Şeffaf olmayan iskelelerinin üzerinde Görüntüleme Hücre Canlılık - Roman Örme Titanyum İmplant Örnek Kullanımı

Bu deneyin genel amacı, floresan görüntüleme tekniklerini kullanarak şeffaf olmayan örme titanyum çekirdekli bir implantın mikro yapısını ve üzerindeki hücre yapışmasını görselleştirmektir. Bu yöntem, şeffaf olmayan iskelelerle doku mühendisliğinin analizini ilerletir. Bu tekniğin bir avantajı, tanımlanmış kültür ped-havası ile iskele üzerindeki hücre canlılığının yanı sıra proliferasyonun da izlenebilmesidir.

Floresan boyama ve daha sonra görselleştirme zor olduğu için bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir. Gözenek boyutu gibi bireysel iskele özellikleri zamanlamayı etkileyebilir ve/veya iskelenin floresansı, kullandığınız florofor seçimini etkileyebilir. 50 mililitrelik bir tüpe altı veya yedi milimetre kalınlığında beş iskele yerleştirin ve bunları yıkama başına 20 dakika boyunca üç kez suyla yıkayın.

Bunu oda sıcaklığında hafif çalkalama ile yapın. Daha sonra, iskeleleri aynı koşullar altında 30 mililitre% 1 Triton X-100 çözeltisinde yıkayın. Ardından, iki su yıkaması daha yapın.

Şimdi, iskeleleri reaktif sınıfı% 99 aseton,% 99 izopropanol ve% 99 etanol olarak sırayla sonikleştirin. Her sonikasyon adımını, sonikasyon başına beş dakika boyunca iki kez gerçekleştirin. Ardından, iskeleyi toplam 15 dakika boyunca suda üç kez daha sonikleştirin.

İskeleleri tüy bırakmayan bir mendil üzerine yerleştirerek ve gece boyunca oda sıcaklığında havayla kurutarak bitirin. Ertesi gün, iskeleleri 121 santigrat derece ve 15 PSI'da 15 dakika otoklavlayın. Temizliğin işe yaradığını doğrulamak için dolaylı floresan kullanın.

12 oyuklu bir plakanın bir kuyusunu 2000 mikrolitre taze yapılmış kükürt-Rhodamine B boyama çözeltisi ile yükleyin ve forseps kullanarak bu kuyuya bir iskele aktarın. Ardından, bir RFP LED küp filtre seti ile donatılmış bir floresan mikroskobu kullanarak iskelenin negatif görüntülerini yakalayın ve yüksek büyütmede yabancı maddeleri arayın. Biyo-güvenlik kabinini kullanarak, temiz iskeleleri 24 kuyulu bir plakanın kuyularına aktarın.

Her oyuğa 500 mikrolitre 37 santigrat derece kültür ortamı ekleyin ve iskelenin 15 dakika ıslanmasına izin verin. Bu arada, 1 mililitre ortam başına 500.000 Ad-GFP enfekte SEP1 hücresi hazırlayın. 15 dakika sonra, ortamı iskelelerden tamamen aspire edin ve 100 mikrolitre hücre süspansiyonu ile oturtun.

Ardından, 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Kısa inkübasyondan sonra, 500 mikrolitre daha fazla kültür ortamı ekleyin ve iskeleleri 24 saat boyunca inkübe edin. Ertesi gün, yapışmayan hücreleri çıkarmak için kültür ortamını değiştirin.

Ardından, bir GFP LED küp filtre seti ile donatılmış bir floresan mikroskobu kullanarak hücrelerin iskeleler üzerindeki yapışmasını ve yayılmasını değerlendirin. Canlı ölü boyama için, önce SEP1 hücrelerini daha önce olduğu gibi iskele üzerine yerleştirin. 24 ila 48 saat sonra, kültür ortamını tamamen aspire edin ve iskeleleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca DPBS ile yıkayın.

Şimdi, hücreleri Calcein, Hoechst 33342 ve Ethidium homodimer içeren kültür ortamı kullanarak boyayın. Bu üç floroforun tümü ışığa duyarlıdır, bu nedenle karanlıktaki hücreleri ileriye doğru hareket ettirmek hayati önem taşır. İskele boyunca eşit bir dağılım elde etmek için hücreleri floroforlarla 30 dakika inkübe edin.

Belirli iskele özellikleri bu kuluçka süresini etkileyecektir. İnkübasyondan sonra, hücreleri kuyu başına bir mililitre kullanarak DPBS ile üç kez yıkayın. Her yıkamayı oda sıcaklığında beş dakika boyunca gerçekleştirin.

Yıkamalardan hemen sonra, iskeleleri floresan mikroskobu kullanarak belgeleyin. Zaman içinde hücre canlılığını ölçmek için resazurin dönüşüm ölçümlerini kullanın. İlk olarak, 24 oyuklu bir plakaya oturtulmuş SEP1 hücrelerinden kültür ortamını tamamen aspire edin ve hücreleri oyuk başına 500 mikrolitre DPBS ile yıkayın.

Daha sonra, hücreleri gerekli hacimde steril resazurin çalışma solüsyonu ile örtün ve sadece resazurin içeren bir kuyu ekleyin. Ardından, hücreleri 37 santigrat derecede yaklaşık 30 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, metin protokolünde açıklandığı gibi floresansını ölçmek için her bir kuyucuktan 100 mikrolitre şartlandırılmış süpernatanı 96 mikro kuyulu bir plakaya aktarın.

Daha fazla ekim için, resazurini kuyudan çıkarın ve bir mililitre DPBS ile üç kez yıkayın. Her yıkamayı oda sıcaklığında beş dakika boyunca gerçekleştirin. Üçüncü yıkamadan sonra, her bir hücre oyuğuna 500 mikrolitre kültür ortamı ekleyin ve daha fazla zaman seyri ölçümü için inkübasyonlarına devam edin.

Dolaylı floresan boyama kullanılarak, temizleme protokolünü optimize etmek için ön temizleme safsızlıkları belgelenmiştir. İskele üzerindeki madde yükünde önemli bir azalma, açıklanan temizleme protokolünün verimliliğini gösterir. Artroplasti tedavisi için kullanılan ardışık implantlar, hücre materyali arayüzünde meydana gelen olaylarla belirlenir.

İskelelere 24 saat bağlı kaldıktan sonra, SEP1 hücreleri bağlandı. Daha sonra iskeleler üzerinde belirli bir süre boyunca hücre ölümünü ve proliferasyonunu incelemek için floroforlar uygulandı. Canlı ölü boyama, ölü hücrelerde kırmızı floresan ve canlı hücrelerde yeşil floresan ile mavi nükleer boyama gösterdi.

Ek olarak, iskele üzerindeki hücre canlılığı, resazurin dönüşüm testi kullanılarak ölçüldü. İki hafta boyunca, iskele ile veya iskele olmadan kültürlenen hücreler hakkında veri toplandı. Bu işlemi denerken, kullandığınız floroforları elinizdeki iskele ve mikroskoba göre ayarlamayı unutmamanız önemlidir.

Bu prosedürü takiben, proteinlerin varlığını veya sinyal kaskadlarının aktivasyonunu görselleştirmek için immünofloresan boyama gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu tekniğin anlamı, artroplasti tedavisine kadar uzanır, çünkü hücre yüzü çevresindeki doku ile in vivo etkileşimi, işlevini ve dayanıklılığını tanımlayacaktır.