Grip virüsü monoklonal antikorları nötralize kaçış türevleri üretimi

Bu yöntemin genel amacı, nötralize edici bir monoklonal antikorun epitopunun nasıl aydınlatılacağına dair bir çalışma protokolü sağlamaktır. Bu yöntem, konakçı virüs etkileşimlerini tanımlamaya, terapötikler ve teşhis araçları geliştirmeye yardımcı olabilecek immünoloji ve viroloji alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir ve bunların tümü aşıların tasarımına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, özel alet veya ekipman gerektirmeden temel doku kültürü ve moleküler biyoloji teknikleri ile yapılabilmesidir.

Prosedürü göstermek, Peter Palese'nin laboratuvarından bir MD, PhD öğrencisi olan Mark Bailey olacak. Bu prosedüre, metin protokolünde tarif edildiği gibi hemoaglütinasyon inhibisyonu veya HI ve nötralizasyon aktivitelerine dayalı antikorların karakterizasyonu ile başlayın. HI aktivitesine sahip nötralize edici antikorlar, ilk olarak, seyreltme başına 100 mikrolitrelik bir hacimde bir kez PBS'de artan konsantrasyonlarda ilgilenilen antikorun dört seyreltmesinin hazırlanmasıyla daha fazla analiz edilir.

Daha sonra, 400 mikrolitrelik bir hacimde bir kez PBS'de mililitre başına bir milyon plak oluşturan birimden oluşan bir virüs stoğu hazırlayın. Daha sonra, her bir antikor seyreltmesinin 100 mikrolitresi veya 100 mikrolitre PBS'nin mililitresi başına bir milyon plak oluşturan birimin 100 mikrolitresini karıştırın. Numuneleri% 5 karbondioksit içeren 37 santigrat derecelik bir inkübatörde bir saat inkübe edin.

Kısa bir süre girdaplama yaptıktan sonra, her karışımdan 200 mikrolitreyi spesifik patojen içermeyen embriyonlu tavuk yumurtalarına enjekte edin. Daha sonra yumurtaları 40 ila 44 saat boyunca karbondioksit olmadan 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, virüsle enfekte olmuş embriyonlu yumurtaları en az altı saat boyunca dört santigrat dereceye koyarak kurban edin.

Daha sonra, daha önce tarif edildiği gibi allantoik sıvıyı yumurtalardan toplayın. Son olarak, metin protokolünde açıklandığı gibi HI testini gerçekleştirerek kaçış varyantlarını onaylayın. HI aktivitesi olmayan nötralize edici antikorlara karşı kaçış varyantları oluşturmak için, virüsün artan miktarlarda antikor varlığında geçirilmesi gerekir.

Plaka MDCK hücreleri, kuyucuk başına bir milyon hücre yoğunluğunda altı oyuklu bir plakada. Hücreleri% 5 karbondioksit içeren 37 santigrat derecelik bir inkübatörde en az dört saat inkübe edin. Bu arada, virüs stoğunu mililitre başına bir milyon plak oluşturan birime seyreltin.

250 mikrolitrelik bir hacimde TPCK ile muamele edilmiş tripsin ile bir kez MEM'de mililitre başına 0.02 miligramda tek bir antikor seyreltmesi hazırlayın. Aşağıdaki tüm pasajlar için daha yüksek antikor konsantrasyonları kullanın. 250 mikrolitre seyreltilmiş virüsü 250 mikrolitre seyreltilmiş antikor veya antikor kontrolü olarak 250 mikrolitre bir kez MEM ile karıştırın.

Virüs antikor karışımını% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecelik bir inkübatörde 30 dakika inkübe edin. Hücrelerin inkübasyonunu takiben, bir cam Pasteur pipeti kullanarak ortamı aspire edin ve tek katmanlı hücreleri bir mililitre PBS ile yıkayın. Bir saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 derece santigrat derece inkübatörde inkübe etmeden önce 500 mikrolitre karışımları kuyucuklara ekleyin.

Bir saat sonra, kuyucukları TPCK ile muamele edilmiş tripsin ile iki mililitre bir kez MEM ile destekleyin. Mikroskopta sitopatik etki veya CPE belirtileri için enfeksiyondan 48 saat sonra hücreleri kontrol edin veya viral bir büyümeyi tespit etmek için bir hemoaglütinasyon testi yapın. Antikor ile takviye edilmiş kültürde büyüme CPE varsa, süpernatanı birden fazla kriyotüpte hasat edin.

Tüpleri geçiş numarasıyla etiketleyin ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. TPCK, tripsin ve antikor ile desteklenmiş iki mililitre bir kez MEM ile taze bir MDCK tek tabakasını enfekte etmek için 100 mikrolitre süpernatan tasarruf edin. Her geçiş için antikorsuz bir kontrol eklemeyi unutmayın.

Mililitre antikor başına 0.6 miligramlık nihai konsantrasyonla bile, virüs büyümesi hala canlı olana kadar her ardışık geçişte antikor konsantrasyonunu arttırın. Her pasajın çoklu süpernatan şişelerini dondurun ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. Metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi kaçan varyantların izolasyonuna ve analizlerine devam edin.

Aday H7N9 influenza A aşısı ile aşılanan bireylerden izole edilen aşı kaynaklı antikorlar, kaçış mutant varyantları oluşturmak için kullanıldı. Kaçış mutant haritalaması, antikorların çoğunun viral HA üzerindeki farklı yerlerde kritik kalıntıları tanıdığını ortaya koydu. Kırmızı ile gösterilen her bir kalıntı, bir monoklonal antikorun verimli bir şekilde bağlanması için gerekli olan kritik amino asitlerin yerini temsil ederken, HI-pozitif antikorların çoğu, H7HA'nın daha önce bildirilen antijenik bölgelerinin yakınındaki mutant kalıntılardan kaçmıştır. HI-negatif antikorlar, stok bölgesinde nokta mutasyonları olan kaçış mutantları üretti.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik diğer patojenlere karşı korumanın yapısal belirleyicilerini aydınlatmak için uygulanabilir. Bu teknik sadece monoklonal antikorların kaçış varyantlarının üretilmesiyle sınırlı değildir, aynı zamanda antiviral bileşiklere karşı da geçerlidir. Bu videoyu izledikten sonra, in vitro kaçış varyantları oluşturarak monoklonal antikorların bağlanma epitopunun nasıl aydınlatılacağını iyi anlamış olmalısınız.

Bu prosedürü denerken, virüslerle çalışırken dikkatli olmayı ve uygun kişisel koruma ekipmanı kullanmayı unutmamak önemlidir.