Tek iplikli DNA Fayans Complex iki boyutlu şekiller Self-montaj

Aşağıdaki deneyin genel amacı, tek zincirli karolarla karmaşık DNA nanoyapıları oluşturmaktır. Bu, ikinci bir adım olarak istenen DNA nanoyapısını oluşturmak için dikkatle tasarlanmış sentetik DNA zincirlerinin uygun tampon çözeltide karıştırılmasıyla gerçekleştirilir. Örnek, yapısal kendi kendine montajın gerçekleştiği bir tavlama işlemine tabi tutulur.

Ardından, nanoyapıların başarıyla oluştuğunu doğrulamak amacıyla doğal agaroz jel elektroforezi ve atomik kuvvet mikroskobu görüntüleme işlemleri gerçekleştirilir. Sonuçlar, doğal agaroz, jel elektroforezi ve atomik kuvvet mikroskobu görüntülemesine dayanarak DNA nanoyapılarının kendi kendine toplandığını göstermektedir. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, bu tür bir kendi kendine toplanmanın numune hazırlama aşaması karmaşık göründüğü için zorlanacaktır. Bu prosedüre başlamadan önce, bir oligonükleotid üreticisinden temin edilen ve belirli dizilere sahip DNA bileşen zincirleri, RNase içermeyen su içinde çözülerek Vbo 96 kuyucuklu plakalara alınır; 24 helis ve 28 dönüş için 362 kuyucuğun her birinden bir µL pipetle alınır.

Her bir zincir için 100 µM Rectangle miktarını iki mililitrelik bir test tüpüne ekleyin. Ardından, stok çözelti hazırlamak için test tüpüne 138 µL distile deiyonize su ekleyin. Böylece her bir zincir için 200 nM konsantrasyona ulaşın.

0,2 mL'lik bir PCR tüpüne 50 µL 200 nM stok çözelti, 10 µL 10x tavlama tamponu A ve 40 µL distile deiyonize su ekleyin. Ardından, numuneyi bir termal döngüleyici cihazda 90 °C'den 25 °C'ye soğutarak 17 saat boyunca tavlayın.

SYBR safe ile ön boyaması yapılmış natif %2 agroz jel hazırlandıktan sonra, jel buzlu su banyosunda 100 volt gerilimde iki saat boyunca çalıştırılır. İşlem tamamlandığında, mavi ışıklı bir Transluminatör üzerinde, SYBR safe boyası için uygun bir filtreye sahip jel tarayıcı kullanılarak jelin görüntüsü alınır; 1 kb DNA merdivenindeki 1.500 baz çiftlik bantla benzer mobiliteye sahip baskın bant, keskin ve temiz bir jilet kullanılarak kesilip çıkarılır. İstenilen jel parçaları bir spin kolona yerleştirilir ve ardından bir mikrotüp pestili kullanılarak ince parçalara ayrılana kadar ezilir; sonrasında 4 °C'de 438 G hızında üç dakika boyunca santrifüj edilir.

Santrifüj işleminin ardından, DNA konsantrasyonunu 260 nanometrede bir ultraviyole spektrofotometre kullanarak ölçün. Bu aşamada, düz bir yüzey elde etmek için numune metalik diskine yapışmış olan MICA'yı scotch bant kullanarak soyun ve numune diskini mikroskobun görüntüleme tablasına yerleştirin.

Taze olarak temizlenmiş mika yüzeyine 40 µL 1x nötralizasyon tamponu A ve ardından 24 HELOC'un 28 dönüşlü dikdörtgenle saflaştırılmış örneğinden 5 µL ekleyin. Karışımın yaklaşık iki dakika boyunca çökelmesini bekleyin. Bir AFM silikon nitrür konsol çipini konsol tutucuya yerleştirin; örneği, 2 µm tarama boyutu ve çözünürlük için 1024 hat kullanarak sıvı vuruşlu (fluid tapping) modunda görüntüleyin.

Dahili etiketleme için 0,5 ile 1 Hz arasında bir tarama hızı kullanılarak, dikdörtgenin sekiz dahili karosuna ve altı sınır karosuna bağlı 3' ucunda 17 nükleotidlik segmentlere bağlanır. Sınır etiketlemesi için 200 nM'lik bir stok çözelti hazırlamak amacıyla, tutacaklı 28 zincir, 24 HELOC'un 28 dönüşlü dikdörtgeninin geri kalan bileşen zincirleri ile karıştırılır. Dahili etiketleme için 200 nM'lik bir stok çözelti elde etmek amacıyla, tutacaklı 14 zincir, 24 HELOC'un 28 dönüşlü dikdörtgeninin geri kalan bileşen zincirleri ile karıştırılır.

Sınır etiketlemesi için, 200 Nanomolar stok çözeltiden 50 µL, 100 µM biotin modifiyeli anti tutucu zincirlerden 60 µL, 10 x tavlama tamponu A'dan 10 µL ve 34 µL distile deiyonize suyu bir PCR test tüpüne ekleyin.

