Grip virüsü monoklonal antikorları nötralize kaçış türevleri üretimi

Bu yöntemin genel amacı, nötralize edici bir monoklonal antikorun epitopunun nasıl aydınlatılacağına dair çalışan bir protokol sağlamaktır. Bu yöntem, konakçı-virüs etkileşimlerini tanımlamaya, terapötikler ve tanı araçları geliştirmeye yardımcı olabilecek ve tüm bunlar aşı tasarımına katkı sağlayacak olan immünoloji ve viroloji alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, özel aletler veya ekipmanlar gerektirmeden temel doku kültürü ve moleküler biyoloji teknikleriyle uygulanabilmesidir.

Prosedürü, Peter Palese'nin laboratuvarından MD, PhD öğrencisi Mark Bailey uygulamaktadır. Bu prosedüre, metin protokolünde açıklandığı üzere hemaglütinasyon inhibisyonu (HI) ve nötralizasyon aktivitelerine dayalı antikor karakterizasyonu ile başlayın. HI aktivitesi gösteren nötralize edici antikorlar, öncelikle ilgili antikorun artan konsantrasyonlarda dört dilüsyonunun, dilüsyon başına 100 microliter hacimde bir katlı PBS içinde hazırlanmasıyla daha ileri düzeyde analiz edilir.

Ardından, 400 µL hacminde 1x PBS içerisinde, mililitrede bir milyon plak oluşturan birim içeren bir virüs stoğu hazırlayın. Daha sonra, mililitrede bir milyon plak oluşturan birim içeren virüsten 100 µL'yi, her bir antikor dilüsyonundan 100 µL veya 100 µL 1x PBS ile karıştırın. Örnekleri %5 CO₂ içeren 37 °C'lik bir inkübatörde bir saat boyunca inkübe edin.

Kısaca vortekslendikten sonra, her bir karışımın 200 µL'sini patojen içermeyen spesifik embriyonalı tavuk yumurtalarına enjekte edin. Ardından, yumurtaları karbondioksit olmadan 37 °C'de 40 ila 44 saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, virüs enfekte embriyonalı yumurtaları en az altı saat boyunca 4 °C'ye yerleştirerek sakrifiye edin.

Ardından, daha önce açıklandığı şekilde yumurtalardan allantoik sıvıyı hasat edin. Son olarak, metin protokolünde belirtildiği üzere HI testi uygulayarak kaçış varyantlarını doğrulayın. HI aktivitesi göstermeyen nötralize edici antikorlara karşı kaçış varyantları oluşturmak için virüs, artan miktarlarda antikor varlığında pasajlanmalıdır.

MDCK hücrelerini altı kuyucuklu bir plakaya, her kuyucukta bir milyon hücre olacak yoğunlukta ekleyin. Hücreleri, %5 karbon dioksit içeren 37 °C'lik bir inkübatörde en az dört saat boyunca inkübe edin. Bu sırada, virüs stokunu mililitre başına bir milyon plak oluşum birimi olacak şekilde seyreltin.

250 µL hacmindeki TPCK ile işlenmiş tripsin içeren bir kez MEM içinde, 0,02 mg/mL konsantrasyonunda tek bir antikor dilüsyonu hazırlayın. Sonraki tüm pasajlar için daha yüksek antikor konsantrasyonları kullanın. 250 µL dilüe edilmiş virüsü, 250 µL dilüe edilmiş antikor ile veya antikor içermeyen kontrol olarak 250 µL bir kez MEM ile karıştırın.

Virüs antikor karışımını, %5 karbon dioksit içeren 37 °C'lik bir inkübatörde 30 dakika inkübe edin. Hücrelerin inkübasyonunun ardından, medyumu cam bir Pasteur pipeti kullanarak aspire edin ve hücre monotabanını 1 mL 1x PBS ile yıkayın. Karışımlardan 500 µL'yi kuyucuklara ekleyin ve %5 karbon dioksit içeren 37 °C'lik bir inkübatörde bir saat boyunca inkübe edin.

Bir saat sonra, kuyucuklara TPCK ile işlem görmüş tripsin içeren iki mililitre 1x MEM ekleyin. Enfeksiyondan 48 saat sonra, mikroskop altında sitopatik etki (CPE) belirtileri için hücreleri kontrol edin veya viral büyümeyi tespit etmek için bir hemaglütinasyon testi yapın. Antikor eklenen kültürde CPE büyümesi varsa, süpernatantı birden fazla kriyotüpe toplayın.

Tüpleri pasaj numarasıyla etiketleyin ve -80 °C'de saklayın. TPCK tripsin ve antikor ile desteklenmiş 2 mL 1x MEM kullanılarak taze bir MDCK monokatmanını enfekte etmek için süpernatandan 100 µL ayırın. Her pasaj için antikor içermeyen bir kontrol eklemeyi unutmayın.

Antikor konsantrasyonunu, final konsantrasyonu 0,6 mg/mL antikor olduğunda bile virüs büyümesi hala mümkün olana kadar her ardışık pasajda artırın. Her pasajın süpernatantından alınan çok sayıda viyali dondurun ve -80 °C'de saklayın. Metin protokolünde detaylandırıldığı üzere kaçan varyantların izolasyonu ve analizlerine geçin.

Aday H7N9 influenza A aşısı ile aşılanmış bireylerden izole edilen aşı kaynaklı antikorlar, kaçış mutant varyantlarını oluşturmak için kullanılmıştır. Kaçış mutant haritalaması, antikorların çoğunun viral HA üzerindeki farklı konumlarda kritik kalıntıları tanıdığını ortaya koymuştur. Kırmızı ile belirtilen her kalıntı, bir monoklonal antikorun etkin bağlanması için gerekli olan kritik amino asitlerin konumunu temsil ederken, HI-pozitif antikorların çoğunluğunun kaçış mutant kalıntıları, H7HA'nın daha önce rapor edilen antijenik bölgelerinin yakınındadır. HI-negatif antikorlar ise stok bölgesinde nokta mutasyonlarına sahip kaçış mutantları oluşturmuştur.

Bu teknik bir kez kavrandığında, diğer patojenlere karşı korumanın yapısal belirleyicilerini aydınlatmak için uygulanabilir. Bu teknik sadece monoklonal antikorların kaçış varyantlarını üretmekle sınırlı olmayıp, antiviral bileşiklere karşı da uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, in vitro ortamda kaçış varyantları üreterek monoklonal antikorların bağlanma epitopunun nasıl aydınlatılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Bu prosedürü uygularken, virüslerle çalışırken dikkatli olmanın ve uygun kişisel koruyucu ekipman kullanmanın önemli olduğunu unutmamak gerekir.