Name: İnşaat Hücre bazlı Nörotransmiterler Optik Algılama için nörotransmitter Floresan Engineered Gazeteciler (CNiFERs) İn Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Keşfedin, HEK293 hücreleri kullanarak CNiFER yapılandırma yöntemini ve in vivo nörotransmitter salınımını optik olarak izleme tekniğini. Bu yöntem, sinirbilim araştırmalarında nöromodülatör dinamiklerini gerçek zamanlı olarak incelemek için güçlü bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz elektronik ile ilgili yardım için G qi5 ve G qs5 cDNA&#39;ları, A. Schweitzer sağlamak için B. Conklin (University of California, San Francisco) teşekkür ederim, N. Taylor geçirmez okuma klonlar, Ian Glaaser ve Robert Rifkin tarama ile yardım için ve TN-XXL Olivier Griesbeck. (; DA037170 DA029706), Biyomedikal Görüntüleme ve Biyomühendislik Ulusal Enstitüsü (NIBIB) (EB003832), Hoffman-La Roche (88610A) ve &quot;Neuroscience Bu çalışma Uyuşturucu ABD Ulusal Enstitüsü (NIDA) aracılığıyla araştırma hibeleri tarafından desteklenen NIDA (DA007315) üzerinden Kötüye &quot;eğitim hibe Uyuşturucu ile İlgili.

<ol><li>Day, J. C., Kornecook, T. J., Quirion, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+in+vivo.+microdialysis+to+the+study+of+cholinergic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Application of in vivo. microdialysis to the study of cholinergic systems.</a> Methods. 23, 21-39 (2001).</li>
<li>Robinson, D. L., Venton, B. J., Heien, M. L., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+subsecond+dopamine+release+with+fast-scan+cyclic+voltammetry+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Detecting subsecond dopamine release with fast-scan cyclic voltammetry in vivo.</a> Clin Chem. 49, 1763-1773 (2003).</li>
<li>Liang, R., Broussard, G. J., Tian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Chemical+Neurotransmission+with+Genetically+Encoded+Fluorescent+Sensors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Imaging Chemical Neurotransmission with Genetically Encoded Fluorescent Sensors.</a> ACS Chem Neurosci. , (2015).</li>
<li>Okubo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+extrasynaptic+glutamate+dynamics+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Imaging extrasynaptic glutamate dynamics in the brain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 6526-6531 (2010).</li>
<li>Marvin, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+fluorescent+probe+for+visualizing+glutamate+neurotransmission%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission.</a> Nat Methods. 10, 162-170 (2013).</li>
<li>Nguyen, Q. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vivo+biosensor+for+neurotransmitter+release+and+in+situ+receptor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An in vivo biosensor for neurotransmitter release and in situ receptor activity.</a> Nat Neurosci. 13, 127-132 (2010).</li>
<li>Muller, A., Joseph, V., Slesinger, P. A., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-based+reporters+reveal+in+vivo+dynamics+of+dopamine+and+norepinephrine+release+in+murine+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell-based reporters reveal in vivo dynamics of dopamine and norepinephrine release in murine cortex.</a> Nat Methods. 11, 1245-1252 (2014).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%3A+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> J Vis Exp. , e3998(2012).</li>
<li>Wang, X., McManus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Lentivirus production.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Conklin, B. R., Farfel, Z., Lustig, K. D., Julius, D., Bourne, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substitution+of+three+amino+acids+switches+receptor+specificity+of+Gq%CE%B1+to+that+of+Gj%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Substitution of three amino acids switches receptor specificity of Gqα to that of Gjα.</a> Nature. 363, 274-276 (1993).</li>
<li>Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+gene+delivery+in+the+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic gene delivery in the rodent brain.</a> Nat Protoc. 1, 3166-3173 (2006).</li>
<li>Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polished+and+reinforced+thinned-skull+window+for+long-term+imaging+of+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Drew, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+optical+access+through+a+polished+and+reinforced+thinned+skull%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull.</a> Nat Methods. 7, 981-984 (2010).</li>
<li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+microscopy+as+a+tool+to+study+blood+flow+and+neurovascular+coupling+in+the+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 32, 1277-1309 (2012).</li>
<li>Yamauchi, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+ligand-gated+ion+channel+receptors+with+genetically+encoded+Ca2%2B+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterizing ligand-gated ion channel receptors with genetically encoded Ca2+ sensors.</a> PLoS One. 6, e16519(2011).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> J. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).</li>
<li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+tissue+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nat Methods. 2, 932-940 (2005).</li>
<li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li>
<li>Cui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+activation+of+striatal+direct+and+indirect+pathways+during+action+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Concurrent activation of striatal direct and indirect pathways during action initiation.</a> Nature. 494, 238-242 (2013).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

CNiFERs yaratılması optik in vivo beyinde nörotransmitterlerin salınımını ölçmek için yenilikçi ve benzersiz bir strateji sağlar. CNiFERs ideal nörotransmitterlerin için yani extrasynaptic açıklaması, hacim iletimi, ölçmek için uygundur. Önemli olarak, her bir CNiFER beyinde nörotransmitter seviyelerindeki değişikliklerin fizyolojik optik ölçüm sağlayan doğal GPCR özelliklerine sahiptir. Bugüne kadar, CNiFERs asetilkolin tespit etmek için oluşturulmuştur (M + -1-CNiFER) 6, dopamin (D2 CNiFER...