İç etiketleme için, bir PCR test tüpüne 200 nanomolar stok çözeltiden 50 microliters, 100 micromolar konsantrasyonda 3 microliters biotin modifiyeli internal anti handle zinciri, 10 microliters 10 x tavlama tamponu A ve 37 microliters distile deiyonize su ekleyin.

Ardından, üç mililitre distile su içerisinde 0,06 gram ürinal format tartın. %2'lik sulu ürinal format boyama çözeltisi hazırlamak için, boyama çözeltisini şırıngaya takılı 0,2 mikrolitre filtre kullanarak süzün. Süzülmüş boyama çözeltisinin bir mililitresine beş mikrolitre beş normal sodyum hidroksit ekleyin.

Çözeltiyi kısa bir süre vortekslendikten sonra 20,000 G hızda santrifüjleyin. Karbon kaplı gridleri, kaplı yüzey yukarı bakacak şekilde aşağıdaki ayarları kullanarak glow discharge işlemine tabi tutun. İşlem tamamlandığında, glow discharge uygulanmış gridin üzerine pipetle 3,5 µL örnek ekleyin. Dört dakika sonra, filtre kağıdının bir ucunu gridin yan tarafına temas ettirerek örneği emdirin.

Bunun hemen ardından, ızgaranın üzerine 3,5 µL boyama çözeltisi ekleyin. Bir dakika sonra boyayı emdirerek uzaklaştırın ve filtre kağıdını bir ila iki dakika boyunca ızgaraya karşı tutun. Izgarayı bir TEM numune tutucuya aktarın.

10 K ile 80 K arasında büyütme oranlarında ve 80 kilovolt'ta çalıştırılan A-J-E-O-L GM 1400 kullanılarak elde edilmiş bir görüntü. Şekil tanımlandıktan sonra, moleküler kanvas üzerinde bu şekle karşılık gelen sarmalları seçin. Açıkta kalan alanı 10 ila 11 nükleotid uzunluğunda bir poly T segmenti ile değiştirin veya açıkta kalan alanla tamamlayıcı olan bir kenar koruyucu ekleyip bunu 10 ila 11 nükleotid uzunluğunda bir poly T segmenti ile sonlandırın. Agregasyonu önlemek için, korseyi de içeren 310 piksellik moleküler kanvas için bir sarmal kütüphanesi oluşturun.

Toplam 1.344 kenar koruyucu elde etmek için bir yıldızlı set, iki yıldızlı set, üç yıldızlı set ve dört yıldızlı seti hazırlayın. Farklı setler için 96 kuyucuklu plakaları santrifüjledikten sonra; çekirdek setten 206 zincir, bir yıldızlı setten sıfır, iki yıldızlı setten sıfır, üç yıldızlı setten sıfır ve dört yıldızlı setten 24 zincirden bir mikrolitre alarak iki mililitrelik bir santrifüj tüpüne pipetleyin. DNA zincirlerinden 400 nanomolar stok çözelti hazırlamak için tüpe 20 mikrolitre distile deiyonize su ekleyin.

Ardından, 0,2 mililitrelik bir PCR tüpüne 400 nanomolar stok çözeltiden 50 mikrolitre, 10 x tavlama tamponu B'den 10 mikrolitre ve 40 mikrolitre distile deiyonize su ekleyin ve karışımı daha önce açıklandığı gibi termal döngüleyici cihazda 17 saat boyunca inkübe edin. Örneği saflaştırıp DNA konsantrasyonunu ölçtükten sonra, örneği daha önce olduğu gibi bir FM kullanarak görüntüleyin ve son olarak paralel helis sayısını ve helis dönüş sayısını değiştirerek farklı boyutlarda dikdörtgenler oluşturun.

Tek zincirli karoların kendi kendine birleşmesi, 24 HELOCs'den 28 dönüşe kadar bir dikdörtgen oluşturacaktır; farklı tek zincirli karolar için DNA dizileri, strep bölünmesini ve etiketlemeyi sağlamak amacıyla modifiye edilebilir ve optimize edilebilir, böylece bir dikdörtgenin bir tüpe dönüşümü gerçekleşir. Değişen boyutlarda tüpler ve dikdörtgenler oluşturmak için tek zincirli karoların programlanabilir kendi kendine birleşimi ile moleküler kanvas Alan değişimi tasarımı ve kenar koruyucu tasarımı kullanılarak iki boyutlu rastgele şekillerin inşası, rastgele şekillerin açık alanları boyunca meydana gelen agregasyona karşı çözümler olarak test edilmiştir. Her iki tasarım da benzer jel verimine ve yapısal bütünlüğe sahiptir, ancak kenar koruyucu tasarımı daha az yardımcı tür gerektirdiği için daha maliyet etkindir.

Bu videoyu izledikten sonra, tek sarmallı karolara dayalı kompleks DNA nanoyapılarının nasıl oluşturulacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.