Name: Grip virüsü monoklonal antikorları nötralize kaçış türevleri üretimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Öğrenin, grip virüsü hemaglutininine karşı nötralize edici monoklonal antikorların bağlanma epitoplarını belirlemek için kaçış türevleri üretme yöntemini. Bu teknik, aşı tasarımına ve viral direnç mekanizmalarının anlaşılmasına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu proje kısmen Ulusal Enstitüsü alerji ve enfeksiyon hastalıkları gelen federal fonları ile finanse edilmiştir, Ulusal Sağlık enstitüleri, bölümü sağlık ve insan Hizmetleri, CEIRS altında HHSN272201400008C (F.K.) sözleşme; NIH U19AI109946-01 (F.K.); ve P01AI097092-04S1 (P.E.L.).

<ol><li>Shaw, M. L., Palese, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShaw%2C+ML+%22Orthomyxoviridae%3A+the+viruses+and+their+replication%22">Orthomyxoviridae: the viruses and their replication</a>. , (2013).</li>
<li>Nelson, M. I., Holmes, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+epidemic+influenza%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">The evolution of epidemic influenza.</a> Nat Rev Genet. 8 (3), 196-205 (2007).</li>
<li>Lauring, A. S., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quasispecies+Theory+and+the+Behavior+of+RNA+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Quasispecies Theory and the Behavior of RNA Viruses.</a> PLoS Pathog. 6 (7), e1001005(2010).</li>
<li>Henry Dunand, C. J., Leon, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preexisting+human+antibodies+neutralize+recently+emerged+H7N9+influenza+strains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Preexisting human antibodies neutralize recently emerged H7N9 influenza strains.</a> J Clin Invest. 125 (3), 1255-1268 (2015).</li>
<li>Dunand, C. J. H., Leon, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Both+Neutralizing+and+Non-Neutralizing+Human+H7N9+Influenza+Vaccine-Induced+Monoclonal+Antibodies+Confer+Protection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Both Neutralizing and Non-Neutralizing Human H7N9 Influenza Vaccine-Induced Monoclonal Antibodies Confer Protection.</a> Cell Host Microbe. 19 (6), 800-813 (2016).</li>
<li>Tan, G. S., Lee, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+Broadly+Neutralizing+Monoclonal+Antibody+That+Targets+the+Fusion+Domain+of+Group+2+Influenza+A+Virus+Hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Characterization of a Broadly Neutralizing Monoclonal Antibody That Targets the Fusion Domain of Group 2 Influenza A Virus Hemagglutinin.</a> J Virol. 88 (23), 13580-13592 (2014).</li>
<li>Tan, G. S., Leon, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadly-Reactive+Neutralizing+and+Non-neutralizing+Antibodies+Directed+against+the+H7+Influenza+Virus+Hemagglutinin+Reveal+Divergent+Mechanisms+of+Protection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Broadly-Reactive Neutralizing and Non-neutralizing Antibodies Directed against the H7 Influenza Virus Hemagglutinin Reveal Divergent Mechanisms of Protection.</a> PLoS Pathog. 12 (4), e1005578(2016).</li>
<li>Smith, K., Garman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+generation+of+fully+human+monoclonal+antibodies+specific+to+a+vaccinating+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen.</a> Nat Protoc. 4 (3), 372-384 (2009).</li>
<li>Steel, J., Lowen, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+virus+vaccine+based+on+the+conserved+hemagglutinin+stalk+domain%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Influenza virus vaccine based on the conserved hemagglutinin stalk domain.</a> mBio. 1 (1), (2010).</li>
<li>Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Margine, I., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+hemagglutinin+influenza+virus+vaccine+constructs+elicit+broadly+protective+stalk-specific+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Chimeric hemagglutinin influenza virus vaccine constructs elicit broadly protective stalk-specific antibodies.</a> J Virol. 87 (12), 6542-6550 (2013).</li>
<li>Wang, T. T., Tan, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccination+with+a+synthetic+peptide+from+the+influenza+virus+hemagglutinin+provides+protection+against+distinct+viral+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Vaccination with a synthetic peptide from the influenza virus hemagglutinin provides protection against distinct viral subtypes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18979-18984 (2010).</li>
<li>Impagliazzo, A., Milder, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stable+trimeric+influenza+hemagglutinin+stem+as+a+broadly+protective+immunogen%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A stable trimeric influenza hemagglutinin stem as a broadly protective immunogen.</a> Science. 349 (6254), 1301-1306 (2015).</li>
<li>Krammer, F., Palese, P., Steel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+Universal+Influenza+Virus+Vaccine+Design+and+Antibody+Mediated+Therapies+Based+on+Conserved+Regions+of+the+Hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Advances in Universal Influenza Virus Vaccine Design and Antibody Mediated Therapies Based on Conserved Regions of the Hemagglutinin.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. , (2014).</li>
