Multiplexed ayirt analizi ve Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8 miktar+ T hücreleri
February 8th, 2018
Tümör microenvironment eğitim klinik yanıt immünoterapi prognostik veya akýllý biyolojik tespit edebilir. Burada sunulan, bir yöntem situ Floresans spektral analiz ve CD8 otomatik olarak çeşitli altgrupları saymak için görüntüleme üzerinde dayanır+ T hücreleri. Bu tekrarlanabilir ve güvenilir teknik büyük kohort analizi için uygundur.
Bu çoğullanmış immünofloresan analizinin genel amacı, hücreleri fenotiplerine göre otomatik olarak saymaktır. Bu yöntem, bir tümör mikroortamı içindeki tümör bağışıklık hücrelerinin fenotipini ve işlevini analiz etmek için çoklu floresan ve otomatik hücre sayımına izin verir. Bu teknoloji, doğrudan tümör mikro ortamından türetilen belirteçleriniz tarafından tahmin edilen iki tür kompozit prognozun oluşturulmasını kolaylaştırdı.
Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, feno tipleme prosedürünün çok uzun olması ve elde edilen ham verilerin daha fazla işlem gerektirmesi nedeniyle mücadele edebilir. Bu yöntem için ilk olarak, annhodge miranty hücrelerinin fenotipini ve immünolojik etkileşimlerini karakterize etmeye çalışırken aklımıza geldi. Çözüldükten sonra, doku bölümlerinin etrafındaki slaytları dikkatlice kurutmak için bir kağıt havlu kullanın ve ardından dokuları hidrofobik bir bariyer kalemle daire içine alın.
Bariyer kuruduğunda, numuneleri beş dakika boyunca %100 asetonda sabitleyin, ardından iki dakika havayla kurutun, ardından slaytları TBS'de 10 dakika yıkayın. Slaytları karanlıkta 10 dakika boyunca 3 damla% 0.1 Avidin ile önceden işlemden geçirin, ardından dokuyu Avidin solüsyonu ile kaplamak için slaytlara dokunun veya hafifçe vurun. Her numuneye 3 damla% 01 biotin ekleyin, ardından biyotini numuneler boyunca hafifçe vurun veya hafifçe vurun ve ardından gösterildiği gibi bir TBS yıkaması yapın.
Daha sonra, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca TBS'de 100 mikrolitre% 5 normal serum ile spesifik olmayan bağlanmayı bloke edin. İnkübasyonun sonunda, fazla serumu çıkarmak için slaytlara hafifçe vurun ve slaytları nemlendirilmiş bir odada bir saat boyunca ilgilenilen birincil antikor kokteylinin 100 mikrolitresinde inkübe edin. TBST'de slaytlar etiketli antikorları beş dakika boyunca yıkayın.
Kuruduktan sonra, hücreleri nemlendirilmiş odada 30 dakika boyunca 100 mikrolitre ikincil antikor kokteyli ile etiketleyin, ardından TBS'de 10 dakikalık bir yıkama yapın. Kurutulmuş ikincil antikor etiketli slaytları, ilgilenilen üçüncül antikor kokteylinin 100 mikrolitresi ile 30 dakika boyunca inkübe edin ve ardından 10 dakikalık bir TBS yıkaması yapın. Yıkamanın sonunda, slaytları kurutun ve dokuları dapi takviyeli bir montaj ortamı ile monte edin.
Ardından, her slaytı bir kapak kızağı ile yontun ve montaj ortamının en az iki saat ayarlanmasına izin verin. Slaytları taramak için mikroskop yazılımını açın ve görüntü tarama protokolünü yükleyin. İlk slaydı mikroskop tablasına yükleyin.
Ardından kontrol çubuğunda, pozlamayı ayarla'ya tıklayın ve yeterli ancak doygun olmayan bir sinyal elde edilene kadar her filtre için pozlama süresini ayarlayın. Üst paneldeki başlat'a tıklayın ve LabID klasörünü açın. İlk slaydın kimliğini girin ve ileri'ye tıklayın.
4x büyütmede parlak alan ışığı altında slaytın genel bakışını elde etmek için tek renkli görüntülemeye tıklayın ve örneği bulun. Taranacak dokunun türünü seçmek için kontrol tuşuna basın ve 4x büyütmede taranacak ilgili bölgeleri seçmek veya seçimini kaldırmak için imleci kullanın. Her bölgenin floresan kırmızı/mavi/yeşil görüntüsünü elde etmek için, düşük güç hayal et'i tıklayın.
Yüksek güç alanı seçimi için, kontrol tuşuna basın ve dokunun 20x büyütmede taranacak alanlarına karşılık gelen en az beş ilgi alanı seçin. Ardından, her alanın çok spektral görüntü alımını elde etmek için yüksek güçlü imagine'e tıklayın ve görüntüleri uygun laboratuvar kimliği klasöründe depolamak için veri depolamaya tıklayın. Dosya menüsünde yeni bir proje oluşturmak için yeni proje'yi seçin, özellik bul menüsünde hücre segmentasyonunu seçin ve feno yazma menüsünde feno yazmayı seçin, ardından yapılandır'a tıklayın.
