İşlevsel Genomik Tarama kullanılması Kanser Hücre Sfero Kültürleri Potansiyel Yeni İlaç Hedefleri Belirlemek İçin
26 Aralık 2016
Klinik öncesi testlerden insan denemelerine geçiş yapan yeni ilaç hedeflerinin belirlenmesi bilimsel bir önceliktir. Bu amaçla, burada, gen tükenmesinin kanser hücre hattı sferoidleri üzerindeki etkisini incelemek için işlevsel bir genomik yaklaşımı tanımlıyoruz, bu da insan kanserlerini in vivo olarak daha uygun bir şekilde modelliyor.
Bu siRNA tarama protokolünün amacı, gen susturmanın kanser hücre hattı sferoid büyümesi üzerindeki etkisini araştırmaktır. Geleneksel iki boyutlu hücre kültürü teknikleriyle karşılaştırıldığında, kanser sferoidleri, in vivo olarak tümörlerde karşılaşılanlara daha benzer koşullar gösterir. Bu yöntem, insan kanserlerinde sık sık değiştirilen genlerin fonksiyonel değerlendirmesi için yararlıdır ve daha da önemlisi, üç boyutlu kültürde görüldüğü gibi daha karmaşık kültür koşulları altında ve özellikle hipoksi altında hangi genlerin potansiyel onkogenler veya tümör baskılayıcılar olduğunu belirlemek için kullanılabilir.
Bu tekniğin temel avantajı, araştırmacıların tercih ettikleri hücre dizilerinde ilgilendikleri belirli genleri incelemek için kullanabilmeleri için kolayca uyarlanabilir olmasıdır. Mevcut hedefli sRNA tarama yaklaşımları üzerine inşa edildiğine inanıyoruz. Genel olarak, tüm genom suşları yerine hedeflenen ekranların, bilim insanlarının belirli sorular sormasına ve daha sağlam sonuçlar üretmesine izin verdiği takdir edilmektedir.
Gen susturmanın küresel canlılık ve boyut üzerindeki etkisini analiz ettik, ancak apoptoz gibi farklı bir ekran okuması için biyometrik boyalar da kullanabilirsiniz. Prosedürü gösteren laboratuvarımızdan Patty Wai'dir. siRNA kitaplığını içeren 96 oyuklu plakaların buzunu oda sıcaklığında çözerek başlayın.
Daha sonra, tezgah üstü bir santrifüj kullanarak 1.000 kez g'de beş dakika döndürün. Her bir plakanın kuyucuklarına optimize edilmiş transfeksiyon reaktifi içeren 10 mikrolitre indirgenmiş serum ortamı eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın. siRNA içeren transfeksiyon komplekslerinin oluşmasına izin vermek için 15 dakika inkübe edin.
Herhangi bir eleme boru hattında olduğu gibi, transfeksiyon koşullarında hücre hatlarının küresel oluşturma kapasitesi, tam ekran gerçekleştirilmeden önce sağlam bir şekilde optimize edilmelidir. Daha sonra, taranacak hücreleri şişeden ayrılana kadar deneyin. Hücreler ayrıldıktan sonra, tripsini uygun bir hacimde hücre hattına özgü ortamla nötralize edin, bir santrifüj tüpüne aktarın ve hücreleri toplamak için tezgah üstü bir santrifüjde 1.000 kez g'de beş dakika döndürün.
Süpernatanı atın ve peleti uygun bir hacimde ortam ile tek hücreli bir süspansiyona yeniden süspanse edin. Otomatik hücre sayacı kullanarak hücre sayımı gerçekleştirin. Daha sonra süspansiyonu soğuk ortamla 180 mikrolitre başına 5.000 hücreye seyreltin.
Hücre süspansiyonunu bir rezervuara aktarın. 180 mikrolitreye ayarlanmış çok kanallı bir pipet kullanarak, hücre süspansiyonunu karıştırmak ve siRNA'yı içeren 96 oyuklu plakaya aktarmak için pipetleyin. Plakayı önceden soğutulmuş, 4 santigrat derece santrifüjde 10 dakika boyunca 1.000 kez g'de santrifüjleyin ve ardından plakayı 37 santigrat derece doku kültürü inkübatöründe inkübe edin.
Bu noktada, hücreler kuyuların dibinde bir mozaik olarak görünecektir. 24 saat sonra hücreleri mikroskop altında gözlemleyin. Bu noktada, hücreler kuyu merkezinde tek bir küresel oluşturmak için bir araya getirilmelidir.