<li>Wohlbold, T. J., Nachbagauer, R., Margine, I., Tan, G. S., Hirsh, A., Krammer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccination+with+soluble+headless+hemagglutinin+protects+mice+from+challenge+with+divergent+influenza+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Vaccination with soluble headless hemagglutinin protects mice from challenge with divergent influenza viruses.</a> Vaccine. 33 (29), 3314-3321 (2015).</li>
<li>Ekiert, D. C., Bhabha, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+recognition+of+a+highly+conserved+influenza+virus+epitope%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope.</a> Science. 324 (5924), 246-251 (2009).</li>
<li>Ekiert, D. C., Friesen, R. H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Highly+Conserved+Neutralizing+Epitope+on+Group+2+Influenza+A+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Highly Conserved Neutralizing Epitope on Group 2 Influenza A Viruses.</a> Science. 333 (6044), 843-850 (2011).</li>
<li>Dreyfus, C., Laursen, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Conserved+Protective+Epitopes+on+Influenza+B+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Highly Conserved Protective Epitopes on Influenza B Viruses.</a> Science. 337 (6100), 1343-1348 (2012).</li>
<li>Tran, E. E. H., Podolsky, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+Microscopy+Structures+of+Chimeric+Hemagglutinin+Displayed+on+a+Universal+Influenza+Vaccine+Candidate%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron Microscopy Structures of Chimeric Hemagglutinin Displayed on a Universal Influenza Vaccine Candidate.</a> mBio. 7 (2), e00257(2016).</li>
<li>Wiley, D. C., Wilson, I. A., Skehel, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+identification+of+the+antibody-binding+sites+of+Hong+Kong+influenza+haemagglutinin+and+their+involvement+in+antigenic+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural identification of the antibody-binding sites of Hong Kong influenza haemagglutinin and their involvement in antigenic variation.</a> Nature. 289 (5796), 373-378 (1981).</li>
<li>Gerhard, W., Yewdell, J., Frankel, M. E., Webster, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigenic+structure+of+influenza+virus+haemagglutinin+defined+by+hybridoma+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Antigenic structure of influenza virus haemagglutinin defined by hybridoma antibodies.</a> Nature. 290 (5808), 713-717 (1981).</li>
<li>Jackson, D. C., Murray, J. M., White, D. O., Gerhard, W. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+of+antigenic+sites+of+influenza+virus+hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Enumeration of antigenic sites of influenza virus hemagglutinin.</a> Infect Immun. 37 (3), 912-918 (1982).</li>
<li>Matsuzaki, Y., Sugawara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope+Mapping+of+the+Hemagglutinin+Molecule+of+A%2F%28H1N1%29pdm09+Influenza+Virus+by+Using+Monoclonal+Antibody+Escape+Mutants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Epitope Mapping of the Hemagglutinin Molecule of A/(H1N1)pdm09 Influenza Virus by Using Monoclonal Antibody Escape Mutants.</a> J Virol. 88 (21), 12364-12373 (2014).</li>
<li>Tan, G. S., Krammer, F., Eggink, D., Kongchanagul, A., Moran, T. M., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pan-H1+anti-hemagglutinin+monoclonal+antibody+with+potent+broad-spectrum+efficacy+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A pan-H1 anti-hemagglutinin monoclonal antibody with potent broad-spectrum efficacy in vivo.</a> J Virol. 86 (11), 6179-6188 (2012).</li>
<li>Geneva: World Health Organization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22WHO+manual+on+animal+influenza+diagnosis+and+surveillance%22">WHO manual on animal influenza diagnosis and surveillance</a>. , (2002).</li>
<li>Brauer, R., Chen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+Virus+Propagation+in+Embryonated+Chicken+Eggs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs.</a> J Vis Exp. (97), e52421(2015).</li>
<li>Martínez-Sobrido, L., García-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Recombinant+Influenza+Virus+from+Plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA.</a> J Vis Exp. (42), e2057(2010).</li>
<li>Hoffmann, E., Stech, J., Guan, Y., Webster, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+primer+set+for+the+full-length+amplification+of+all+influenza+A+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22ArchVirol%22%5BJournal%5D)">Universal primer set for the full-length amplification of all influenza A viruses.</a> ArchVirol. 146 (12), 2275-2289 (2001).</li>
<li>Zhou, B., Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+Influenza+B+Virus+Genomic+Amplification+Facilitates+Sequencing%2C+Diagnostics%2C+and+Reverse+Genetics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Universal Influenza B Virus Genomic Amplification Facilitates Sequencing, Diagnostics, and Reverse Genetics.</a> J Clin Microbiol. 52 (5), 1330-1337 (2014).</li>
<li>Sidhu, S. S., Kossiakoff, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+and+designing+protein+function+with+restricted+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Exploring and designing protein function with restricted diversity.</a> Curr Opin Chem Biol. 11, 347-354 (2007).</li>
<li>Chen, C. -W., Chang, C. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+Scanning-assisted+Identification+of+a+Monoclonal+Antibody-recognized+Linear+B-cell+Epitope%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope.</a> J Vis Exp. (121), e55417(2017).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir çıkar çatışmaları bildirin.