Tam nöronlar beyinde nasıl iletişim anlamak için, in vivo nörotransmitterlerin salınımını ölçmek için bir yöntem olması gereklidir. In vivo olarak nörotransmitter ölçmek için çeşitli iyi bilinen teknikler vardır. Genel olarak kullanılan bir teknik, bir kanül, beyin içine yerleştirilir ve beyin omurilik sıvısı, küçük bir hacme ve yüksek performanslı sıvı kromatografisi ve elektrokimyasal algılama 1 kullanılarak analiz edildiği mikrodiyaliz vardır. Mikrodiyaliz sondası birkaç çapları düzeyinde bir uzaysal çözünürlüğü, örneğin ~ 200 mikron çapında mikroprob 0.5 mm. Bu tekniğin zamansal çözünürlüğü, Bununla birlikte, tipik olarak ~ 5 dakika 1 ya da daha uzun süre örnekleme aralıkları yavaştır. Ayrıca, analizler gerçek zamanlı olarak yapılmaz. Başka bir teknik beyin içine yerleştirilen bir karbon-fiber prob kullanır hızlı tarama döngüsel voltametri (FSCV) &#39;dir. FSCV mükemmel temp vardırOral çözünürlük (subsecond), yüksek hassasiyet (nanomolar), ve 30 mikron 5 prob çapları uzamsal çözünürlük. Bununla birlikte, FSCV bir karbon potansiyometrik prob 2 gerilimi ile tipik bir oksidasyon ve redüksiyon profili üretmek vericiler ile sınırlıdır. Nörotransmitterlerin ölçmek için üçüncü bir teknik genetik olarak kodlanmış nörotransmitter (NT) biyosensörler 3 ile doğrudan. Bu yöntemde, bir füzyon proteini, bir flüoresan rezonans enerji transferi (FRET) fluorophores 4 merkezli bir çift ya da sırası değiştirilerek GFP 5 bağlanmış bir verici için bir ligand bağlayıcı etki alanı içeren oluşturulur. Önceki iki yöntemlerden farklı olarak, bu biyosensörler genetik olarak kodlanmış ve transgenik hayvanların üretimi yoluyla veya akut hücreleri enfekte viral ajanların kullanımı ile, örneğin, bir nöron olarak, bir konak hücrenin yüzeyi üzerinde ifade edilmiştir. Bugüne kadar, genetik olarak kodlanmış biyosensörler yalnızca algılama gibi geliştirilmiştirg glutamat GABA 3-5. Bu teknikler ile sınırlamalar nM aralığında düşük hassasiyet, ve G-protein bağlı reseptör (GPCR) aracılığıyla sinyal örneğin vericiler, klasik nörotransmitterler, nöropeptitler ve nöromodülatör, çok sayıda algılama genişletmek yetersizlik olmuştur. Aslında, insan genomunda yaklaşık 800 GPCR&#39;ler vardır. Bu eksiklikleri gidermek için, biz bir GPCR aracılığıyla sinyal herhangi nörotransmiter optik ölçüsü serbest bırakmak için yenilikçi bir araç geliştirdik. CNiFERs (hücre bazlı nörotransmiter flüoresan tasarlanmış muhabir), uyarıldığında, [Ca2 +] bir genetik olarak kodlanmış FRET göre Ca2 + sensörü tarafından tespit edilir hücre içi bir artış tetikleyen belirli bir GPCR ifade etmek üzere geliştirilen klonal HEK 293 hücreleri TN-XXL. Bu nedenle, CNiFERs nörotransmiter reseptörü floresansında bir değişiklik olarak bağlanan bir doğrudan ve gerçek zamanlı bir optik r temin dönüşümüYerel nörotransmitter faaliyet ead-out. Belirli bir nörotransmitter doğal reseptörü kullanılarak, CNiFERs kimyasal özgüllük, afinite ve endogen şekilde eksprese reseptörlerin zamansal dinamikleri saklayın. Bugüne kadar, CNiFERs üç tip dopamin tespit etmek için M1 reseptörü, tek kullanılarak asetilkolin saptanması için bir oluşturduk D2 reseptörü kullanılarak ve α1a reseptör 6,7 ile norepinefrin saptanması için bir. CNiFER teknolojisi GPCR her tür o mükellef hale kolayca genişletilebilir ve ölçeklenebilir. Bu vallahi yazıda tarif ve herhangi bir uygulama için in vivo CNiFERs olarak, tasarım gerçekleştirmek için metodoloji ve testi göstermektedir.