Görüntü formatında, çoklu spektral'i seçin. Örnek formatında, floresansı seçin. Temsili görüntüleri projeye entegre etmek için, dosya menüsü altında görüntüyü aç'a tıklayın ve tüm serinin 10-30 temsili görüntüsünü seçin.
Otomatik floresans'ı kaldırmak için, lekesiz slaydı açın ve kitaplık kaynağını ve uygun floroforları seçin. Otomatik floresans'ı tıklatın ve boş slaytta otomatik floresan alanını seçin. Bileşik bir görüntü oluşturmak için, floresan kitaplığını ve otomatik floresan spektrumlarını entegre etmek için tümünü hazırla'yı seçin.
Görünüm düzenleyici panelini açmak için göz simgesini tıklayın ve otomatik floresans sinyalini kırpmak için autoflorescence seçimini kaldırın. Her işaretçi için uygun bir renk seçin. Hücreleri bölümlere ayırmak için, bölme menüsünde çekirdekleri ve zarı seçin.
Çekirdek menüsü altında, DAPI'yi nükleer karşı leke olarak ayarlayın. Segment hücrelerine tıklayın ve hücre zarlarındaki çekirdeklerin segmentasyonunu kontrol edin. Hücreleri fenotiplemek için, fenotip menüsünün altında ekle'yi tıklayın.
Hücre fenotip kategorilerini oluşturmak için, Florofor ve Florofor kombinasyonu için beşten fazla temsilci seçin ve eğit sınıflandırıcısı'na tıklayın. Sınıflandırıcı, her hücre için bir güven aralığına sahip bir fenotip atfeden bir algoritma oluşturuyor. Hücrelerin fenotiplerini yakınlaştırın ve kontrol edin.
Ardından fenotip algoritmasını ve görüntü projesini kaydetmek için tümünü fenotipe tıklayın, dosya menüsü altında projeyi kaydet'i seçin. Ardından projeyi adlandırın ve kaydedin. Serinin toplu analizini yapmak için banyo analizini seçin ve kaydedilen projeyi seçin.
Toplu verileri depolamak için bir klasör seçin. Analiz edilecek görüntüleri ekleyin ve ardından çalıştır'a tıklayın. Analizin sonunda, bileşik görüntünün kalitesini kontrol edin ve serideki tüm görüntülerin feno tiplemesini doğrulayın.
Floresan multispektral görüntüleme ile berrak renal hücreli karsinom örneğinde CD8 pozitif T hücrelerini infiltre eden tümörün analizi, CD8 pozitif T hücrelerinin yaklaşık yarısının PD-1 için tek pozitif olduğunu ve yaklaşık 1/3'ünün PD-1 ve Tim-3 için çift pozitif olduğunu ortaya koymaktadır. Bu çeşitli hücre sinyallerini bir doku kesitine entegre ettikten sonra, PD-1 pozitif Tim-3 pozitife karşı PD-1 pozitif, Tim-3 negatif CD8 pozitif T hücreleri üzerindeki PD-1 floresan yoğunluğunun ölçülmesi, Tim-3 birlikte eksprese edildiğinde PD-1 MFI'nin daha yüksek olduğunu ortaya koymaktadır ve bu da Tim-3 ekspresyonunun fonksiyonel alaka düzeyini güçlendirmektedir. Bu temsili deneyde, böbrek tümörü hastalarının %66'sı PD-1 Ligand ekspresyonu için pozitifti ve %100'ü Tim-3 ligandı Galactin-9 için pozitifti.
Renal hücreli karsinom hastalarından alınan tümör dokularının klinik skorlaması, PD-1 ve Tim-3'ü eksprese eden tümör infiltre eden CD-8 pozitif T hücrelerinin sayısı ve yüzdesi ile prognostik skorlama parametreleri arasında pozitif korelasyon olduğunu gösterdi, ancak PD-1 pozitif CD-8'in Tim-3'ü eksprese etmediğini gösterdi. İlginç bir şekilde, medyan yüzdesinin üzerinde PD1 ve Tim 3 eksprese eden CD-8 pozitif T hücreleri olan renal hücreli karsinom hastalarının nüks olasılığı daha yüksekken, Tim-3 ko ekspresyonu olmadan PD-1 ekspresyonunun hasta nüksü ile ilişkili olmadığı bulundu. Bu prosedürü denerken, hücrelerin fenotipini mümkünse bir patolog da dahil olmak üzere iki ayrı araştırmacı ile gözden geçirmeyi hatırlamak önemlidir.