Kaçış mutantların tespit artıkları çoğunluğu doğru olmasına rağmen bu yaklaşım önemli uyarılar nokta mutasyonlar kaçış versiyonlarının mutlaka moleküler ayak izi tarafından belirlenen antikor içinde eşleşmeyebilir ki biridir yapısal analiz. Bu konformasyon değişikliğine mutasyona uğramış kalıntı, allosteric efekti benzer konuma distal yeteneğini bir mutasyon belirli bir kalıntı, kaynaklanmaktadır. Bu yöntem yalnızca antikorları nötralize için uygulanabilir olduğunu başka bir kısıtlamadır; vitro seçici basınç eksikliği antikorlar mutantlar kaçmak için yol değil. Ancak, bu sınırlama bir panel tarafından daha önce karakterize nötralize antikorlar oluşturulan kaçış versiyonlarının kullanımı ile aşılabilir. Tan vd. H7N9 virüsü nötralize mAb bir kaçış türevi bir sigara nötralize antikor7epitope eşleştirmek için kullanılır.
Yine de, kaçış türevleri üretimi aracılığıyla antikorlar epitopları elucidating kristalografisi ve cryo-elektron mikroskobu, ikisi de ekipman geniş bir yatırım gerektiren bir alternatif sağlar. Alanin tarama veya peptid tarama/kesme mutantlar kullanarak mAbs en az bağlama bölgesinin belirlemek için diğer alternatifleri vardır. Mutagenesis tarama alanin peptid tarama doğrusal epitopları30ile sınırlı ise29, eleme sırasında çok sayıda değişik oluşturma çalışmalarında önemli miktarda gerektirebilir. Bu protokol için açıklanan yöntem hiçbir özel ekipman veya tekniği gerektirir ve hatta kaçış değişik-in ilgi antikorlar oluşturmak için değişikliğin varolan vitro nötralizasyon deneyleri kullanır.
İletişim kuralı için birden çok pasajlar (örneğin, SAP özel antikorlar) gerektiren üreten kaçış değişik yüksek antikor pasajda 0 başlangıç konsantrasyonu bağlıdır. Dikkatli yan tarafındaki err ve yarım günlük yarım maksimal inhibitör konsantrasyonu bir antikor düşük bir günlüğüne başında ve güçlü virüs büyümesi için izin vermek iyidir. Araştırmacı yüksek titresi virüs kültür düşük immünolojik basıncı varlığında viral topluluk içinde büyük bir genetik varyasyon olacak spekülasyon olabilir. Kaçış türevleri için aşağıdaki pasajlar antikor konsantrasyon yavaş yavaş artırarak seçilebilir. Önceki geçiş antikor konsantrasyon aynı miktarda koruyarak virüs büyüme azaltır olay bu viral süpernatant miktarı sonraki pasajda artırılabilir.
Evrensel grip aşıları çoğunluğu HA sapı bölgenin doğru sağlam antikor yanıtı temin için amaçtır. SAP özel antikorlar için kaçış versiyonlarının grip virüsü fitness ve immünolojik basıncı arasındaki ilişki tanımlamada önemli analizlerdir. İlginçtir, kaçış mutasyona uğramış virüs sapı özgü mAbs kaynaklanan tüm zayıflatılmış vivo içinde fare LD50 çalışmaları4' te edildi. Bu çalışmalar güçlü bir durumda aşı sapı tabanlı platformlar için sağlar. Ayrıca, bu protokol küçük molekül inhibitörleri gibi anti-yayılmacı diğer bileşikler için kaçış mutantların tanımlamak için kullanılabilir. Son olarak, bu metodoloji grip virüsü yüzey glikoproteinlerin için sınırlı değil, ama aynı zamanda daha çok diğer viral glikoproteinlerin epitopları belirlemek için uygulanabilir.

Benzer şekilde diğer RNA virüsleri, grip A virüs antijenik türevleri çok sayıda her yuvarlak çoğaltma1,2,3nesil için izin veren bir hataya polimeraz sahip. Bir virüs grip uyum ve ile antikor bağlama kaybına neden mutasyonlar yüzey glikoproteinlerin üzerinde bir birikimi yoluyla elde antijenik drift insan bağışıklık yanıtı kaçmasına hayret verici bir yeteneği var. Viral yüzey glikoproteinlerin, HA ve neuraminidase (NA), antijenik sürüklenme gerek reformulate ve aşı her yıl yönetmek gerektirir.
Teknolojik gelişmeler yalıtım ve antijen spesifik antikorların üretimi aşı indüklenen mAbs4,5,6,7,8sayısının yüksek vermiştir. Buna karşılık, geniş grip A virüsleri nötralize mAbs epitopları karakterizasyonu birkaç evrensel grip aşısı adayların9,10,11gelişimi büyük ölçüde destekli, 12,13,14. Antijenik ayak izi bir mAb elucidating nötralizasyon yapısal belirleyicileri ortaya çıkarır ve aşı tasarım bilinçli bir yaklaşım sağlar. Ancak, gerçekçi de yapısal olarak viral antijen15, epitopları eşlemek için mAbs x-ışını kristalografisi veya cryo-elektron mikroskobu aracılığıyla geniş panelleri ayırdetmek laboratuarlar için maliyet-etkin olmadığı 16 , 17 , 18.
X-ışını kristalografisi veya cryo-elektron mikroskobu pahalı donanımları, özel teknikler ve potansiyel olarak geniş bir veri oluşturmak için gereken saat miktarını gerektirir. Alternatif ve daha hızlı bir yaklaşım hataya RNA'ya bağımlı üzerinden çeşitli viral nüfus hızlı nesil kullanan RNA polimeraz epitopları mAbs19,20, belirlemek için kaçış mutantların oluşturmak için 21,22,23. Kaçış türevleri üretimi herhangi bir özel ekipman veya teknik gerektirmez ve geleneksel laboratuvar Kimyasalları ve ekipmanları ile gerçekleştirilebilir.
Burada, grip HA tanımak mAb bağlama için gerekli kritik artıkları eşleme için izin veren bir yöntem açıklanmaktadır.