<table><tbody><tr><td>pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro&nbsp;</td><td>Sistem Biosciences</td><td>CD510B-1</td><td>Klonlama: lentivirüs üretmek için</td></tr><tr><td>12 x 75 * BD Falcon Yüksek Berraklık Polipropilen Yuvarlak Tabanlı Test Tüpü</td><td>BD Biosciences</td><td>352063</td><td>FACS</td></tr><tr><td>BD 40 um Falcon hücre süzgeçleri</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td>FACS</td></tr><tr><td>%0.05 Tripsin EDTA ve nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25200056</td><td>FACS</td></tr><tr><td>96 Kuyu Plakası, düz tabanlı, şeffaf&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>3596</td><td>FACS</td></tr><tr><td>96 kuyulu hücre kültürü plakaları&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>CLS3997</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Optilux siyah şeffaf alt&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>3603</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Flexstation pipet uçları</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>9000-0911</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Asetilkolin Klorür&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2661</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Norepinefrin ve nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7256</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Dopamin Hidroklorür ve nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1090</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>GABA&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2129</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Histamin ve nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7125</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Glutamat&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49621</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Epinefrin ve nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4642</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Somatostatin&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1763</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>5HT&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9523</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>VIP&nbsp;</td><td>Alfa Teşhis A.Ş. &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>SP-69627</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Orexin A</td><td>Alpha Teşhis A.Ş.&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>12-p-01</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Madde P&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6883</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Adenozin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4036</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Melatonin&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5250C</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Floresan Plaka Okuyucu ve yazılım</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>Flexstation 3</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>&nbsp; Glutamax ile DMEM (yüksek glikoz)&nbsp; &nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>10569-010</td><td>Doku kültürü</td></tr><tr><td>&nbsp; Fetal sığır serumu</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>10082-139</td><td>Doku kültürü</td></tr><tr><td>&nbsp; Kalem/Strep&nbsp; antibiyotikler</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15140-122</td><td>Doku kültürü</td></tr><tr><td>&nbsp; Puromisin&nbsp; &nbsp;</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pr-1</td><td>Doku kültürü</td></tr><tr><td>&nbsp; Fibronektin&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0895</td><td>Doku kültürü</td></tr><tr><td>CoolCell LX Alkolsüz kontrollü oranlı hücre dondurma kutusu</td><td>Bioexpress</td><td>D-3508)</td> <td>Doku kültürü</td></tr><tr><td>siyanoakrilat yapıştırıcı ve nbsp;</td><td>Loctite</td><td>Loctite no. 495</td><td>cerrahi ve stereotaksik enjeksiyon</td></tr><tr><td>plastik parafin filmi&nbsp;</td><td>VWR</td><td>Parafilm&reg;</td><td>Cerrahi ve stereotaksik enjeksiyon</td></tr><tr><td>Nanoenjektör</td><td>Drummond</td><td>3-000-204</td><td>cerrahi ve stereotaksik enjeksiyon</td></tr><tr><td>Cam elektrotlar</td><td>Drummond</td><td>3-000-203G</td><td>cerrahi ve stereotaksik enjeksiyon</td></tr><tr><td>el tipi matkap</td><td>OSADA</td><td>Exl-M40</td><td>cerrahi ve stereotaksik enjeksiyon</td></tr><tr><td>Matkap için çapaklar</td><td>Fine Scientific</td><td>19007-05; 19007-07)</td> <td>cerrahi ve stereotaksik enjeksiyon</td></tr><tr><td>Sterilizasyon banyosu</td><td>FST</td><td>18000-45, Sıcak Boncuk Sterilizatör</td><td>ameliyatı