaşık DNA nanoyapıları oluşturmaktır. Bu, ikinci adım olarak istenen DNA nanoyapısını oluşturmak için özenle tasarlanmış sentetik DNA ipliklerinin istenen tampon çözeltisinde karıştırılmasıyla elde edilir. Numune, yapının kendi kendine montajının gerçekleştiği diz çökmüş bir örnektir.

Daha sonra, nanoyapıların başarılı bir şekilde oluşumunu doğrulamak için doğal agros jel elektroforezi ve atomik kuvvet mikroskobu görüntülemesi gerçekleştirilir. Sonuçlar, doğal agros, jel elektroforezi ve atomik kuvvet mikroskobu görüntülemesine dayalı olarak kendi kendine bir araya getirilen DNA nanoyapılarını göstermektedir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler mücadele edecektir, çünkü böyle bir kendi kendine montajın numune hazırlanması karmaşık görünüyordu: Bu prosedüre başlamadan önce, elde edilen belirli dizilerin DNA bileşen iplikleri, RNA'larda çözülmüş, bir oligonükleotid üreticisinden serbest su, Vbo'da 96 kuyulu plakalar, 24 sarmal için 362 kuyucuğun her birinden 28 tur boyunca bir mikrolitre pipetler.

Dikdörtgen: İki mililitrelik bir test tüpüne iplik başına 100 mikromolar ekleyin. Daha sonra bir stok çözeltisi yapmak için test tüpüne 138 mikrolitre damıtılmış deiyonize su ekleyin. İplik başına 200 nano molar konsantrasyonda.

200 ano molar stok çözeltisinden 50 mikrolitre ekleyin. 10 mikrolitre 10 x tavlama tamponu A ve 40 mikrolitre damıtılmış deiyonize su 0.2 mililitrelik bir PCR tüpüne. Bunu takiben, 90 ila 25 santigrat derece arasında soğutulan bir termal döngüleyicide 17 saat boyunca bir numune.

SYBR güvenli ile önceden boyanmış doğal% 2 agros jeli hazırladıktan sonra, buzlu su banyosunda 100 voltta iki saat çalıştırın. Bittiğinde, mavi ışıklı bir Transluminatör üzerinde SYBR güvenli lekesi için uygun bir filtreye sahip bir jel tarayıcı kullanarak jel, keskin ve temiz bir tıraş bıçağı kullanarak bir Kilobaz DNA merdiveninin 1.500 baz çifti bandına benzer hareketliliğe sahip baskın bandı çıkarır. İstenen jel parçalarını bir döndürme sütununa yerleştirin ve ardından jeli bir mikro tüp Pele kullanarak ince parçalara ayırın, ardından dört santigrat derecede üç dakika boyunca 438 G'de santrifüjleyin.

Santrifüjlemeyi takiben. 260 nanometrede bir ultraviyole spektrofotometre kullanarak DNA'nın konsantrasyonunu ölçün. Bu noktada, düz bir yüzey elde etmek için viski bandı kullanarak bir numune metalik diskine bağlı MICA'yı soyun ve bir numune diskini mikroskobun görüntüleme aşamasına yerleştirin.

40 mikrolitre bir x ve diz çökmüş tampon A'yı ve ardından 24 HELOC'un saflaştırılmış numunesinden beş mikrolitreyi 28 tur dikdörtgen şeklinde taze kesilmiş Micah yüzeyine ekleyin. Karışımın yaklaşık iki dakika çökmesine izin verin. Bir konsol tutucuya bir A FM silikon nitrit konsol çipi takın, numuneyi sıvı kılavuz çekme modunda görüntüleyin, çözünürlük için iki mikrometre, 1024 satırlık bir tarama boyutu kullanarak.

Ve dikdörtgenin sekiz iç karosuna ve altı sınır karosuna üç asal 17 nükleotid segmentine bağlı iç etiketleme için 0,5 ila bir hertz tarama hızı. Sınır etiketleme için 200 NANOMOLAR stok çözeltisi yapmak için 28 tutamlı tutamcığı 24 HELOC'un geri kalan bileşen şeritleriyle 28 tur dikdörtgen şeklinde karıştırın. İç etiketleme için 200 Nanomolar stok çözeltisi elde etmek için 14 tutamlı tutamlı tutamlı, 24 topuk denizinin bileşen ipliklerinin geri kalanıyla 28 tur dikdörtgen şeklinde karıştırın.

Sınır etiketlemesi için 50 mikrolitre 200 Nanomolar stok solüsyonu ekleyin. 100 mikromolar biotin modifiye anti sap iplikçiklerinin 60 mikrolitresi. 10 mikrolitre 10 x tavlama tamponu A ve 34 mikrolitre damıtılmış deiyonize su A PCR test tüpüne.