<table><tbody><tr><td>Falcon 96 kuyulu şeffaf düz tabanlı TC ile muamele edilmiş kültür mikroplakası, Kapaklı</td><td>Corning, Inc.</td><td>353072</td><td>Mikronötralizasyon testi için test plakası kullanımı</td></tr><tr><td>Falcon 96 kuyulu şeffaf V-alt plaka</td><td>Corning, Inc.</td><td>353263</td><td>Hemaglutinasyon inhibisyon testi için test plakası kullanımı</td></tr><tr><td>1X Minimal Esansiyel Orta (MEM)</td> <td>Gibco</td><td>11095080</td><td>Enfeksiyon ortamı</td></tr><tr><td>Tosil fenilalanil klorometil (TPCK) ile muamele edilen tripsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8802</td>, <td>olgunlaşmamış HA < alt > < > HA <1 / sub > ve HA 2 </td></tr> <tr><td>biyotinile anti-NP primer antikoruna (IAV)</td> <td>ayırırEMD Millipore</td><td>MAB8258B</td><td>İnfluenza A virüslerinin NP proteinini tanıyan bir antikor</td></tr>: <tr><td>Biyotinillenmiş anti-NP birincil antikoru (IBV)</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB8260B-5</td>: <td>İnfluenza B virüslerinin NP proteinini tanıyan bir antikor</td></tr>: <tr><td>Streptavidin-HRP antikoru</td><td>EMD Millipore</td><td>18-152</td><td>Bu, biyotinile edilmiş anti-NP antikoru</td></tr><tr><td>HRP substratı (SIGMAFAST-OPD) için ikincil bir antikor olarak kullanılır.</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9187-5SET</td><td>o-fenilendiamin dihidroklorür HRP</td></tr><tr><td>96 kuyulu V-alt plaka</td> için suda çözünür substrat <td>Hemaglutinasyon testi için kullanılan</td><td>Nunc</td><td>249662</td> Test plakası</tr><tr><td>Tavuk kırmızı kan hücreleri</td><td>Lampire Biyolojik Laboratuvarları</td><td>7201403</td><td>İnfluenza virüsünün</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Ambion</td><td>15596026</td> <td>aglütine etme yeteneğini değerlendirmek için kullanılırRNA</td></tr><tr><td>Superscript III'ün</td> Ekstraksiyonu <td>İnvitrojen</td><td>12574018</td><td>Ters transkriptaz</td></tr><tr><td>Jel Ekstraksiyon Kiti</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Amplifiye edilmiş PCR ürününün izolasyonu</td></tr><tr><td>Lipofektamin 2000</td><td>İnvitrojen</td><td>11668027</td><td>Transfeksiyon reaktifi</td></tr><tr><td>Anti-insan IgG (H + L) Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11013</td><td>İnsan için floresan ikincil antikor antikorlar</td></tr><tr><td>Anti-fare IgG (H + L) Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11001</td><td>Murin antikorları için floresan ikincil antikor</td></tr><tr><td>6 kuyulu polistiren mikroplaka</td><td>Corning, Inc.</td><td></td><td></td>353934</tr><tr><td>UltraPure Agaroz</td><td>Invitrogen</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene uzun süreli depolama Cryo-tüpleri</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>5012-0020</td><td>Viral kültür süpernatant</td></tr><tr><td>reassortant A/California/04/09 (H1)</td><td>Palese Laboratuvarı</td><td></td><td>reassortant virüsünün dondurulması A/California/04/09 (H1N1) ile A/Porto Riko/8/34 (H1N1) iç segmentleri ile A/California/04/09 (H1N1) HA ve NA'yı eksprese eder</td></tr><tr><td>reassortant A/Şangay/1/13 (H7)</td><td>A</td><td></td><td>/Şangay/1/13'ün (H7N9) HA ve NA'sını A/Porto Riko/8/34 (H1N1)</td></tr><tr><td>Sığır serum albümin çözeltisi (%35)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7979</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen jel ekstraksiyon kiti</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>DNA fragmanlarının silika membran bazlı saflaştırılması</td></tr></tbody></table>