ve stereotaksik enjeksiyon</td></tr><tr><td>izofluran odası/maskesi</td><td>Yayla Tıbbi Ekipmanları</td><td>564-0427, HME 109 İzofluran Buharlaştırıcılı Masa Üstü Anestezik Makinesi, O2 Debimetre, Gang Valf; 564-0852, İndüksiyon Odası 16X7X7.5cm</td><td>cerrahi ve stereotaksik enjeksiyon</td></tr><tr>Kol <td>Zeiss</td><td></td><td>cerrahisi ve stereotaksik enjeksiyon</td> <td>ile 3D kapsam</td></tr><tr><td>fiber optik ışık</td><td></td><td></td><td>cerrahisi ve stereotaksik enjeksiyon</td></tr><tr><td>Betadine&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Cerrahi ve stereotaksik enjeksiyon</td></tr><tr><td>%70 (h/h) İzopropil alkol</td><td></td><td></td><td>cerrahisi ve stereotaksik enjeksiyon</td></tr><tr><td>Povidon-İyot Hazırlık Pedleri</td><td>Dynarex</td><td>1108</td><td>Cerrahi ve stereotaksik enjeksiyon</td></tr><tr><td>NaCl% 0.9 (enjeksiyon, USP, 918610)</td><td></td><td></td> <td>cerrahi ve stereotaksik enjeksiyon</td></tr><tr><td>SİKLOSPORİN (ENJEKSİYON, USP)</td><td></td><td></td> <td>cerrahisi ve stereotaksik enjeksiyon,</td></tr><tr><td>Bupreneks (enjeksiyon), buprenorfin (0.03 & mu; g başına g kemirgen)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>cerrahisi ve stereotaksik enjeksiyon</td></tr><tr><td>Oftalmik merhem&nbsp;</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-235-35</td><td>cerrahi ve stereotaksik enjeksiyon</td></tr><tr><td>Surgifoam</td><td>Etikonya</td><td></td><td>cerrahisi ve stereotaksik enjeksiyon</td></tr><tr><td>Kavrama diş çimentosu</td><td>Dentsply</td> <td># 675571, 675572</td><td>cerrahisi ve stereotaksik enjeksiyon</td></tr><tr><td>Anında SuperGlue&nbsp;</td><td>ND endüstrileri</td><td></td><td>cerrahisi ve stereotaksik enjeksiyon</td></tr><tr><td>LOCTITE 4041</td><td></td><td></td><td>cerrahisi ve stereotaksik enjeksiyon</td></tr><tr><td>METABOND</td><td>C& B</td><td></td><td>cerrahisi ve stereotaksik enjeksiyon</td></tr><tr><td>no. 0 kapak camı</td><td>Fisher</td><td></td><td>cerrahisi ve stereotaksik enjeksiyon</td></tr><tr><td>stereotaksik çerçeve&nbsp;</td><td>Kopf</td><td></td><td>cerrahisi ve stereotaksik enjeksiyon</td></tr><tr><td>Rektal prob ve ısıtma yastığı</td><td>FHC</td><td>40-90-8D, DC Sıcaklık Kontrol Cihazı, 40-90-2-06, 6.5X9.5cm Isıtma Pedi40-90-5D-02, Rektal Termistör</td><td>Probu cerrahisi ve stereotaksik enjeksiyon</td></tr><tr><td>görüntüleme için optik breadboard</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>cerrahisi ve stereotaksik enjeksiyon</td></tr><tr><td>Mineral yağ</td><td>Fisher</td><td>S55667</td><td>ameliyatı ve stereotaksik enjeksiyon</td></tr><tr><td>Kwik-Cast (Silikon elastomer)</td><td>World Hassas Aletler</td><td></td><td>cerrahi ve stereotaksik enjeksiyon</td></tr><tr><td>Sütür&nbsp; &nbsp;</td><td>Ethicon</td><td>18' ', 1667, 4-0</td><td>cerrahi ve stereotaksik enjeksiyon</td></tr><tr><td>Makas</td><td>İnce Bilimsel Aletler</td><td>91500-09, 15018-10</td><td>cerrahi ve stereotaksik enjeksiyon</td></tr><tr><td>Forcepts</td><td>İnce Bilimsel Araçlar</td><td>11252-30; #55, 11295-51; Grafe, 11050-10</td><td>Cerrahi ve Stereotaksik Enjeksiyon</td></tr><tr><td>Öğrenci Halsted-Sivrisinek Kanama Durdurucular</td><td>İnce Bilimsel Araçlar</td><td>91308-12</td><td>Cerrahi ve Stereotaksik Enjeksiyon</td></tr><tr><td>Küçük Damar Koterizatör Kiti</td><td>İnce Bilimsel Araçlar</td><td>18000-00</td><td>Cerrahi ve Stereotaksik</td></tr><tr><td>Enjeksiyon Sıcak Boncuk Sterilizatörleri</td><td>İnce Bilimsel Araçlar</td><td>18000-45</td><td>cerrahi ve stereotaksik enjeksiyon</td></tr><tr><td>Silikon Mat</td><td>İnce Bilimsel Aletler</td> ile Alet Çantası <td>20311-21</td><td>cerrahi ve stereotaksik enjeksiyon</td></tr><tr><td>Silikon Mat ile Plastik Sterilizasyon Kapları</td><td>İnce Bilimsel Aletler</td><td>20810-01</td><td>cerrahi ve stereotaksik enjeksiyon</td></tr><tr><td>in vivo görüntüleme için 2P sabit aşamalı floresan kapsamı</td><td>Olympus</td><td>FV1200 MPE</td><td>in vivo görüntüleme</td></tr><tr><td>Multifoton lazer</td><td>SpectraPhysics</td><td>Mai Tai DeepSee</td><td>in vivo görüntüleme</td></tr><tr><td>Yeşil Lazer</td><td>Olympus</td><td>473 nm Lazer</td><td>in vivo görüntüleme</td></tr><tr><td>xy translasyon tabanı</td><td>Scientifica</td><td>MMBP</td><td>in vivo görüntüleme</td></tr><tr><td>YFP ve CFP için FRET filtre küpü</td><td>Olympus</td><td></td><td>in vivo görüntüleme</td></tr><tr><td>10x ve 40x suya daldırma hedefleri</td><td>Olympus</td><td></td><td>in vivo görüntüleme</td></tr><tr><td>hava tablası</td><td>Newport</td><td></td><td>in vivo görüntüleme,</td></tr><tr><td>özel yapım ışık geçirmez kafes,</td><td>Thorlab</td><td></td><td>, in vivo görüntüleme</td></tr></tbody></table>