Dahili etiketleme için, 200 nanomolar stok çözeltisinden 50 mikrolitre ekleyin. 100 mikromolar'da dahili anti sap biotin modifiye iplikçikten üç mikrolitre. 10 mikrolitre 10 x tavlama tamponu A ve 37 mikrolitre damıtılmış deiyonize su bir PCR test tüpüne.

Daha sonra, üç mililitre damıtılmış suda 0.06 gram pisuar formatı tartın. % 2 sulu pisuar format leke çözeltisi hazırlamak için, şırıngaya bağlı 0.2 mikrolitrelik bir filtre kullanarak leke çözeltisini süzün. Filtrelenmiş leke çözeltisinin bir mililitresine beş mikrolitre beş normal sodyum hidroksit ekleyin.

Çözelti santrifüjünü 20.000 G kızdırmada kısa bir süre vorteksledikten sonra. Aşağıdaki ayarları kullanarak karbon kaplı ızgaraları, kaplanmış tarafı yukarı bakacak şekilde boşaltın: Bittiğinde, 3.5 mikrolitre pipetleyinampkızdırma deşarjı ile muamele edilmiş ızgaraya süzülür. Dört dakika sonra, filtre kağıdını yandan ızgara ile temas ettirerek numuneyi fitillemek için bir parça filtre kağıdı kullanın.

Bunu takiben, hemen ızgaraya 3,5 mikrolitre leke solüsyonu ekleyin. Bir dakika sonra lekeyi fitilleyin ve filtre kağıdını bir ila iki dakika ızgaraya doğru tutun. Izgarayı bir TEM numune tutucusuna aktarın.

10 K ila 80 K arasında değişen büyütme ile 80 kilovoltta çalıştırılan A-J-E-O-L GM 1400 kullanan bir görüntü.Şekil tanımlandıktan sonra, moleküler tuval üzerindeki şekle karşılık gelen iplikleri seçin. Açıkta kalan alanı 10 ila 11 nükleotid uzunluğunda bir poli T segmenti ile değiştirin veya açıkta kalan alana tamamlayıcı bir kenar koruyucu ekleyin ve 10 ila 11 nükleotid uzunluğunda bir poli T segmenti ile sonlandırın. Topaklanmayı önlemek için, korseyi içeren 310 piksel moleküler kanvas için bir iplik kitaplığı oluşturun.

Bir yıldız ayarlayın, iki yıldız ayarlayın, üç yıldız ayarlayın ve toplam 1.344 kenar koruyucu vermek için dört yıldız ayarlayın. Farklı setler için 96 kuyulu plakayı santrifüjledikten sonra, çekirdek setinden bir mikrolitre 206 iplikçik, setten sıfır, setten bir yıldız sıfır, setten iki yıldız sıfır, üç yıldız ve dört yıldızdan 24 iplikçik pipetleyin iki mililitrelik bir santrifüj tüpüne. DNA ipliklerinin 400 nanomolar stok çözeltisini yapmak için tüpe 20 mikrolitre damıtılmış deiyonize su ekleyin.

Ardından, 400 nanomolar stok çözeltisinden 50 mikrolitre ekleyin. 10 mikrolitre 10 x tavlama tamponu B ve 40 mikrolitre damıtılmış deiyonize su, 0.2 mililitrelik bir PCR tüpüne ve karışımı daha önce açıklandığı gibi 17 saat boyunca termal döngüleyicide bekletin. Numuneyi saflaştırdıktan ve DNA konsantrasyon görüntüsünü ölçtükten sonra, numune, daha önce olduğu gibi bir FM kullanarak, dördü nihayet paralel heoc sayısını ve sarmal dönüşlerin sayısını değiştirerek farklı boyutlarda dikdörtgenler oluşturur.

Tek telli karoların kendi kendine montajı, 28 tura 24 HELOC dikdörtgen verecektir, farklı tek sarmallı karolar için DNA dizileri, strep bölünmesini ve etiketlenmesini sağlamak için değiştirilebilir ve optimize edilebilir, bir dikdörtgenin bir tüpe dönüşümünü sağlar. Farklı boyutlarda tüpler ve dikdörtgenler oluşturmak için tek telli karoların programlanabilir kendi kendine montajı ve moleküler tuval Etki Alanı ikame tasarımı ve kenar koruyucu tasarımı kullanılarak iki boyutlu keyfi şekillerin oluşturulması, keyfi şekillerin açıkta kalan alanları boyunca toplamaya yönelik çözümler olarak test edildi. Her iki tasarım da karşılaştırılabilir jel verimine ve yapısal bütünlüğe sahiptir, ancak kenar koruyucu tasarımı, daha az yardımcı tür gerektirdiğinden daha uygun maliyetlidir.

Bu videoyu izledikten sonra, tek iplikli karolara dayalı karmaşık DNA nanoyapılarının nasıl yapıldığını iyi anlamış olmalısınız.