Multiplexed ayirt analizi ve Intratumoral PD-1⁺ Tim-3⁺ CD8 miktar⁺ T hücreleri

Bu çoğullanmış immünofloresan analizinin genel amacı, hücreleri fenotiplerine göre otomatik olarak saymaktır. Bu yöntem, bir tümör mikroortamı içindeki tümör bağışıklık hücrelerinin fenotipini ve işlevini analiz etmek için çoklu floresan ve otomatik hücre sayımına izin verir. Bu teknoloji, doğrudan tümör mikro ortamından türetilen belirteçleriniz tarafından tahmin edilen iki tür kompozit prognozun oluşturulmasını kolaylaştırdı.

Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, feno tipleme prosedürünün çok uzun olması ve elde edilen ham verilerin daha fazla işlem gerektirmesi nedeniyle mücadele edebilir. Bu yöntem için ilk olarak, annhodge miranty hücrelerinin fenotipini ve immünolojik etkileşimlerini karakterize etmeye çalışırken aklımıza geldi. Çözüldükten sonra, doku bölümlerinin etrafındaki slaytları dikkatlice kurutmak için bir kağıt havlu kullanın ve ardından dokuları hidrofobik bir bariyer kalemle daire içine alın.

Bariyer kuruduğunda, numuneleri beş dakika boyunca %100 asetonda sabitleyin, ardından iki dakika havayla kurutun, ardından slaytları TBS'de 10 dakika yıkayın. Slaytları karanlıkta 10 dakika boyunca 3 damla% 0.1 Avidin ile önceden işlemden geçirin, ardından dokuyu Avidin solüsyonu ile kaplamak için slaytlara dokunun veya hafifçe vurun. Her numuneye 3 damla% 01 biotin ekleyin, ardından biyotini numuneler boyunca hafifçe vurun veya hafifçe vurun ve ardından gösterildiği gibi bir TBS yıkaması yapın.

Daha sonra, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca TBS'de 100 mikrolitre% 5 normal serum ile spesifik olmayan bağlanmayı bloke edin. İnkübasyonun sonunda, fazla serumu çıkarmak için slaytlara hafifçe vurun ve slaytları nemlendirilmiş bir odada bir saat boyunca ilgilenilen birincil antikor kokteylinin 100 mikrolitresinde inkübe edin. TBST'de slaytlar etiketli antikorları beş dakika boyunca yıkayın.

Kuruduktan sonra, hücreleri nemlendirilmiş odada 30 dakika boyunca 100 mikrolitre ikincil antikor kokteyli ile etiketleyin, ardından TBS'de 10 dakikalık bir yıkama yapın. Kurutulmuş ikincil antikor etiketli slaytları, ilgilenilen üçüncül antikor kokteylinin 100 mikrolitresi ile 30 dakika boyunca inkübe edin ve ardından 10 dakikalık bir TBS yıkaması yapın. Yıkamanın sonunda, slaytları kurutun ve dokuları dapi takviyeli bir montaj ortamı ile monte edin.

Ardından, her slaytı bir kapak kızağı ile yontun ve montaj ortamının en az iki saat ayarlanmasına izin verin. Slaytları taramak için mikroskop yazılımını açın ve görüntü tarama protokolünü yükleyin. İlk slaydı mikroskop tablasına yükleyin.

Ardından kontrol çubuğunda, pozlamayı ayarla'ya tıklayın ve yeterli ancak doygun olmayan bir sinyal elde edilene kadar her filtre için pozlama süresini ayarlayın. Üst paneldeki başlat'a tıklayın ve LabID klasörünü açın. İlk slaydın kimliğini girin ve ileri'ye tıklayın.

4x büyütmede parlak alan ışığı altında slaytın genel bakışını elde etmek için tek renkli görüntülemeye tıklayın ve örneği bulun. Taranacak dokunun türünü seçmek için kontrol tuşuna basın ve 4x büyütmede taranacak ilgili bölgeleri seçmek veya seçimini kaldırmak için imleci kullanın. Her bölgenin floresan kırmızı/mavi/yeşil görüntüsünü elde etmek için, düşük güç hayal et'i tıklayın.

Yüksek güç alanı seçimi için, kontrol tuşuna basın ve dokunun 20x büyütmede taranacak alanlarına karşılık gelen en az beş ilgi alanı seçin. Ardından, her alanın çok spektral görüntü alımını elde etmek için yüksek güçlü imagine'e tıklayın ve görüntüleri uygun laboratuvar kimliği klasöründe depolamak için veri depolamaya tıklayın. Dosya menüsünde yeni bir proje oluşturmak için yeni proje'yi seçin, özellik bul menüsünde hücre segmentasyonunu seçin ve feno yazma menüsünde feno yazmayı seçin, ardından yapılandır'a tıklayın.