İnşaat hücre bazlı nörotransmiterler optik algılama için nörotransmitter floresan engineered gazeteciler (cnifers)<em&gt; İn vivo</em

Construction of Cell-based Neurotransmitter Fluorescent Engineered Reporters (CNiFERs) for Optical Detection of Neurotransmitters In Vivo

Hücre bazlı nörotransmiter floresan mühendislik gazetecilere (CNiFERs) Nörobilimadamları optik in vivo beyinde nörotransmitterlerin salınımını tespit etmek için yeni bir araç sağlar. Belirli CNiFER sabit şekilde belirli bir G protein-eşli reseptörü, G q Çift / 11 G proteinleri ve bir oyma göre Ca2 + -detector, TN-XXL eksprese eden bir insan embriyonik böbrek hücre oluşturulur. reseptörünün aktivasyonu FRET sinyali bir artışa yol açar. Bir CNiFER klonu dopamin için D2R, örneğin, belirli bir nörotransmitter için yerel reseptörünü kullanır, çünkü CNiFERs nM duyarlılık ve saniye zamansal tepki var. CNiFERs doğrudan beyne implante in vivo hacim iletimi ölçmek için idealdir, daha az yüz mikron mekansal çözünürlükte nörotransmitter salınımını anlamda sağlayarak vardır. CNiFERs da vi olası çapraz reaktivite için diğer ilaçları taramak için kullanılabilirvo. Biz son zamanlarda GPCRs G i / o G proteinleri bu çift eklemek için CNiFERs ailesi genişledi. CNiFERs asetilkolin (ACh), dopamin (DA) ve norepinefrin (NE) tespit edilmesi için kullanılabilir. Herhangi bir GPCR CNiFER bir roman oluşturmak için kullanılabilir göz önüne alındığında yaklaşık insan genomunda 800 GPCR&#39;ler olduğunu tasarlar, gerçekleştirmek ve CNiFER her türlü test etmek için buraya genel prosedürü açıklar.

Belirli bir G-proteinine bağlanmış reseptör (GPCR) ile genetik olarak kodlanmış [Ca2 +] sensör, TN-XXL A CNiFER kararlı bir şekilde en az iki protein eksprese etmek üzere bir insan embriyonik böbrek (HEK293), hücre elde edilir. TN-XXL Ca2 + iyonlarının 6,15 yanıt olarak kırmızı ve sarı floresan proteinleri sırasıyla eCFP ve sitrin, arasındaki flüoresan rezonans enerji transferi (FRET) maruz kalır. Endojen G S, G proteinlerine bu birkaç GPCR akt...

Biz hacimsel nörotransmitter salınımı optik tespiti için hücre tabanlı nörotransmiter floresan mühendislik gazetecilere (CNiFERs) oluşturmak için bir protokol mevcut.

İnşaat Hücre bazlı Nörotransmiterler Optik Algılama için nörotransmitter Floresan Engineered Gazeteciler (CNiFERs)<em&gt; İn Vivo</em

Cell-based neurotransmitter fluorescent engineered reporters (CNiFERs) provide a new tool for neuroscientists to optically detect the release of ...