Kuluçka makinesine dönmeden önce büyümeyi teşvik etmek için her oyuğa 100 mikrolitre tam ortam ekleyin. Üç günlük büyümeden sonra, her kuyucuktan 100 mikrolitre ortamı yavaşça çıkarın ve 100 mikrolitre taze ortam ekleyin. Yedinci günde, sferoidleri mikroskop altında inceleyin ve ardından zaman içinde sferoid büyümesini kantitatif olarak izleyebilen bir plaka okuyucuda sferoid boyutunu ölçmeye devam edin.
Küresel boyutu ölçmek için önce yazılımı bilgisayarda açın. 96 kuyulu plakayı seçin, uygun plaka tipini seçin ve bir deney adı girin. Ardından, sferoidleri içeren 96 oyuklu plakayı tezgah üstü, mikro kuyulu plaka görüntüleme sitometresine yerleştirin.
Ardından, Tumorsphere uygulamasını seçin. Odağı, sferoid odakta olacak ve optimum kontrasta sahip olacak şekilde değiştirmek için görüntü tabanlı odağı seçin. Tarama gerektiren kuyuları seçin ve taramayı başlatın.
Ardından, nesne maskesinin küresel boyutu doğru bir şekilde temsil ettiğinden emin olun. Yedi gün boyunca yetiştirilen BT474 sferoidleri için Hassasiyeti Yüksek olarak ayarlayın ve minimum Koloni Çapını 200 mikron olarak ayarlayın. Verileri, küresel alan üzerinde istatistiksel olarak anlamlı bir etkiye sahip siRNA'ları tanımlamak için analiz edilecek açıklamalı bir veri dosyası biçiminde dışa aktarmak için Dışa Aktar işlevini kullanın.
Görüntülemeden sonra, her oyuktan 100 mikrolitre ortam çıkarın ve hücre canlılığını belirlemek için 100 mikrolitre ışıldayan canlılık boyası ekleyin. Plakaları 15 dakika inkübe ettikten sonra, ışıldayan bir plaka okuyucu kullanarak plakayı tarayın. Bu protokol ayrıca diğer kanser hücre dizileri ile kullanım için de uyarlanabilir.
Hedeflemeyen kontrollerin ters transfeksiyon prosedürü, test edilen hatların hiçbiri için canlılığı önemli ölçüde etkilemezken, pozitif bir hücre öldürme kontrolü olan Ubiquitin B'nin transfeksiyonu, canlılığı önemli ölçüde azalttı. BT474 hücreleri, 200 genli İnsan siGENOME siRNA Kütüphanesi ile üç kopya halinde ters transfekte edildi. Sferoid alan ve canlılık gözlendi.
Z-skoru 1.7'den büyük olan önemli aykırı değerler tespit edildi. Küresel alanı ve canlılığı önemli ölçüde artıran veya azaltan SiRNA'lar mavi renkle gölgelendirilir ve kırmızı, kontrol siRNA'larını gösterir. Bu mikrograf seti, hedeflemeyen bir kontrol olan E-Cadherin, PIK3CA, ERBB2 veya SF3B1 siRNA ile ters transfeksiyondan yedi gün sonra BT474 sferoidlerinin temsili görüntülerini gösterir.
Bu histogram, her bir siRNA ile yapılan tedavinin, ters transfeksiyondan yedi gün sonra hücre canlılığını nasıl etkilediğini gösterir. ERBB2 ve PIK3CA'nın yıkılması, kontrollere kıyasla hücre canlılığını önemli ölçüde azalttı. Bu görüntü, gen susturmanın hedef proteinler üzerindeki etkisini ortaya çıkarmak için sferoidlerin başarılı bir şekilde immün boyanabileceğini göstermektedir.
Bir kez ustalaştıktan sonra, birkaç yüz gen bir günde birden fazla hücre hattında taranabilir ve bu, üç boyutlu kültürde hayatta kalmak için önemli olan potansiyel olarak yeni genlerin sağlam bir şekilde tanımlanmasına izin verir. Bu videoyu izledikten sonra, sRNA aracılı gen susturmaya uygun kanser hücresi sferoidlerinin nasıl başarılı bir şekilde kültürleneceğini iyi anlamış olmalısınız. Ayrıca sferoidler üzerinde immünohistokimya yaparak gen susturmanın etkisini araştırabileceksiniz.
Bu, altta yatan biyoloji hakkında sizi bilgilendirebilecek değerli uzaysal bilgiler sunabilir.
Genel Bakış
Bu makale, kanser hücre hattı kürelerinde gen tükenmesi etkilerini inceleyerek potansiyel ilaç hedeflerini belirlemek için fonksiyonel genomik yaklaşım sunar. Bu küreler, geleneksel 2D kültürlere kıyasla in vivo insan tümörlerini daha doğru bir şekilde modellemektedir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Fonksiyonel Genomik
- Kanser Biyolojisi
- Hücre Kültür Teknikleri
Arka Plan
- Gen susturma, onkojenleri ve tümör baskılayıcıları ortaya çıkarabilir.