Görüntü formatında, çoklu spektral'i seçin. Örnek formatında, floresansı seçin. Temsili görüntüleri projeye entegre etmek için, dosya menüsü altında görüntüyü aç'a tıklayın ve tüm serinin 10-30 temsili görüntüsünü seçin.

Otomatik floresans'ı kaldırmak için, lekesiz slaydı açın ve kitaplık kaynağını ve uygun floroforları seçin. Otomatik floresans'ı tıklatın ve boş slaytta otomatik floresan alanını seçin. Bileşik bir görüntü oluşturmak için, floresan kitaplığını ve otomatik floresan spektrumlarını entegre etmek için tümünü hazırla'yı seçin.

Görünüm düzenleyici panelini açmak için göz simgesini tıklayın ve otomatik floresans sinyalini kırpmak için autoflorescence seçimini kaldırın. Her işaretçi için uygun bir renk seçin. Hücreleri bölümlere ayırmak için, bölme menüsünde çekirdekleri ve zarı seçin.

Çekirdek menüsü altında, DAPI'yi nükleer karşı leke olarak ayarlayın. Segment hücrelerine tıklayın ve hücre zarlarındaki çekirdeklerin segmentasyonunu kontrol edin. Hücreleri fenotiplemek için, fenotip menüsünün altında ekle'yi tıklayın.

Hücre fenotip kategorilerini oluşturmak için, Florofor ve Florofor kombinasyonu için beşten fazla temsilci seçin ve eğit sınıflandırıcısı'na tıklayın. Sınıflandırıcı, her hücre için bir güven aralığına sahip bir fenotip atfeden bir algoritma oluşturuyor. Hücrelerin fenotiplerini yakınlaştırın ve kontrol edin.

Ardından fenotip algoritmasını ve görüntü projesini kaydetmek için tümünü fenotipe tıklayın, dosya menüsü altında projeyi kaydet'i seçin. Ardından projeyi adlandırın ve kaydedin. Serinin toplu analizini yapmak için banyo analizini seçin ve kaydedilen projeyi seçin.

Toplu verileri depolamak için bir klasör seçin. Analiz edilecek görüntüleri ekleyin ve ardından çalıştır'a tıklayın. Analizin sonunda, bileşik görüntünün kalitesini kontrol edin ve serideki tüm görüntülerin feno tiplemesini doğrulayın.

Floresan multispektral görüntüleme ile berrak renal hücreli karsinom örneğinde CD8 pozitif T hücrelerini infiltre eden tümörün analizi, CD8 pozitif T hücrelerinin yaklaşık yarısının PD-1 için tek pozitif olduğunu ve yaklaşık 1/3'ünün PD-1 ve Tim-3 için çift pozitif olduğunu ortaya koymaktadır. Bu çeşitli hücre sinyallerini bir doku kesitine entegre ettikten sonra, PD-1 pozitif Tim-3 pozitife karşı PD-1 pozitif, Tim-3 negatif CD8 pozitif T hücreleri üzerindeki PD-1 floresan yoğunluğunun ölçülmesi, Tim-3 birlikte eksprese edildiğinde PD-1 MFI'nin daha yüksek olduğunu ortaya koymaktadır ve bu da Tim-3 ekspresyonunun fonksiyonel alaka düzeyini güçlendirmektedir. Bu temsili deneyde, böbrek tümörü hastalarının %66'sı PD-1 Ligand ekspresyonu için pozitifti ve %100'ü Tim-3 ligandı Galactin-9 için pozitifti.

Renal hücreli karsinom hastalarından alınan tümör dokularının klinik skorlaması, PD-1 ve Tim-3'ü eksprese eden tümör infiltre eden CD-8 pozitif T hücrelerinin sayısı ve yüzdesi ile prognostik skorlama parametreleri arasında pozitif korelasyon olduğunu gösterdi, ancak PD-1 pozitif CD-8'in Tim-3'ü eksprese etmediğini gösterdi. İlginç bir şekilde, medyan yüzdesinin üzerinde PD1 ve Tim 3 eksprese eden CD-8 pozitif T hücreleri olan renal hücreli karsinom hastalarının nüks olasılığı daha yüksekken, Tim-3 ko ekspresyonu olmadan PD-1 ekspresyonunun hasta nüksü ile ilişkili olmadığı bulundu. Bu prosedürü denerken, hücrelerin fenotipini mümkünse bir patolog da dahil olmak üzere iki ayrı araştırmacı ile gözden geçirmeyi hatırlamak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, x-vivo stimülasyondan sonra öz fenotipin fonksiyonel etkisi hakkında ek soruları yanıtlamak için sitometri gibi diğer konular gerçekleştirilebilir. Geliştirildikten sonra, bu teknik, kanser alanındaki araştırmacıların etkilenen organlardaki bağışıklık tepkilerini keşfetmelerinin yolunu açtı.