İnşaat Hücre bazlı Nörotransmiterler Optik Algılama için nörotransmitter Floresan Engineered Gazeteciler (CNiFERs) İn Vivo

Bu videonun genel amacı, in vivo olarak spesifik nörotransmiterlerin salınımını optik olarak izlemek için kullanılabilen Hücre Bazlı Nörotransmitter Floresan Raportörlerin veya CNiFER'lerin yapımı ve test edilmesi için metodolojiyi tanımlamaktır. Bu yöntem, beyindeki nöromodülatörlerin zamanlaması ve salınımı ile ilgili sinirbilimdeki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, GPCS aracılığıyla sinyal veren herhangi bir nörotransmitter veya nöromodülatör türü için uyarlanabilmesidir.

Bu yöntemin bölgesel olarak gösterilmesi yararlıdır. Bu in vivo enjeksiyondur ve CNiFER'lerin sonraki görüntülemesi teknik olarak zordur. Bu prosedüre başlamak için, bir T-25 şişesinde ön tabanlı kalsiyum dedektörü ve kimerik g proteini içeren HEK293 hücrelerine bakın.

Daha sonra, hücreleri nemlendirilmiş bir inkübatörde, 37 santigrat derecede, yüzde beş CO2 ile, yaklaşık% 50 birleşene kadar büyütün. Daha sonra, medyayı T-25 şişesinden aspire edin. İki mililitre lenta virüsü medya karışımı ekleyin ve T-25 şişesini 37 santigrat derecede% 5 CO2 ile inkübe edin.

Ertesi gün, bir mililitre tripsin ekleyerek enfekte HEK293 hücrelerini hasat edin. Daha sonra, hücre peletini beş mililitre HEK293 büyüme ortamında yeniden süspanse edin. Dondurma ve saklama için bir T-75 şişesinde bir mililitre hücre ve FACS analizi için bir T-25 şişesinde 1,5 mililitre hücre tohumlayın.

10 noktalı agonist eğrisi için, enfekte olmuş hücreleri test etmek için, fibronektin kaplı 96 oyuklu bir plakanın ilk iki sırasını, oyuk başına 100 mikrolitre hücre süspansiyonu ile tohumlayın. Daha sonra, bir T-25 şişesi, bir T-75 şişesi ve 96 oyuklu bir plaka içinde büyüyen HEK293 hücrelerini, bir ila iki gün boyunca% 5 CO2 ile% 37 santigrat derecede yaklaşık% 90 birleşene kadar inkübe edin. FACS analizinden önce, tahmin edilen EC 50'yi parantez içine alan 10 farklı agonist konsantrasyonuna sahip bir ilaç plakası hazırlayarak GPCR'nin fonksiyonel ifadesini belirleyin.

Seri seyreltme yöntemi kullanarak farklı agonist konsantrasyonları hazırlayın ve ilaç konsantrasyonlarını takip etmek için bir şablon oluşturun. Ardından, plaka okuyucu sıcaklığını 37 santigrat dereceye ayarlayın. Ardından, fret ölçümü ve çözelti transferlerini gerçekleştirmek için 96 kuyulu florometrik plaka okuyucuyu programlayın.

Genetik olarak kodlanmış perde tabanlı bir Kalsiyum sensörü olan TNXXL ile perdeyi ölçmek için, uyarma dalga boyunu 436 artı veya eksi 4,5 nanometre olarak ayarlayın. Ardından, ECFP ve sitrin için emisyon filtrelerini ve kesme filtrelerini ayarlayın. Ardından, plaka okuyucuyu emisyonları her dört saniyede bir, toplam 180 saniye boyunca ölçecek şekilde programlayın.