Bu videonun genel amacı, in vivo ortamda spesifik nörotransmitterlerin salınımını optik olarak izlemek için kullanılabilecek Hücre tabanlı Nörotransmitter Floresan Raporörlerin (Cell-based Neurotransmitter Fluorescent Reporters veya CNiFERs) oluşturulması ve test edilmesine yönelik metodolojiyi açıklamaktır. Bu yöntem, beyindeki nöromodülatörlerin salınımı ve zamanlamasıyla ilgili nörobilimdeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, GPCS üzerinden sinyal ileten her türlü nörotransmitter veya nöromodülatöre uyarlanabilmesidir.Bu yöntemin bölgesel gösterimi faydalıdır. CNiFER'ların in vivo enjeksiyonu ve ardından gelen görüntülemesi teknik açıdan zorludur. Bu prosedüre başlamak için, T-25 flask içerisindeki ön tabanlı kalsiyum dedektörü ve kimerik g proteinini içeren HEK293 hücrelerine bakınız.Ardından, hücreleri nemlendirilmiş bir inkübatörde, 37 °C'de ve %5 CO2 ortamında yaklaşık %50 konfluens düzeyine ulaşana kadar büyütün. Sonrasında, T-25 flask içerisindeki medyumu aspire edin. İki mililitre lentivirüs medyum karışımı ekleyin ve T-25 flask'ı 37 °C'de, %5 CO2 ile inkübe edin.Ertesi gün, bir mililitre tripsin ekleyerek enfekte HEK293 hücrelerini hasat edin. Ardından, hücre peletini beş mililitre HEK293 büyüme besiyerinde yeniden süspande edin. Dondurma ve saklama için bir mililitre hücreyi T-75 flask'a, FACS analizi için ise 1,5 mililitre hücreyi T-25 flask'a ekleyin.10 noktalı agonist eğrisi için, enfekte hücreleri test etmek üzere, fibronektin kaplı 96 kuyucuklu bir plakadaki ilk iki sıraya kuyucuk başına 100 µL hücre süspansiyonu ekleyin. Ardından, T-25 flaskta, T-75 flaskta ve 96 kuyucuklu plakta büyüyen HEK293 hücrelerini 37 °C'de %5 CO2 ile yaklaşık %90 konfluense ulaşana kadar bir ila iki gün inkübe edin. FACS analizi öncesinde, tahmin edilen EC 50 değerini kapsayan 10 farklı agonist konsantrasyonu ile bir ilaç plağı hazırlayarak GPCR'nin fonksiyonel ekspresyonunu belirleyin.Seri dilüsyon yöntemi kullanarak farklı agonist konsantrasyonları hazırlayın ve ilaç konsantrasyonlarını takip etmek için bir şablon oluşturun. Ardından, plaka okuyucu sıcaklığını 37 °C olarak ayarlayın. Daha sonra, 96 kuyucuklu florometrik plaka okuyucuyu FRET ölçümü yapmak ve solüsyon transferlerini gerçekleştirmek için programlayın.Genetik olarak kodlanmış bir FRET tabanlı kalsiyum sensörü olan TNXXL ile FRET ölçümü yapmak için, eksitasyon dalga boyunu 436 ± 4,5 nm olarak ayarlayın. Ardından, ECFP ve sitrin için emisyon filtrelerini ve kesme filtrelerini ayarlayın. Sonrasında, plaka okuyucuyu, toplam 180 saniye boyunca her dört saniyede bir emisyonları ölçecek şekilde programlayın.100 µL plaka hacmi, 150 µL pipet yüksekliği ve üçlü bileşik plakasından 50 µL ilaç iletimi seçeneklerini belirleyin. İlaç iletimi için zaman noktasını 30 saniye olarak ayarlayın. Ardından, A ve B sıralarındaki medyumu aspire edin ve yaklaşık %90 konfluens düzeyindeki 96 kuyucuklu sniffer plakasına 100 µL ACSF ekleyin.Ardından, üç katlı ilaç plakasını ve 96 kuyucuklu sniffer plakasını plaka okuyucuya yerleştirin. Programı başlatmadan önce, plakaların 37 °C'de dengelenmesi için 30 dakika bekleyin. Plaka okuyucu çalışması tamamlandıktan sonra, floresan okuyucu değerlerini bir metin dosyasına aktarın.Ardından, bu dosyayı floresan yoğunluklarını stimülasyon öncesi baz çizgilere göre normalize eden, her agonist konsantrasyonu için pik FRET oranını hesaplayan ve bir doz-yanıt eğrisi oluşturan, önceden hazırlanmış bir hesap tablosu şablonuna aktarın. Cam bir kapileri dikey bir elektrot çekiciye yerleştirerek CNiFER enjeksiyon pipetini hazırlayın. Elektrot ucunu yaklaşık 40 µm çapında kırarak şekillendirmek için bir forseps kullanın.Hücreleri enjeksiyona hazırlarken nemli tutmak için, anestezi altındaki bir farede daha önceden oluşturulmuş iki çarpı üç milimetrelik ince kafatası penceresinin üzerine ACSF emdirilmiş bir sünger yerleştirin. Ardından, T-75 flask içinde yaklaşık %80 konfluensle büyütülmüş CNiFER klonunu hasat edin. Besiyerini aspire edin ve hücreleri steril PBS ile yıkayın.PBS'yi uzaklaştırın ve hücreleri flask tabanından ayırmak için 10 mililitre ACFS kullanın. Ardından, hücre kümelerini ayrıştırmak için hücreleri trite edin. Bir hücre kültürü santrifüjünde iki dakika boyunca santrifüjleyin.Süpernatantı uzaklaştırın ve peleti 100 µL ACSF içerisinde yeniden süspande edin. Ardından, 1400 ×g'de 30 saniye boyunca santrifüjleyin ve süpernatantı uzaklaştırarak ACSF ile kaplı bir pelet bırakın. Sonrasında, enjeksiyon pipetini mineral yağ ile geri doldurun.Pipeti bir nano enjektöre yerleştirin. Fare preparasyonunun yanındaki bir plastik parafin film şeridinin üzerine beş µL CNiFER hücre süspansiyonu koyun. CNiFER hücrelerini çekilmiş pipete çekin.