Montaj ve 'Kayma Rings' Uygulama: Orbital tek yönlü ve Periyodik Akışkan Akışının ve Kayma Stres için Yeni Bir Endotel Modeli

Bu modelin genel amacı, endotel hücreleri üzerinde In Vitro periyodik sıvı akışı ve kayma gerilmesi çalışmaları için basit ve ekonomik bir yöntem oluşturmaktır. Bu yöntem, Endotel Hücre Fizyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Örneğin, periyodik kesme endotel hücresi şeklini, yapısını ve işleyişini nasıl etkiler.

Bu tekniğin ana avantajı, hücresel yanıtların değerlendirilmesi için nispeten geniş yüzey alanları sağlayan basit bir şekilde monte edilmiş bir doku kültürü cihazı kullanmasıdır. Bu prosedürü gösteren, laboratuvarımda bir tıp öğrencisi olan Bay Luke White olacak. Bu prosedüre, 150 milimetrelik dairenin ortasına yerleştirilmiş 150 milimetre dış kenar profiline ve 100 milimetre iç çapa sahip bir kesme halkası yapı şablonu oluşturmak için sunum yazılımını kullanarak başlayın.

Şablonu bir A4 beyaz kağıda yazdırın. Yeterli havalandırmaya sahip bir çeker ocak altında ve eldiven giyerek çalışarak, 150 milimetrelik bir cam Petri kabına 10 milimetre metilen klorür pipetleyin. Metilen klorür çoğu plastiği çözündürdüğü için yemeğin cam olması çok önemlidir.

150 milimetrelik plastik bir Petri kabını dış kesme şablonuna hizalayın. 100 milimetrelik bir çanağın ortasında 3 milimetrelik üç adet delik açmak için döner bir alet kullanın. Sondajdan çıkan plastik talaşları çıkarın.

100 milimetrelik Petri kabını eldivenli bir elinizle tutarken, kabın üst kenarını ters çevirin ve yaklaşık üç saniye boyunca metilen klorür havuzuna daldırın. Fazla metilen klorürün 100 milimetrelik tabaktan damlamasına izin verin ve ardından ıslanan tabak kenarını hızla 150 milimetrelik kabın ortasına aktarın. 100 milimetrelik çanağı işaretli şablona dikkatlice hizalayın.

150 milimetrelik tabağa iyi bir yapışma sağlamak için 100 milimetrelik çanağı birkaç kez saat yönünde ve saat yönünün tersine nazikçe çevirin. Metilen klorür kuruduktan sonra, yeni bağlanan Petri kaplarını ters çevirin ve temas noktalarını dikkatlice inceleyin. Sıkı bir conta tamamen oluşmadıysa, bir transfer pipeti ile 3 milimetrelik delikten 0,5 mililitre metilen klorür enjekte edin.

Çanağı alın ve metilen klorürün kenara ulaşmasını sağlamak için hafifçe döndürün. İki Petri kabı arasında sıkı bir sızdırmazlık sağlandığından emin olduktan sonra, 3 milimetrelik bir silikon kauçuk dolgu macunu uygulayarak 100 milimetrelik tabaktaki deliği kapatın. Düz bir kesme kafası ile donatılmış bir döner alet kullanarak, 15 milimetrelik bir konokol polistiren doku kültürü tüpünün üst 3 santimetrelik kısmını kesin ve tüpün en az bir santimetresini kapağın altında bırakın.

Kesilen borunun kenarını pürüzsüz ve düz olana kadar parlatmak için kesme kafasının düz tarafını kullanın. Taşlama ile oluşan plastik talaşları çıkarın. Bir işaretleyici ile, kesilen 15 mililitrelik konkolo tüpünü, tabağın kenarından yaklaşık 0,5 santimetre uzakta 150 milimetrelik tabağın kapağına izleyin.

Çizilen dairenin içinde, dairenin kenarından yaklaşık bir ila iki milimetre uzakta bir kenar boşluğu bırakarak bir delik açın. Kesilen conocole tüpünün üst kısmını delinmiş deliğin üzerine yerleştirin. Bir transfer piteti kullanarak, conocole tüpünü 150 milimetrelik kapağa bağlamak için conocole tüpünün kesik kenarlarına yaklaşık çeyrek mililitre veya 250 mikrolitre metilen klorür uygulayın.