100 mikro lider plaka hacmi, 150 mikrolitre pipet yüksekliği ve üç katlı bileşik plakadan 50 mikro litre ilaç iletimi seçeneklerini seçin. İlaç dağıtımı için zaman noktasını 30 saniye olarak ayarlayın. Bundan sonra, ortamı A ve B sıralarından aspire edin ve 96 kuyulu sniffer plakasına 100 mikrolitre ACSF ekleyin, bu yaklaşık% 90 birleşimlidir.

Ardından, üç katlı ilaç plakasını ve 96 kuyulu sniffer plakasını plaka okuyucuya yükleyin. Programa başlamadan önce plakaları 37 santigrat derecede dengelemek için 30 dakika bekleyin. Plaka okuyucu çalıştıktan sonra, floresan okuyucu değerlerini bir metin dosyasına aktarın.

Ardından, bu dosyayı, floresan yoğunluklarını uyaran öncesi temel çizgilere normalleştiren, her agonist konsantrasyonu için tepe perde oranını hesaplayan ve bir doz yanıt eğrisi oluşturan önceden yapılmış bir elektronik tablo şablonuna aktarın. Dikey bir elektrot çekicisine bir cam kılcal damar koyarak CNiFER enjeksiyon pipetini hazırlayın. Elektrotun ucunu yaklaşık 40 mikrometre çapa kırmak için bir çift forseps kullanın.

Hücreleri enjeksiyona hazırlarken nemli tutmak için, anestezi uygulanmış bir farenin önceden oluşturulmuş iki x üç milimetre inceliğinde kafatası penceresine ACSF ıslatılmış bir sünger yerleştirin. Ardından, bir T-75 şişesinde yaklaşık %80 oranında büyütülen CNiFER klonunu hasat edin. Ortamı aspire edin ve hücreleri steril PBS ile yıkayın.

PBS'yi çıkarın ve hücreleri şişenin altından çıkarmak için 10 mililitre ACFS kullanın. Ardından, hücre kümelerini ayırmak için hücreleri tritcherate edin. Bir hücre kültürü santrifüjünde iki dakika santrifüjleyin.

Süpernatanı çıkarın ve peleti 100 mikrolitre ACSF'de yeniden süspanse edin. Daha sonra, 1400 kez G'de 30 saniye santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın, ACSF ile kaplı bir pelet bırakın. Daha sonra, enjeksiyon pipetini tekrar mineral yağ ile doldurun.

Pipeti bir nano enjektöre yükleyin. Fare hazırlığının yanındaki bir plastik parafin film şeridine beş mikrolitre CNiFER hücre süspansiyonu koyun. CNiFER hücrelerini çekilen pipete çekin.

Şimdi pipeti hedef x ve y koordinatlarına getirin. Pipetleri indirin ve daha önce hazırlanmış olan inceltilmiş kafatasını delin. Kafatasının yüzeyinin yaklaşık 200 ila 400 mikrometre altına, korteksin ikinci ve üçüncü katmanlarında devam edin.

Nano enjektör ile en derin bölgeye 4.6 nanolitre CNiFER hücresi enjekte edin. Yağ ve hücre arayüzündeki harekete dikkat edin. Ardından, hücrelerin dağılması için beş dakika bekleyin.

Pipeti yaklaşık 100 mikrometre geri çekin ve 4.6 nanolitre CNiFER hücresi daha enjekte edin ve tekrar beş dakika bekleyin. Daha sonra, CNiFER'lerin geri akışını önlemek için pipeti yavaşça ve nazikçe geri çekin. Bu prosedürde, görüntüleme platformunu, iki fotonlu bir görüntüleme mikroskobunda 10x suya daldırma objektifi altında başı kapalı fare ile yerleştirin.

505 nanometrede dikroik bir aynaya ve ECFP'yi ölçmek için 460 nanometre ila 500 nanometre ve sitrin ölçümü için 520 nanometre ila 560 nanometre arasında değişen bant geçiren filtrelere sahip perde görüntüleme için filtre küpünü yerleştirin. Ardından, inceltilmiş kafatası penceresini içeren kuyuya ACSF'yi ekleyin ve 10x suya daldırma hedefini ACSF'ye indirin. CNiFER'leri bulmak için göz merceğini cıva lambası ve GFP filtre küpü ile birlikte kullanın.