grip virüsü monoklonal antikorları nötralize kaçış türevleri üretimi

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Grip virüsleri uyum ve konak immün yanıt kaçmasına görmeyeteneği sergi. Virüsü yüzey glikoproteinlerin üzerinde antijenik yapılan değişiklikler aracılığıyla bir yoludur. Kaçış türevleri üretimi nasıl virüs bağışıklık algılama kaçış elucidating ve antikor bağlama için gerekli kritik artıkları belirlenmesinde güçlü bir yöntemdir. Burada, bir protokol nasıl grip A virüs kaçış türevleri viral hemagglutinin (HA) karşı yönettiği insan veya fare monoklonal antikorlar (mAbs) kullanarak oluşturmak açıklar. Bizim tekniğin kullanımı ile daha önce iki kafa veya roman kuş H7N9 HA SAP hedefleme antikorlar bağlama için gerekli kritik artıkları ile karakterizedir. İletişim kuralı diğer virüs sistemleri için kolayca adapte edilebilir. Analizleri kaçış versiyonlarının antijenik drift tek nükleotid polimorfizmleri (SNPs) conferring direnci ve virüs sağlık, belirlerken, modelleme ve aşılar ve/veya tedavi tasarımı önemlidir.

Biz daha önce kaçış türevleri için insan ve fare mAbs mevsimsel grip virüsü aşısı, H7N9 aşı veya sıralı DNA/rekombinant HA protein aşı4,5 tarafından indüklenen oluşturmak için bu yöntemi varyasyonları kullandık ,6,7. Yukarıda açıklandığı gibi antikorlar ilk bize sonraki4,5ile devam etmek için belirli hangi protokolü hakkında bilgilendirmek için HI ve microneutralization deneyleri kullanarak karakterize. Antikorlar 07-5D 03, 07-5F01, 07-5G 01, 07-4B03, 07-4E02 ve 07-4D 05 HI ve nötralizasyon kuş H7N9 virüs (A/Shanghai/1/2013) (Tablo 1) karşı olan bulunmuştur ve böylece Protokolü 1 (Adım 2.1) kullanılmıştır. MAbs etkisiz hale güvenmiyorlarsa 41-5E04, 045-051310-2B06, 042-100809-2F04 ve S6-B01 (Tablo 1), gibi HI aktivite ile Protokolü 2 (Adım 2.2) kaçış türevlerini oluşturmak için kullanılmıştır. Kaçış mutant eşleme antikorlar birçoğu viral HA4,5 (şekil 4) farklı yerlerde kritik artıkları tanımak ortaya koydu. Var HI-pozitif antikorlar çoğunluğu kaçış iken, H7 HA daha önce raporlanmış antijenik sitelere yakın mutant artıkları, HI-negatif antikorlar sapı bölge4' te,5 kaçış mutantların nokta mutasyonları ile oluşturulan .
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antikor</td>
			<td>Merhaba etkinliği</td>
			<td>NEUT aktivite</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07-5D 03</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07-5F01</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07-5G 01</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07-4B03</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07-4E02</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07-4D 05</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>41-5E04</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>045-051310-2B06</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>042-100809-2F04</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S6-B01</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 1: Antikor HI ve nötralizasyon etkinlik tablosunun. On H7 özel mAbs ile deneysel bir H7N9 aşı aşı bireyler izole farklı vitro antiviral faaliyetleri5sergi.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="4">İleri astar (5'-3')</td>
			<td colspan="4">Astar (5'-3') ters</td>
			<td colspan="2">Thermocylcer koşulları</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAV</td>
			<td colspan="4">TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGG</td>
			<td colspan="4">ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT</td>
			<td colspan="2">60 dk 42 ºC, 94 ° C'nin 2 dk/5 döngüsü için 20 94 ° C'nin s, 30 50 ºC s ve 3 dk 30 sn için 68 ° C'nin 40 devredir 20 94 ºC takiben s, 30 58 ° C'nin s ve 3 dk 30 sn ile 68 ºC 10 min için bir son uzantısı saat için 68 ºC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBV</td>
			<td colspan="4">GGGGGGAGCAGAAGCAGAGC</td>
			<td colspan="4">CCGGGTTATTAGTAGTAACAAGAGC</td>
			<td colspan="2">60 dk, 30 dk 55 ºC, 94 ° C'nin 2 dk/5 döngüsü için 20 94 ° C'nin 45 ºC s, 30 40 ºC 40 devredir 20 94 ºC tarafından takip için 3 dk 30 sn, 68 ºC ve s s , 30 58 ° C'nin s ve 3 dk 30 sn ile 68 ºC 10 min için bir son uzantısı saat için 68 ºC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 2: evrensel grip virüsü astar. Grip A27 ve B28 virüsleri ve onların anılan sıraya göre thermocycler koşulları astar çift HA kesimleri amplifikasyon için.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56067/56067fig1.jpg"> 
Şekil 1: HI tahlil. (A) A şematik bir HI tahlil kurmak iki fare H1 özgü mAbs 7B2 (kafa özgü) ve 6F12 (SAP-özel bir 96-şey V-alt plaka ve (B) bir HI tahlil23sonuçlarını örneği kullanarak) etkinliğini test etmek için. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56067/56067fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56067/56067fig2.jpg"> 
Resim 2: Microneutralization tahlil. İki insan mAbs 4 d 055 ve CR911417etkinliğini test etmek bir microneutralization tahlil ayarlamak için bir şema. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56067/56067fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56067/56067fig3.jpg"> 
Şekil 3: üretimi kaçış mutantların. Önerilen metodoloji HI ve antikor tarafından sergilenen microneutralization aktivite bağımlı olacaktır. (B) nötralize HI-negatif antikor antikor miktarlarda artan ile birden çok pasajlar içerebilir(a)karşı kaçış mutantların üretimi nötralize HI-pozitif antikorlar yumurta, tek bir pasajda gerektirir hücre doku kültürü. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56067/56067fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56067/56067fig4.jpg"> 
Şekil 4: bir epitope Haritası roman kuş H7N9 kaçış mutant türevleri ile oluşturulan HA örneği. Aşı indüklenen antikorlar H7N9 grip aşı kaçış mutant varyantlarını oluşturmak için kullanılan bir aday ile aşı bireyler izole. Her kalıntı kırmızı temsil kritik amino asitler bir mAb verimli bağlama için gerekli konumunu belirtti. Veri Dunand-Henry ve ark., 20154adapte edildi. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56067/56067fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Biz bir yöntem tarafından grip A virüs viral hemagglutinin hedef insan veya fare monoklonal antikorlar bağlama için gerekli kritik artıkları tanımlamak açıklar. İletişim kuralı diğer virüs yüzey glikoproteinlerin ve onların karşılık gelen nötralize antikorlar için adapte edilebilir.

