Nitrosamide oluşumu nitrozaminler sitokrom P450s tarafından in Vitro metabolizma saptamak için bir genel yöntem

Bu metodolojinin genel amacı, Sitokrom P450'lerin n nitrozaminleri in vitro olarak n nitosamidlere işlemsel olarak oksitleyip oksitleyemeyeceğini belirlemektir. Bu yöntem, nitozaminlerin doğrudan nitrosamidlere metabolize olup olmadığını değerlendirerek toksikoloji alanına fayda sağlar. Nitrozamidler alkilat DNA'da nispeten stabil olduklarından, karsinogenezde rol oynayabilirler.

Bu tekniğin ana avantajı, benzer in vitro nitrozamin metabolizma deneyleri için daha önce elde edilenden daha düşük algılama limitleri veren oldukça hassas bir kütle spektrometresinin kullanılmasıdır. Bu işleme başlamak için, manyetik bir karıştırma çubuğu içeren 25 mililitrelik yuvarlak tabanlı bir şişeyi bir fırına yerleştirin. 140 santigrat derecede 16 saat kurutun.

Bundan sonra, şişeyi bir davlumbaza aktarın ve bir nitrojen gazı akışı altında soğutun. Şişeye 31.8 miligram norkotinin, beş mililitre asetik anhidrit ve bir mililitre asetik asit ekleyin ve karıştırmaya başlayın. Şişeyi bir buzlu su banyosuna aktarın.

33.3 miligram sodyum nitrit ekleyin. 2,5 saat karıştırmaya devam edin, ardından reaksiyonu söndürmek için reaksiyonu 18 mililitre buz gibi soğuk suya dökün. Çözeltiyi hemen 18 mililitre DCM içeren bir ayırma hunisine aktarın ve sulu çözeltiyi çıkarın.

Her seferinde 9 mililitre DCM kullanarak sulu tabakayı iki kez daha çıkarın. Daha sonra, havuzlanmış organikleri 100 miligram magnezyum sülfat üzerinde iki dakika kurutun. Filtrelemeden sonra, ham sarı bir yağ elde etmek için çözeltiyi 30 santigrat derecede konsantre etmek için döner bir buharlaştırıcı kullanın.

Ham bileşiği, metin protokolünde belirtildiği gibi kolon kromatografisini kullanarak saflaştırın. Bundan sonra, saf bileşiği bir mililitre döteryumlu kloroform içinde çözün. NMR'yi kullanarak, metin protokolünde belirtildiği gibi çözeltinin yapısını ve molaritesini onaylayın.

Bu çözeltiyi karanlıkta, ihtiyaç duyulana kadar iki ila sekiz santigrat derece arasında bir sıcaklıkta saklayın. Daha sonra doğru ana kütleyi onaylayın ve metin protokolünde belirtildiği gibi yüksek çözünürlüklü bir kütle spektrometresi üzerinde doğrudan infüzyon yoluyla saf NNC çözeltisinin ürün iyon kütlelerini belirleyin. Başlamak için, ihtiyaç reaktiflerini 80 santigrat derecelik bir dondurucudan çıkarın ve buz üzerinde çözdürün.

Bir çözüldü, bir mililitrelik bir tüpte NADPH rejenerasyon sistemi 1-10 ve 1-50'deki Bakülozomları seyreltmek için 0.5 kuvvetli bir reaksiyon tamponu kullanın. Daha sonra, 97 mikrolitre 0.5 mukavemetli reaksiyon tamponu içeren bir mililitrelik bir tüpe üç mikrolitre NADP stok çözeltisi ekleyin. Her inkübasyon için, reaksiyon tamponu ile yapılan dört mikromolar NNN çözeltisinden 40 mikrolitre ekleyerek bir mililitrelik bir tüp hazırlayın.

Her tüpe beş pikomol P450 2A6 içeren 50 mikrolitre enzim çözeltisi ekleyin. İki dakika boyunca 37 derecede bir su banyosunda önceden inkübe edin. Daha sonra her tüpe 10 mikrolitre seyreltilmiş NADP + çözeltisi ekleyin.

37 santigrat derecede bir ila 30 dakika arasında inkübe edin. Bundan sonra, önce 10 mikrolitre 3.0 normal çinko sülfat ekleyin ve ardından reaksiyonu söndürmek için 10 mikrolitre 3.0 normal baryum hidroksit ekleyin. Beyaz bir çökelti oluşturmak için çözeltiyi girdaplayın.

Daha sonra, dört dakika boyunca sekiz bin Gs'de santrifüjleyin. Süpernatanı hemen toplayın ve sıvı kromatografisi, pozitif nanoelektrosprey iyonizasyonu, yüksek çözünürlüklü tandem kütle spektrometresi ile iki mikrolitreyi analiz edin. Bu çalışmada, norkotinin, NNC'ye temiz ve yüksek verimle nitrozlanır ve in vitro deneyde kullanım için bir standart üretilir.

Reaksiyonun başarısı, ebeveynin kütlesinin teorik değerin milyonda beş parçası içinde olduğunu doğrulayan yüksek çözünürlüklü tandem kütle spektrometresi de dahil olmak üzere spektroskopik analizle doğrulanır. NNC'nin tandem kütle spektrometresi parçalanması daha sonra en bol ürün iyon kütlelerini belirlemek için kullanılır. Görülebileceği gibi, en bol bulunan iki ürün iyonu 134 ve 162'dir ve beş ondalık basamağa kadar doğru kütle tespiti vardır.

Sentezlenen NNC daha sonra in vitro P450 metabolizma testi için bir standart olarak kullanılır. Kullanılan koşullar altında, sentetik NNC, hem ebeveynin iyonu hem de ürün iyon kanallarında iyi çözülmüş tepe noktaları ile yaklaşık 17.5 dakikada ortaya çıkar. Pozitif kontrole göre bir dakikalık, beş dakikalık ve 10 dakikalık inkübasyonlarda NNC oluşumu görülür.

Düzgün bir şekilde yapılırsa, nitrozamid sentezi spektroskopik analizi yaklaşık altı saat içinde yapılabilir. Benzer şekilde, çoklu inkübasyonlu in vitro test sekiz saatten fazla sürmemelidir. Bu tekniğin etkileri, tütünle ilişkili kanserler için risk değerlendirmesine kadar uzanır, çünkü nitrozamit ile ilişkili biyobelirteçlerin ölçümü, bireysel nitrozamin aktivasyonu hakkında bilgilendirici olabilir.

Bu prosedürü denerken, enzim inkübasyonlarını hızlı bir şekilde işlemeyi unutmamak önemlidir. Nitrosamidler bu koşullar altında hidrolize olur ve kütle spesifikasyon analizinden önce uzun süre oturmamalıdır. Bu videoyu izledikten sonra, nitrozamid standartlarının nasıl hazırlanacağını iyi anlamalı ve bunların uygun nitrozamin sitokrom P450 sistemi tarafından in vitro olarak oluşturulup oluşturulmadığını değerlendirmelisiniz.

NNN, NNC veya ilgili kanserojenlerle çalışmanın tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu bileşikler, laboratuvar önlüğü, koruyucu gözlük ve eldiven giyerken her zaman bir çeker ocakta kullanılmalıdır. Ek olarak, tüm kanserojen atıklar uygun şekilde depolanmalı ve etiketlenmelidir.