Chemoattractant degradelere Multi-hücresel tepkiler 3D Analizi

Basitleştirilmiş 2D in vitro kültürlerile 3D doku benzeri ortamlardaki farklılıklar, canlı dokuların mekansal ve kimyasal karmaşıklığını temsil eden 3D sistemlere olan ilgiyi artırmıştır. Üretim süreci tesis veya fotolitografi teknikleri gerektirmez. Ancak, 3D PDMS cihazı 3D fizyolojik ortam uygulamaları için gerekli vektörleri içerir.

Mezofluidic cihaz hazırlanması için, polidimethylsiloxane veya PDMS cihazı için kalıbın maskesini tasarlamak ve termostata dayanıklı reçine sahip stereo litografi ekipmanı kullanarak kalıbı yazdırmak için uygun bir üç boyutlu bilgisayar destekli tasarım yazılımı programı kullanın. Kalıp hazır olduğunda, kabaca 10-1 oranında bir kür maddesi ile kalıp başına PDMS monomer çözeltisi üç mililitre karıştırın ve bir saat boyunca bir vakum desiccator karışımı degas için bir vakum kullanın. Desiccation sonunda, kalıp yüzeyinden herhangi bir toz kaldırmak ve dikkatlice gazdan PDMS çözeltisi ile kalıp doldurmak için yapışkan bant bir parça kullanın.

Daha sonra, kalıp oda sıcaklığında soğumasını izin vermeden önce iki saat boyunca 80 santigrat derecede PDMS tedavi. Kalıp dokunmak için soğutulduğunda, kalıp ve PDMS arasındaki sınırı kesmek ve dikkatle kalıp PDMS soymak için bir bıçak kullanın. PDMS'yi 22'ye 22 milimetrelik bir kapak kaymasını sığdıracak şekilde kırpın ve girişte bir delik aç.

Düşük tiftik dokuları ve %70 etanol kullanarak cihazı ve coverslip'i silin ve cihazı büyük toz parçacıklarını gidermek için yeni bir yapışkan bant parçasıyla dab. Daha sonra PDMS cihazını otoklavlayın ve 121 santigrat derecede 8 dakika ıslak ve 15 dakika kurulayın ve parçaları birbirine bağlamadan önce bir doku kültürü başlığında beş dakika boyunca PDMS kısmının alt yüzeyini ve kapak lı kapağı bir doku kültürü başlığında beş dakika boyunca bir korona deşarj tabancası ile tedavi edin. Cihazı yüklemek için, ilk büyüme ortamı uygun bir hacimde ilgi hücreleri resuspend 1% penisilin ve streptomisin ve% 1 insülin-transferrin-selenyum-x ile takviye.

Sonraki karışımı ile meme bezi hücre süspansiyon 50 mikrolitre 425 taze hazırlanmış nötralize kollajen çözeltisi mikrolitre ve kollajen hücre süspansiyon ile 200 mikrolitre pipet doldurun. Tüm oda dolana kadar PDMS cihazına giriş yoluyla süspansiyon enjekte ve büyüme ortamı ile her iki tarafta rezervuarları doldurmadan önce jelasyon neden olmak için bir saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derece inkuvatör cihaz yerleştirin ve konfokal görüntüleme kadar kuvöz cihaz dönmek. 3D görüntüleme ve niceleme için, bir konfokal mikroskosa canlı hücre görüntüleme kültür odası kurun ve sıcaklık ve karbondioksiti sırasıyla 37 santigrat derece ve %5'e önceden ayarlayın.

Odayı nemleştirmek için görüntüleme odası rezervuarına su ekleyin, gerektiği gibi ıslak mendilleri odaya yerleştirin ve PDMS cihazını odaya yerleştirin. Degrade oluşumunda faktör kaynağı olarak rezervuarlardan birine epidermal büyüme faktörü ekleyin ve diğer rezervuarı mekansal olarak dereceli epidermal büyüme faktörü dağılımının gelişimi için bir lavabo görevi olarak bırakarak bırakalım. Daha sonra z destesinin aralığını ilgilendiren organoidlerin hacmini kapsayan ayarlayın ve görüntülemeye başlayın.

Deneyin sonunda, organoidlerden veya tek tek hücrelerin göçünden yayılan dalların uzunluk ve açısını ölçmek için uygun bir görüntü analiz programı kullanın. Hem silico hem de in vitro testlerinde, hücre kültürü alanında, kaynak veya lavabo rezervuarlarının yenilenmeden yaklaşık iki gün süren, epidermal büyüme faktörü olan 6.4 kilodalton proteininin, nispeten kısa bir süre içinde hazırlandığı gibi kollajen içinde kararlı bir difüzyon bazlı degrade oluşturabileceğini düşündüren kararlı bir lineer epidermal büyüme faktörü gradyanı nın oluşumu ortaya konmuştur. Meme organoidleri, mililitrede 0,5 nanomolar olması için doğrusal degradeye epidermal büyüme faktörü eklenirse, üç gün boyunca yön seli olmayan 2.5 nanomolar epidermal büyüme faktörü varlığında birden fazla dal oluştururlar.

Ancak, dal oluşumu önemli bir yön önyargısı gösterir. Dikkat, boşluk kavşak inhibitörleri eklenmesi degrade yanıt organoidlerin yeteneğini bastırır. Kollajen çözeltisinin pH jelasyon ve hücre canlılığı için önemlidir.

Karıştırmadan önce kollajen nötralize edilmezse, hücre canlılığı düşük olacaktır. Bu yöntem daha gerçekçi doku modelleme karşılamak için uzatılabilir ve jel içinde bireysel hücrelerden vasküler ağ oluşumu nu barındırabilir.