Bu prosedürü takiben, x-vivo stimülasyondan sonra öz fenotipin fonksiyonel etkisi hakkında ek soruları yanıtlamak için sitometri gibi diğer konular gerçekleştirilebilir. Geliştirildikten sonra, bu teknik, kanser alanındaki araştırmacıların etkilenen organlardaki bağışıklık tepkilerini keşfetmelerinin yolunu açtı.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu çalışma, fenotipleri temel alarak tümör bağışıklık hücrelerinin otomatik sayımı için yenilikçi bir çoklu immünofloresan analiz yöntemi sunmaktadır. Teknik, tümör mikroçevresini analiz etmek ve immünoterapi yanıtı için prognostik biyobelirteçleri tanımlamak üzere tasarlanmıştır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- İmmünoloji
- Onkoloji
- Hücre Biyolojisi
Arka Plan
- Tümör mikroçevresi, kanser ilerlemesi ve tedavi yanıtında kritik bir rol oynar.
- CD8 + T hücreleri, tümörlerde bağışıklık tepkileri için önemlidir.
- Mevcut hücre sayımı yöntemleri zaman alıcı olabilir ve geniş veri işleme gerektirebilir.
- Bu çalışma, bağışıklık hücre fenotiplerinin analizini hızlandırmayı amaçlamaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Tümör örneklerinde bağışıklık hücrelerinin otomatik sayımı için güvenilir bir yöntem geliştirmek.
- Kanser araştırmalarında büyük kohor analizlerine olanak sağlamak.
- Tümör mikroçevresindeki bağışıklık etkileşimlerinin anlaşılmasını geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Hücre fenotip analizi için çoklu immünofloresan.
- Otomatik sayım için in situ floresan çok spektral görüntüleme.
- Görüntüleme için hidrofobik bariyerlerle doku kesitlerinin hazırlanması.
- Hücre popülasyonlarını analiz etmek için veri işleme teknikleri.
Ana Sonuçlar
- Yöntem, CD8 + T hücre alt popülasyonlarının verimli sayımına olanak tanır.
- Sonuçlar, tümör mikroçevresinden türetilen potansiyel prognostik belirleyicileri gösterir.
- Teknik tekrarlanabilir ve büyük ölçekli çalışmalar için uygundur.
- Tümörlerde bağışıklık hücre dinamiklerinin daha iyi anlaşılması.
Sonuçlar
- Bu yenilikçi yöntem, tümör bağışıklık hücrelerinin analizini geliştirir.
- İmmünoterapi için biyobelirteçleri tanımlamak için bir çerçeve sağlar.
- Yaklaşım, onkolojide çeşitli araştırma uygulamaları için uyarlanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Multiplexed immunofluorescence analysis enables automated quantification of immune cell phenotypes in the tumor microenvironment, supporting target validation and biomarker discovery in immuno-oncology. By measuring co-expression of inhibitory receptors such as PD-1 and Tim-3 on CD8+ T cells, the method provides predictive confidence for patient stratification and therapeutic response. This approach addresses a key discovery-stage challenge: translating spatial immune profiling into actionable insights for portfolio triage and mechanistic de-risking.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by clarifying PD-1 and Tim-3 co-expression patterns on tumor-infiltrating CD8+ T cells.
- Operational Value: Enables biological de-risking through functional target validation of exhaustion markers in renal cell carcinoma.
- Strategic Value: Supports predictive confidence and portfolio triage by linking PD-1+/Tim-3+ T-cell frequency to poor prognosis and relapse risk.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows via standardized multispectral imaging and phenotyping.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility and quantitative outputs through automated cell counting and segmentation.
- Strategic Value: Enhances screening readiness and platform reuse by integrating fluorescence library preparation and autofluorescence removal.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates disease relevance through correlation of PD-1+/Tim-3+ CD8+ T cells with prognostic scoring in renal cell carcinoma.
- Operational Value: Supports translational continuity from discovery to preclinical validation via composite imaging and phenotype algorithm training.
- Strategic Value: Informs risk-adjusted advancement decisions by identifying Tim-3 co-expression as a functionally relevant biomarker independent of PD-1 alone.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, enabling immune profiling that informs target confidence and translational biomarker alignment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying PD-1 and Tim-3 co-expression on CD8+ T cells in the tumor microenvironment.
- Screening: Delivers assay readiness and reproducibility through automated multispectral imaging and standardized phenotyping workflows.
- Analytics: Generates quantitative measurements such as PD-1 MFI and double-positive cell percentages to enable cross-condition comparison.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via prognostic correlation in renal cell carcinoma specimens, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for immune profiling across tumor types, reducing redundant assay development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in T-cell exhaustion pathways.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of multiplexed immunofluorescence for immune cell quantification.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early biomarker identification.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on PD-1+/Tim-3+ T-cell thresholds linked to relapse.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunofluorescence staining, multispectral imaging, and image analysis software for phenotyping.
- Dependent on instrumentation including fluorescence microscopes with multispectral capabilities and environmental controls for slide preparation.
- Necessitates cross-team standardization of antibody panels, exposure settings, and phenotyping algorithms across sites.
- Involves adaptation considerations for varying tissue types, fixation methods, and antigen retrieval protocols.
- Includes practical limitations such as lengthy phenotyping procedures and complex raw data processing requiring post-acquisition quality checks.