Şimdi, pipeti hedef x ve y koordinatlarına taşıyın. Pipetleri indirin ve önceden hazırlanmış olan inceltilmiş kafatasını delin. Kafatasının yüzeyinin yaklaşık 200 ila 400 mikrometre altına, korteksin ikinci ve üçüncü katmanlarına kadar ilerleyin.Nano enjektörle, en derin bölgeye 4,6 nanolitre CNiFER hücresi enjekte edin. Yağ ve hücre ara yüzeyindeki hareketi gözlemleyin. Ardından, hücrelerin dağılması için beş dakika bekleyin.Pipeti yaklaşık 100 mikrometre geri çekin ve 4,6 nanolitre daha CNiFER hücresi enjekte edin ve tekrar beş dakika bekleyin. Ardından, CNiFER'lerin geri akışını önlemek için pipeti yavaşça ve nazikçe geri çekin. Bu prosedürde, başı sabitlenmiş fare ile birlikte görüntüleme platformunu, iki fotonlu görüntüleme mikroskobundaki 10x su daldırma objektifinin altına yerleştirin.505 nanometrede dikroik aynaya, ECFP ölçümü için 460 nanometre ile 500 nanometre arasında ve citrine ölçümü için 520 nanometre ile 560 nanometre arasında bant geçiren filtrelere sahip olan fret görüntüleme filtre küpünü yerleştirin. Ardından, inceltilmiş kafatası penceresinin bulunduğu kuyucuğa ACSF ekleyin ve 10x su daldırma objektifini ACSF içine indirin. CNiFER'ları tespit etmek için okülerini cıva lambası ve GFP filtre küpü ile birlikte kullanın.Şimdi, 40x su daldırma objektifine geçin. Ardından, iki foton görüntüleme için uygun ışık yolunu seçin. Yakın kızılötesi femtosaniye darbe lazerini açın.820 nanometre dalga boyunu ve %5 ile %15 arasında bir güç ayarını seçin. PMT 1 ve PMT 2 voltajını, kullanılan PMT'ye bağlı olarak genellikle 500-1000 volt olan submaksimal bir değere ayarlayın. Ardından, her kanal için kazancı (gain) bir olarak ayarlayın ve objektif için z konumunu sıfırlayın. Objektifi kortikal yüzeyden yaklaşık 100 ila 200 mikrometre aşağı indirin ve xy taramasını başlatın.CNiFER floresansının sinyal-gürültü oranını optimize etmek için her kanal için lazer gücünü, kazancı ve pmt voltajını ayarlayın. Ardından, görüntülemeyi CNiFER hücrelerini ve bir arka plan bölgesini içeren bir alanla sınırlandırmak için yazılımı kullanın. Uygun bir sinyal-gürültü oranı için, ikiyle ortalama alan cowman hattını seçin ve piksel başına dört mikrosaniyede, 3'ten 1 hertz'e kadar bir tarama hızı kullanın.Ardından, CNiFER hücrelerinin etrafına bir ROI çizin. Her düzlemde yaklaşık üç ila dört hücreyi kapsayacak şekilde belirleyin. ROI ortalama yoğunluklarının gerçek zamanlı analizini kurun.Ardından, CNiFER floresanını zaman içinde izlemek için veri toplamayı başlatın ve fret değerini izlerken elektriksel stimülasyona veya davranışsal deneye başlayın. Bu örnekte, D2R CNiFER fret yanıtı, bir solüsyon iletim sistemine sahip plaka okuyucu ile ölçülmüştür. Bu grafik, D2 CNiFER'lere dopamin uygulanması sırasındaki fret yanıtını göstermektedir.Dopamin ile ECFP emisyonunun azaldığı, sitrin emisyonunun ise arttığına dikkat edin. Burada, buna karşılık gelen FRET oranının bir grafiği yer almaktadır. Burada, D2 CNiFER'ların dopamine ve norepinefrine verdiği tepkinin doz-yanıt eğrileri gösterilmiştir.Ek olarak, D2R eksik olan yanıt veren kontrol CNiFER'lar sunulmuştur. Bu sütun grafiği, diğer nörotransmitterler ve modülatörler için 50 nano molar ve bir micro molar seviyelerindeki fret oranı yanıtını göstermektedir. Burada, substantia nigra'daki DA nöronlarının elektriksel stimülasyonu, D2 CNiFER'lar için fret oranında büyük bir değişikliğe yol açmaktadır.Elektriksel stimülasyon yoğunluğu arttıkça yanıtın genliğinin nasıl arttığına dikkat edin. Stimülasyonun kokain enjeksiyonu ile birleştirilmesi CNiFER yanıtını artırır. Bu videoyu izledikten sonra, in vivo görüntüleme için CNiFER'ların nasıl oluşturulacağı, test edileceği ve kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.CNiFER'ların geliştirilme süreci boyunca, bu hücrelerin nihayetinde canlı farelere implante edileceği göz önünde bulundurularak steril tekniğin sürdürülmesi esastır. CNiFER'ların gerçekleştirilmesi, nörobilim alanındaki araştırmacılara, G proteinle kenetli bir reseptör aracılığıyla sinyal veren herhangi bir nörotransmitterin veya nöromodülatörün salınımını optik olarak ölçmek için önemli bir araç sunmaktadır. İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.