Grip virüsü monoklonal antikorları nötralize kaçış türevleri üretimi

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

Bu yöntemin genel amacı, nötralize edici bir monoklonal antikorun epitopunun nasıl aydınlatılacağına dair çalışan bir protokol sağlamaktır. Bu yöntem, konakçı-virüs etkileşimlerini tanımlamaya, terapötikler ve tanı araçları geliştirmeye yardımcı olabilecek ve tüm bunlar aşı tasarımına katkı sağlayacak olan immünoloji ve viroloji alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, özel aletler veya ekipmanlar gerektirmeden temel doku kültürü ve moleküler biyoloji teknikleriyle uygulanabilmesidir.Prosedürü, Peter Palese'nin laboratuvarından MD, PhD öğrencisi Mark Bailey uygulamaktadır. Bu prosedüre, metin protokolünde açıklandığı üzere hemaglütinasyon inhibisyonu (HI) ve nötralizasyon aktivitelerine dayalı antikor karakterizasyonu ile başlayın. HI aktivitesi gösteren nötralize edici antikorlar, öncelikle ilgili antikorun artan konsantrasyonlarda dört dilüsyonunun, dilüsyon başına 100 microliter hacimde bir katlı PBS içinde hazırlanmasıyla daha ileri düzeyde analiz edilir.Ardından, 400 µL hacminde 1x PBS içerisinde, mililitrede bir milyon plak oluşturan birim içeren bir virüs stoğu hazırlayın. Daha sonra, mililitrede bir milyon plak oluşturan birim içeren virüsten 100 µL'yi, her bir antikor dilüsyonundan 100 µL veya 100 µL 1x PBS ile karıştırın. Örnekleri %5 CO₂ içeren 37 °C'lik bir inkübatörde bir saat boyunca inkübe edin.Kısaca vortekslendikten sonra, her bir karışımın 200 µL'sini patojen içermeyen spesifik embriyonalı tavuk yumurtalarına enjekte edin. Ardından, yumurtaları karbondioksit olmadan 37 °C'de 40 ila 44 saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, virüs enfekte embriyonalı yumurtaları en az altı saat boyunca 4 °C'ye yerleştirerek sakrifiye edin.Ardından, daha önce açıklandığı şekilde yumurtalardan allantoik sıvıyı hasat edin. Son olarak, metin protokolünde belirtildiği üzere HI testi uygulayarak kaçış varyantlarını doğrulayın. HI aktivitesi göstermeyen nötralize edici antikorlara karşı kaçış varyantları oluşturmak için virüs, artan miktarlarda antikor varlığında pasajlanmalıdır.MDCK hücrelerini altı kuyucuklu bir plakaya, her kuyucukta bir milyon hücre olacak yoğunlukta ekleyin. Hücreleri, %5 karbon dioksit içeren 37 °C'lik bir inkübatörde en az dört saat boyunca inkübe edin. Bu sırada, virüs stokunu mililitre başına bir milyon plak oluşum birimi olacak şekilde seyreltin.250 µL hacmindeki TPCK ile işlenmiş tripsin içeren bir kez MEM içinde, 0,02 mg/mL konsantrasyonunda tek bir antikor dilüsyonu hazırlayın. Sonraki tüm pasajlar için daha yüksek antikor konsantrasyonları kullanın. 250 µL dilüe edilmiş virüsü, 250 µL dilüe edilmiş antikor ile veya antikor içermeyen kontrol olarak 250 µL bir kez MEM ile karıştırın.Virüs antikor karışımını, %5 karbon dioksit içeren 37 °C'lik bir inkübatörde 30 dakika inkübe edin. Hücrelerin inkübasyonunun ardından, medyumu cam bir Pasteur pipeti kullanarak aspire edin ve hücre monotabanını 1 mL 1x PBS ile yıkayın. Karışımlardan 500 µL'yi kuyucuklara ekleyin ve %5 karbon dioksit içeren 37 °C'lik bir inkübatörde bir saat boyunca inkübe edin.Bir saat sonra, kuyucuklara TPCK ile işlem görmüş tripsin içeren iki mililitre 1x MEM ekleyin. Enfeksiyondan 48 saat sonra, mikroskop altında sitopatik etki (CPE) belirtileri için hücreleri kontrol edin veya viral büyümeyi tespit etmek için bir hemaglütinasyon testi yapın. Antikor eklenen kültürde CPE büyümesi varsa, süpernatantı birden fazla kriyotüpe toplayın.Tüpleri pasaj numarasıyla etiketleyin ve -80 °C'de saklayın. TPCK tripsin ve antikor ile desteklenmiş 2 mL 1x MEM kullanılarak taze bir MDCK monokatmanını enfekte etmek için süpernatandan 100 µL ayırın. Her pasaj için antikor içermeyen bir kontrol eklemeyi unutmayın.Antikor konsantrasyonunu, final konsantrasyonu 0,6 mg/mL antikor olduğunda bile virüs büyümesi hala mümkün olana kadar her ardışık pasajda artırın. Her pasajın süpernatantından alınan çok sayıda viyali dondurun ve -80 °C'de saklayın. Metin protokolünde detaylandırıldığı üzere kaçan varyantların izolasyonu ve analizlerine geçin.Aday H7N9 influenza A aşısı ile aşılanmış bireylerden izole edilen aşı kaynaklı antikorlar, kaçış mutant varyantlarını oluşturmak için kullanılmıştır. Kaçış mutant haritalaması, antikorların çoğunun viral HA üzerindeki farklı konumlarda kritik kalıntıları tanıdığını ortaya koymuştur. Kırmızı ile belirtilen her kalıntı, bir monoklonal antikorun etkin bağlanması için gerekli olan kritik amino asitlerin konumunu temsil ederken, HI-pozitif antikorların çoğunluğunun kaçış mutant kalıntıları, H7HA'nın daha önce rapor edilen antijenik bölgelerinin yakınındadır. HI-negatif antikorlar ise stok bölgesinde nokta mutasyonlarına sahip kaçış mutantları oluşturmuştur.Bu teknik bir kez kavrandığında, diğer patojenlere karşı korumanın yapısal belirleyicilerini aydınlatmak için uygulanabilir. Bu teknik sadece monoklonal antikorların kaçış varyantlarını üretmekle sınırlı olmayıp, antiviral bileşiklere karşı da uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, in vitro ortamda kaçış varyantları üreterek monoklonal antikorların bağlanma epitopunun nasıl aydınlatılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Bu prosedürü uygularken, virüslerle çalışırken dikkatli olmanın ve uygun kişisel koruyucu ekipman kullanmanın önemli olduğunu unutmamak gerekir.