- Kanser küreleleri, tümör mikroçevresi'ni 2D kültürlerden daha yakından taklit eder.
- Hedefli siRNA taraması, spesifik gen araştırmasına olanak tanır.
- Hipobik koşullar bu yöntem kullanılarak incelenebilir.
Çalışmanın Amacı
- Kanser küresi büyümesi üzerinde gen susturmasının etkisini araştırmak.
- Yeni ilaç hedefleri olarak hizmet edebilecek genleri tanımlamak.
- 3D kültür ortamında gen fonksiyonu hakkındaki anlayışı geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Kanser hücre hattı kürelerinde siRNA taraması.
- Güçlü küre oluşumu için transfeksiyon koşullarının optimizasyonu.
- Görüntüleme sitometrisi kullanılarak küre boyutu ve canlılığının kantifikasyonu.
- Gen susturma etkilerinin hücre canlılığı ve büyümesi üzerindeki analizi.
Ana Sonuçlar
- Belirli siRNA'ların küre canlılığı ve boyutu üzerinde önemli etkilerin gözlendiği görüldü.
- ERBB2 ve PIK3CA'nın susturulması, kontrollerde karşılaştırıldığında hücre canlılığını azalttı.
- 3D kültürde hayatta kalma için önemli genlerin güçlü bir şekilde tanımlanması sağlandı.
- Yöntemin çeşitli kanser hücre hatları için uyarlanabilirliği gösterildi.
Sonuçlar
- Bu yaklaşım, tek bir günde yüzlerce genin taranmasına izin verir.
- Kanser'de potansiyel terapötik hedefleri tanımlamak için değerli bir araç sunar.
- Yöntem, daha fizyolojik olarak alakalı bir bağlamda gen fonksiyonu hakkındaki anlayışı geliştirir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Functional genomics screening in 3D cancer spheroid models enhances target validation by revealing gene dependencies under physiologically relevant conditions. This approach improves predictive confidence in identifying novel drug targets by capturing tumor microenvironment influences often missed in 2D cultures. The method supports early discovery decisions by linking gene silencing effects to spheroid growth and viability, enabling mechanistic de-risking of candidate targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by assessing the impact of gene silencing on cancer spheroid growth and viability.
- Operational Value: Enables functional assessment of frequently altered genes in human cancers under complex culture conditions.
- Predictive Value: Identifies potential oncogenes or tumor suppressors that are critical for survival in 3D culture, supporting target prioritization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Utilizes siRNA screening to generate quantitative readouts of spheroid area and viability for gene effect analysis.
- Operational Value: Requires optimization of transfection conditions and spheroid formation capacity to ensure robust and reproducible screening outcomes.
- Assay Readiness: Employs imaging cytometry and luminescent viability dyes to enable high-content, quantitative monitoring of spheroid growth over time.
Translational & Preclinical Research
- Translational Relevance: Confirms spatial impact of gene dependencies via immunohistochemistry, linking molecular findings to protein-level changes in spheroids.
- Preclinical Continuity: Demonstrates dependency on HER2 amplification and PIK3CA mutation in BT474 spheroids, validating known cancer drivers in a 3D model.
- Mechanistic De-risking: Provides spatial and functional validation of gene effects, reducing ambiguity in target mechanism before downstream investment.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target identification through lead optimization, particularly for targets requiring validation in complex, hypoxia-prone tumor models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by linking gene knockdown to spheroid viability and size changes.
- Screening: Enables assay standardization through reverse transfection protocols and standardized spheroid formation in 96-well formats.
- Analytics: Generates quantitative spheroid area and viability data via imaging cytometry and luminescent readouts, enabling statistical identification of significant hits (e.g., z-score >1.7).
- Translational Research: Connects gene silencing effects to spatial protein expression via immunohistochemistry, enhancing biomarker alignment and mechanistic insight.
- Enterprise Reuse: Adaptable across cancer cell lines and siRNA libraries, positioning it as a reusable platform for target validation campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by revealing gene dependencies in a tumor-relevant 3D context.
- Operational Value: Promotes reproducibility through standardized spheroid formation, transfection optimization, and quantitative imaging workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing false positives from 2D models and increasing confidence in target essentiality.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on functional evidence from physiologically relevant models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, transfection techniques, and 3D model handling to ensure robust spheroid formation.
- Dependent on access to imaging cytometry and luminescent plate readers for quantitative spheroid size and viability assessment.
- Necessitates optimization of transfection conditions and cell density (5,000 cells/180 µL) for consistent spheroid formation across wells.
- Requires adaptation considerations when extending to other cancer cell lines or hypoxia-modulated conditions.
- Practical limitation: Screening throughput depends on siRNA library size and imaging capacity, though hundreds of genes can be screened per day once optimized.