construction-cell-based-neurotransmitter-fluorescent-engineered

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Giderek artan bir ilgi ile kök hücre tedavileri, moleküler görüntüleme teknikleri transplantasyonu sonrası izleme kök hücre davranışı için idealdir. Lusiferaz muhabiri genler hücre sağkalım, konumu ve in vivo çoğalması non-invaziv, tekrarlayan değerlendirme sağladı. Bu video izlemek için yaşayan bir fare hESC çoğalması gösterecektir.

In vitro ve in vivo Biyoparlaklık Reporter Gen Görüntüleme İnsan Embriyonik Kök Hücreleri

Biz daha iyi bir yaklaşım knock-in ve spektral kullanarak reseptör floresan protein etiketleme dahil yaklaşımların bir arada kullanılarak nikotin bağımlılığı mekanizmalarını anlamak için MSS nöron spesifik alt tiplerinin Subselüler bölgeler içinde nikotinik asetilkolin reseptör değişiklikleri nicel yeni bir teknik geliştirdik konfokal görüntüleme.

Kronik Nikotin İdaresi fareler Knock-in içinde floresan etiketli Nikotinik Reseptör Spektral Konfokal Görüntüleme

Kaynak: Lacin, E., et al. Nörotransmiterlerin In Vivo'da Optik Tespiti için Hücre Tabanlı Nörotransmitter Floresan Mühendislik Raportörlerinin (CNiFER'ler) Yapımı. J. Vis. Uzm. (2016)Bu video, fare korteksine önceden enjekte edilmiş özel raportör hücreleri olan hücre bazlı nörotransmitter floresan mühendislik raportörleri (CNiFER'ler) kullanarak in vivo nörotransmitter salınımını görüntülemek için bir tekniği göstermektedir. İki fotonlu bir mikroskop altına yerleştirilen fare, floresan emisyonu...

Hücre Bazlı Nörotransmitter Floresan Mühendislik Raportörleri Kullanılarak Nörotransmitter Salınımının Görüntülenmesi

Onun küçük şeffaf gövde, iyi belgelenmiş nöroanatomi ve müsait genetik teknikler ve reaktiflerin bir dizi...

C. vivo Nöronal Kalsiyum Imaging&#39;de elegans

Burada bir biyolüminesens muhabir kullanarak yaklaşım -imaging bir roman Ca 2 + sunuyoruz. Bu yaklaşım, Ca2 + bağlanan ve hafif uyarılması için ihtiyacı ortadan kaldırarak, ışık yayan bir kaynaşık konstrukt GFP Aequorini kullanır. Anlamlı bu yöntem derin beyin yapıları ve yüksek temporal çözünürlük uzun sürekli görüntüleme, erişime izin verir.

Bioluminescent Kalsiyum Göstergesi GFP-aequorin dayanarak Vivo Fonksiyonel Beyin Görüntüleme Yaklaşım

Bu yeni geliştirilmiş floresans tabanlı teknoloji uzun vadeli, suprachiasmatic çekirdeği (SCN) sirkadiyen saat genlerde transkripsiyonu gerçek zamanlı olarak ve yüksek zamansal çözünürlükte fareler serbestçe hareket izleme sağlar.

Vivo Sirkadiyen saat gen ekspresyonu floresans gazetecilere kullanarak fare Suprachiasmatic çekirdeği olarak izlenmesi

Burada bir protokol için tek tek hücre tiplerinin fare nöromusküler kavşakta nüfus sinyal görüntü kalsiyum mevcut.

Ex Vivo Hücre özgü kalsiyum fare diyafram Üçlü sinaps sinyal görüntüleme

Floresan kalsiyum görüntülemeile in situ hibridizasyonunu birleştiren ve deneycinin kalsiyum aktivitesi modellerini tek hücreli düzeyde gen ekspresyonu profilleriyle ilişkilendirmesine olanak tanıyan iki parçalı bir protokol salıyoruz.

Xenopus laevis'te Nöronal Öncül Karakterizasyonu için Floresan Kalsiyum Görüntüleme ve Daha Sonra Yerinde Hibridizasyon

Sinaptik iletim için gerekli olan hücre altı olayları görselleştirmek için iki ilgili yöntem tanımlanmıştır. Bu protokoller, in vitro kültürlü nöronların canlı hücre görüntülemesini kullanarak presinaptik kalsiyum akışı ve sinaptik vezikül membran füzyonunun dinamiklerinin gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar.

Amiyotrofik Lateral Skleroz Modellerinde Sinaptik Fonksiyonların Gerçek Zamanlı Floresan Ölçümü

Transgenik floresan fareler kullanılarak, canlı hayvanlarda bozulmamış siyatik sinirin motor ve duyusal aksonları içinde sinyal veren endozomların ve mitokondrilerin in vivo aksonal taşınımını değerlendirmek için ayrıntılı protokoller tanımlanmıştır.

Aksonal Taşımacılığın In Vivo Görüntülemesi için Araç Kitinin Genişletilmesi

Mevcut yöntemler, kolayca bulunabilen genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergelerini kullanarak Caenorhabditis elegans'ta in vivo olarak yüksek çözünürlüklü, sub-kompartmanlı kalsiyum görüntüleme için orantılı olmayan bir yaklaşımı tanımlamaktadır.

Nöronal Kalsiyum Kullanımının In Vivo Subsellüler Görüntülemesi

Keşfedin, HEK293 hücreleri kullanarak CNiFER yapılandırma yöntemini ve in vivo nörotransmitter salınımını optik olarak izleme tekniğini. Bu yöntem, sinirbilim araştırmalarında nöromodülatör dinamiklerini gerçek zamanlı olarak incelemek için güçlü bir araç sunar.

İnşaat Hücre bazlı Nörotransmiterler Optik Algılama için nörotransmitter Floresan Engineered Gazeteciler (CNiFERs)

Daha fazla video keşfet