generation-escape-variants-neutralizing-influenza-virus-monoclonal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu video, influenza virüsü monoklonal antikorlarını nötralize etmek için kaçış varyantları oluşturmak için bir tekniği göstermektedir. Antikor ile nötralize edilmiş virüs süspansiyonu, kaçış varyantlarını seçici olarak çoğaltmak için embriyonlu tavuk yumurtalarına enjekte edilir. Bu, bir Hemaglutinasyon testi ile doğrulanan, ağırlıklı olarak kaçış varyantlarından oluşan bir virüs popülasyonu ile sonuçlanır.

Nötralize Edici Antikorlara Karşı İnfluenza Virüsü Kaçış Varyantlarının Üretilmesi

Video, soğuğa uyarlanmış rekombinant influenza virüsleri oluşturmak için bir yöntem gösteriyor. İnsan hücrelerinin çift yönlü plazmitlerle transfekte edilmesini, ardından daha sıcak koşullarda azaltılmış replikasyon ile karakterize edilen aşı üretimine uygun virüsler elde etmek için daha düşük sıcaklıkta inkübasyonun inkübasyonunu içerir.

Aşılar için Rekombinant Canlı Zayıflatılmış İnfluenza Virüslerinin Üretilmesi

Klonlanmış cDNAs, gibi genetik tersine adlandırılan bir yaklaşım, gelen rekombinant arenaviruses kurtarma araştırmacılar arenavirus biyolojisi birçok farklı yönlerine, spesifik viral gen ürünlerinin rolü, hem de onların farklı özel etki ve kalıntılarının katkısını araştırmak için izin verir . Benzer şekilde, insan patojen arenaviruses mücadele etmek için etkili ve güvenli aşıların üretimi için yeni olanaklar sağlar aşı geliştirilmesi için FDA onaylı hücre çizgileri (Vero) bölgesindeki genetik...