Şimdi, 40x suya daldırma hedefine geçin. Ardından, iki foton görüntüleme için uygun ışık yolunu seçin. Yakın kızılötesi femtosaniye darbeli lazeri açın.

820 nanometre dalga boyunu ve %5 ila %15 arasında bir güç ayarını seçin Pmt bir ve pmt iki voltajını, pmt'ye bağlı olarak tipik olarak 500-1000 volt olan bir submaksimal değere ayarlayın. Ardından, kazancı her kanal için bir olarak ayarlayın ve hedef için z konumunu sıfırlayın. Hedefi kortikal yüzeyden yaklaşık 100 ila 200 mikrometre uzağa indirin ve xy taramasını başlatın.

CNiFER'in floresansının sinyal-gürültü oranını optimize etmek için her kanal için lazer gücünü, kazancını ve pmt voltajını ayarlayın. Ardından, görüntülemeyi CNiFER hücrelerini içeren bir bölgenin yanı sıra bir arka plan bölgesiyle sınırlamak için yazılımı kullanın. Uygun bir sinyal-gürültü oranı için ortalaması iki olan kovboy çizgisini seçin ve piksel başına dört mikrosaniyede 3 ila bir hertz arasında bir tarama hızı kullanın.

Bundan sonra, CNiFER hücrelerinin etrafına bir ROI çizin. Uçak başına yaklaşık üç ila dört hücreyi çevreleyen. ROI ortalama yoğunluklarının gerçek zamanlı analizini ayarlayın.

Ardından, zaman içinde CNiFER floresansını izlemek için edinime başlayın ve perdeyi izlerken elektriksel stimülasyona veya davranışsal deneye başlayın. Bu örnekte, D2R CNiFER perdesinin tepkisi, bir çözelti dağıtım sistemine sahip bir plaka okuyucuda ölçülmüştür. Bu grafik, dopaminin D2 CNiFER'lere uygulanması sırasındaki perde tepkisini göstermektedir.

Dopamin ile sitrin emisyonu artarken ECFP emisyonunun azaldığını unutmayın. Ve burada karşılık gelen perde oranının bir grafiği var. Burada D2 CNiFER'lerin dopamine ve norepineferine tepkisi için doz yanıt eğrileri gösterilmiştir.

Ek olarak, D2R'den yoksun duyarlı kontrol CNiFER'leri sunulmaktadır. Bu çubuk grafik, 50 nano molar ve bir mikro molar'da diğer nörotransmiterler ve modülatörler için fret oranı yanıtını gösterir. Burada, substantia nigra'daki DA nöronlarının elektriksel stimülasyonu, D2 CNiFER'ler için fret oranında büyük bir değişiklik ortaya çıkarır.

Artan elektriksel stimülasyon yoğunluğu ile yanıtın genliğinin nasıl arttığına dikkat edin. Kokain enjeksiyonu ile stimülasyonun birleştirilmesi CNiFER yanıtını artırır. Bu videoyu izledikten sonra, in vivo görüntüleme için CNiFER'lerin nasıl oluşturulacağını, test edileceğini ve kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.

CNiFER'lerin gelişimi boyunca, steril tekniğin sürdürülmesi esastır, çünkü bu hücreler nihayetinde canlı farelere implante edilecektir. CNiFER'lerin gerçekleştirilmesi, sinirbilim alanındaki araştırmalar için, bir G proteinine bağlı reseptör aracılığıyla sinyal veren herhangi bir nörotransmiterin veya nöromodülatörün salınımını optik olarak ölçmek için önemli bir araç sağlar. İzlediğiniz için teşekkür ederiz ve deneylerinizde iyi şanslar.