Son olarak, 150 milimetrelik kapağı, üst Petri kabının iç kenarına bir milimetre kalınlığında silikon kauçuk dolgu macunu uygulayarak 150 milimetrelik tabağa kapatın. Monte edilmiş bir sararma halkasının bir şeması gösterilmiştir. Mavi, kaplanmış endotel hücrelerinin alanını temsil eder.

Dış ve iç kısımdaki kırmızı oklar, bir yörünge çalkalayıcı üzerine yerleştirildiğinde kesme halkasının ve kesme halkasının içindeki ortamın yörünge hareketini gösterir. 15 mililitrelik conocole tüp portu aracılığıyla yeni oluşturulan kesme halkasına yaklaşık 10 milimetre PBS pipetleyerek sterilizasyona hazırlanın. Kesme halkasının içindeki kalıntıları temizlemek için etrafta döndürün.

PBS'yi bir Pasteur pipeti ve vakum aspiratörü ile çıkarın. Tüm kalıntılar temizlenene kadar PBS yıkamasını tekrarlayın. Kesme halkasını sterilize etmek için% 70 etanol durulama ve UV ışınlamasının bir kombinasyonu kullanılacaktır.

Havalandırmalı kapağı sökün, erişim portundan yaklaşık 10 mililitre %70 etanol pipetleyin ve kapağı tekrar vidalayın. Kızartma halkasının iç kısmının iyice yıkandığından emin olarak kızartma halkasını birden çok kez döndürün ve ters çevirin. Bir doku kültürü başlığı altında, fazla% 70 etanolü aspire edin.

Bir sprey şişesiyle, erişim portuna ve kapağa %70 etanol iyice püskürtün. Daha sonra, kesme halkasını ve kapağı UV radyasyonu altında, tamamen kuruyana kadar doku kültürü başlığına yerleştirin. Kesme halkası kuruduktan sonra kapağı tekrar vidalayın.

Sterilize edilmiş kesme halkalarını, hücre kültürü kaplamasında kullanılana kadar oda sıcaklığında saklayın. Bir kesme gerilimi çalışmasına hazırlanmak için, standart hücre kültürü protokolünü takiben sterilize edilmiş kesme halkalarında ilk plaka endotel hücreleri. Akış etütlerinin başlatılmasından önce kültürün birleşime ulaşmasına izin verin.

Hücreler birleştiği yere ulaştığında, raf stresini ve titreşimini en aza indirmek için deneysel kesme halkalarını inkübatördeki alt rafa yerleştirilen bir orbital çalkalayıcı üzerine yerleştirin. Statik kontrol grubu kesme halkalarını aynı inkübatörün içine yerleştirin. İstenilen kesme gerilimi uygulaması süresi boyunca kesme halkalarını çalkalayıcı üzerinde bırakın.

Hücre katmanları istenen süre boyunca kesmeye maruz kaldıktan sonra, kesme halkalarını inkübatörden çıkarın. Kesme halkası kapağını çekin ve istenen uç nokta analizi için hücreleri ve/veya ortamı alın. Kesme halkalarını açtıktan sonra, araştırmacıların çeşitli yöntemler kullanarak analiz için hücreleri ve ortamı toplayabileceklerini unutmayın.

İnsan CMEC D3 Beyin Endotel hücresi mono katmanlarının 48 saatlik periyodik sıvı kesmeyi veya statik maruziyeti takiben kesme halkalarında ortaya çıkmasının temsili sonuçları gösterilmiştir, kültürün hizalanmasının her zaman oklarla gösterilen akış yönüne paralel olmadığı gözlenmiştir. Periyodik kesmeye bazı yanıtlar Sıçan Retinal Mikrovasküler Endotel hücre mono katmanlarında gösterilmiştir. Kesme halkalarında 72 saatlik periyodik sıvı kesmesi, Beta-aktin yükleme kontrolüne göre Trombosit-endotel hücre adezyon molekülünde önemli bir azalma ile sonuçlandı.

Bir kez ustalaştıktan sonra, düzgün bir şekilde gerçekleştirilirse yaklaşık üç saat içinde birkaç Kesme Halkası yapılabilir: Bu prosedürü denerken, iç çanağı dış çanak ile dikkatlice hizalamayı ve aralarında sıkı bir sızdırmazlık oluştuğunu unutmamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, endotel hücreleri üzerinde In Vitro periyodik sıvı akışı ve kesme gerilimi çalışmaları yapmak için basit bir yöntem olarak kesme halkalarının nasıl oluşturulacağını ve kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız. Metilen klorür ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bunu gerektiren adımları gerçekleştirirken çeker ocak altında çalışmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.