FDA onaylı Vero hücrelerinde Aşı Geliştirme için bir araya getiren Arenavirus üretimi

Burada böcek hücrelerinde yeni Çin H7N9 virüsünden türetilen doğru katlanmış ve işlevsel bir influenza virüsü yüzey antijenlerini eksprese etmek için bir yol tarif eder. Bu teknik, bir viral veya hücre yüzey proteinlerinin ektoalanlarının ifade etmek için uyarlanabilir.

Bakülovirüs İfade Sistemi ile Novel H7N9 influenza virüs hemaglutinin Fonksiyonel rekombinant ve Neuraminidase Proteinlerin İfadesi

Hidoma teknolojisine dayalı monoklonal antikorların üretilmesi için optimize edilmiş bir protokol sunulmuştur. Fareler bir immünokonjugat ile aşılandı. Dalak hücreleri, PEG ve ölümsüz miyelom hücreleri ile bir elektrik darbesi ile kaynaştırıldı. Antikor üreten hibridoma hücreleri HAT ve antijene özgü ELISA taraması ile seçildi.

Hibridoma teknolojisi ile murin monoklonal antikorlar üretilmesi

Bu çalışma, bir açıklar   görüntüleme bazlı mikro-nötralizasyon deneyi virüsler arasında antijenik ilişkileri analiz etmek. protokol düz yataklı tarayıcı kullanır ve titrasyon, titrasyon kantitatif, nötralizasyon ve nötralizasyon kantitatif olmak üzere dört adım vardır. Tahlil akımı dolaşan grip A (H1N1) pdm09, A (H3N2) ve B virüsleri ile iyi çalışır.

Bir Kantitatif Mikro-nötralizasyon Testi optimizasyonu

Fc-aracılı efektör fonksiyonları aktivasyonu antikorlar tarafından hedefleyen grip virüsü hemagglutinin ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu tahlil de Fc-aracılı bağışıklık ikna etmek için monoklonal antikorlar veya poliklonal sera diğer viral yüzey glikoproteinlerin hedefleme yeteneklerini değerlendirmek için adapte edilebilir.

Grip Hemagglutinin özel antikorlar tarafından indüklenen Fc-aracılı efektör fonksiyonları değerlendirmek için bir yöntem

Grip nötralize antikorlar grip enfeksiyonlar korunması ile aralarındaki ilişkileri belirlemektir. Microneutralization deneyleri insan sera nötralize antikor ölçmek ve sık sık grip insan seroloji için kullanılır. Biz bir microneutralization tahlil nötralize antikor titreleri çağdaş 3C.2a ve 3C.3a A(H3N2) virüs grip aşısı ya da enfeksiyon takip için ölçmek için MDCK-SIAT1 hücreleri kullanarak açıklar.

MDCK-SIAT1 hücreleri kullanarak antikor yanıt için Microneutralization tarafından insan Sera A(H3N2) virüsleri nötralize grip ölçme deneyi

Bu çalışmada açıklar yüksek işlem hacmi, nötralize antikorlar respiratuvar sinsityal virüs (RSV) için belirli titresi belirlemek için görüntüleme tabanlı mikro-nötralizasyon tahlil. Bu tahlil biçimi farklı örnek türleri üzerinde test edilmiştir.

Bir geliştirilmiş ve yüksek üretilen iş respiratuvar sinsityal virüs (RSV) mikro-nötralizasyon tahlil

Bu protokol, iki influenza A suşlarından zarf glikoproteinleri ile yüksek titreyen enfeksiyöz viral psödotipli parçacıklar (pp) üretmek için deneysel bir süreci ve bunların enfekteliğini nasıl belirleyeceklerini açıklamaktadır. Bu protokol, farklı zarf glikoproteinleri ile zarflı virüslerin herhangi bir tür pps geliştirmek için son derece uyarlanabilir.

Yüksek Patojenik H5N1 ve Kuş H7N9 Virüslerinden Zarf Glikoproteinleri Ile Yüksek Titer Enfeksiyöz İnfluenza Pseudotyped Partiküllerin Üretimi

Bu protokol, SARS-CoV-2 varyantlarının enfektivitesinin ve nötralize edici antikorlara duyarlılıklarının hızlı bir şekilde ölçülmesi için bir platform olarak yeni bir hibrit alfavirüs-SARS-CoV-2 psödovirüsünün (Ha-CoV-2) uygulanmasını açıklar.

SARS-CoV-2 Varyantlarının Hızlı Miktar Tayini ve Nötralize Edici Antikorlar için Ha-CoV-2 Psödovirüsünün Uygulanması

Öğrenin, grip virüsü hemaglutininine karşı nötralize edici monoklonal antikorların bağlanma epitoplarını belirlemek için kaçış türevleri üretme yöntemini. Bu teknik, aşı tasarımına ve viral direnç mekanizmalarının anlaşılmasına katkı sağlar.

Grip virüsü monoklonal antikorları nötralize kaçış türevleri üretimi

Daha fazla video keşfet