Name: Chemoattractant degradelere Multi-hücresel tepkiler 3D Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 57 s
Description: Keşfedin, 3D PDMS cihazları kullanarak kemotaktik gradyanlara karşı çok hücreli organoid yanıtlarını nasıl analiz edeceğinizi. Bu yöntem, hücre davranışlarını ve zayıf sinyal algılamasını in vivo benzeri ortamlarda çalışmanıza olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, AJE 'ye hibe (NSF PD-11-7246, meme kanseri Araştırma Vakfı (BCRF-17-048) ve NCı U54 CA210173) ve AL (U54CA209992) tarafından destekleniyordu.

Tüm hayvan çalışmaları, Johns Hopkins Üniversitesi Tıp Fakültesi 'nin kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanan protokollere uygun olarak yapılmıştır.
1. mezofluidik cihazın imalatı
<ol><li>3D CAD yazılımı kullanarak PDMS cihazı için kalıp maskesini Tasarla.</li>
	<li>Isıl dirençli reçine ile stereolitografi ekipmanlarını kullanarak kalıbı yazdırın. Not: burada açıklanan prosedürler ticari 3B baskı hizmeti tarafından gerçekleştirilmiştir.</li>
	<li>10:1 oranında kür ajanı ile bir PDMS monomer çözümünü iyice karıştırın. Cihazın imalatı için 3 mL PDMS karışımı gereklidir. Toplam hacim imal edilecek kalıplar sayısına bağlıdır.</li>
	<li>1 saat boyunca bir vakum kurutucu içinde bir in-house laboratuvar vakum veya vakum pompası kullanımı ile bir vakum uygulayarak karışımı Degas.</li>
	<li>Toz kaldırmak için yapışkan bir bant ile kalıp yüzeyini DAB ve sonra kalıp PDMS karışımı dökün. Baloncuklar işlemde tanıtılırsa, vakum kurutucu içinde tekrar gaz giderme. Küf sütunlar arasında sıkışmış kabarcıklar keskin bir iğne ile onları alay tarafından kaldırılabilir. Not: oda sıcaklığında gaz giderme işlemi 1 saat veya daha az içinde yapılmalıdır.</li>
	<li>80 °C ' de 2 saat ısıtarak PDMS 'ye tedavi yapın. Kalıp oda sıcaklığında soğumasını bekleyin.</li>
	<li>Bir bıçak ile kalıp ve PDMS arasındaki sınırı keser ve sonra dikkatle kalıp PDMS soyulmak.</li>
	<li>PDMS parçasını 22 mm x 22 mm kaplaması sığdırmak için kırpın ve girişe bir delik takın. Not: protokol burada duraklatılmış olabilir.</li>
	<li>Düşük tüy dokusu ve% 70 etanol ile yüzeyleri silerek PDMS parçası ve 22 mm x 22 mm lamel magazini temizleyin. Sonra yapışkan bir bant ile dabbing büyük toz parçacıkları çıkarın.</li>
	<li>PDMS parçasını ve lamel magazini 'ı otoklavlama (121 °c ' de 8 dakika ıslak, 15 dakika kuru) veya 1 saat boyunca UV ışığa maruz kalma ile sterilize edin.</li>
	<li>Doku kültürü kaputu içinde 5 dakika boyunca korona deşarj tabancası ile PDMS parçası ve kapak kayma alt yüzeyi tedavi ve sonra onları bir araya bağ. DIKKAT: alt kısmında Polistiren köpük gibi herhangi bir iletken olmayan malzeme koymak ve bu süreçte tüm iletken malzemeleri çıkarın. Kollajen jel ve cam coverslip arasında bağ artırmak için tedavi sonra, 5 dakika içinde, hemen cihaza kollajen enjekte.</li>
</ol>2. hücre hazırlığı: primer meme nevuslardır yalıtım
Not: meme nevuslardır yalıtım detayları önceki çalışma bulunabilir11. Her türlü tek hücreli veya nevuslardır kendi izolasyon/dekolmanı protokollerine göre hazırlanabilir.
<ol><li>Doku rahatlatır ve 37 °c ' de 50 ml kolajenaz/tripsin çözeltisi (fare başına 10 ml) içinde 30 dakika için sallamak kadar bir neşter ile farelerin meme bezi dokusu Mince/F12, 0,1 g tripsin, 0,1 g kolajenaz ile tamamlayıcı , 5 mL FBS, 250 μL 1 μg/mL insülin ve 50 μL, 50 μg/mL gentaminisin.</li>
	<li>10 dakika boyunca 1.250 x g 'de collagenase/tripsin çözeltisi Santrifüjü aspirasyon ile süpernatant çıkarın. Hücreleri 10 mL DMEM/F12 'de dağıtın ve 1.250 x g 'de santrifüjler 10 dk. Aspirasyon ile DMEM/F12 kaldırdıktan sonra, 4 mL DMEM/F12 ile 40 μL DNase (2 ünite/μL) ile tamamlayıcı hücreleri yeniden askıya alın.</li>
	<li>2-5 dakika boyunca DNase çözümünü el ile sallayın ve ardından 10 dakika boyunca 1.250 x g 'de santrifüjün.</li>
	<li>Dört diferansiyel santrifüjleri ile tek hücrelerden ayrı organoidler (Nabız 1.250 x g ve santrifüj 3-4 s durdurmak amaçlanan hıza ulaştığında). Her nabız arasında, süpernatant Aspire ve dmem/F12 10 ml Pelet pelletini.</li>
	<li>1% penisilin/streptomisin ve 1% insülin-transferrin-Selenium-X kollajen hazırlama için dmem/F12 büyüme orta istenilen miktarda son Pelet yeniden askıya.</li>
</ol>3. kollajen hazırlama ve enjeksiyon
Not: diğer ECM jelleri kendi jelleşme protokollerine göre hazırlanabilir.
<ol><li>Hazırlamak kollajen tipi ı çözüm (3,78 mg/mL), 10X DMEM, 1 N NaOH çözüm, buz üzerinde normal büyüme ortamı. Not: prosedür tamamlanana kadar buzda tutun.</li>
	<li>6 μL 1 N NaOH çözeltisi, 200 μL büyüme orta ve 50 μL 10 DMEM önceden soğutulmuş mikrosantrifüjle tüp içine ekleyin ve çözümü iyice karıştırın.</li>
	<li>Önceden karışık çözüme 425 μL kollajen ekleyin ve pipetleme ile iyice karıştırın.</li>
	<li>Kollajen karışımı kısa bir süre Santrifüjü (daha az 5 saniye) ayırmak ve karışımı kabarcıkları kaldırmak için.</li>
	<li>Lif oluşumunu teşvik etmek için 1 saat boyunca buz üzerinde nötralize kollajen çözeltisi tutun.</li>
	<li>Kollajen karışımı içine hücre süspansiyon 50 μL ekleyin ve iyice karıştırın. Not: son kollajen konsantrasyonu 2 mg/mL 'dir.</li>
	<li>Tüm oda doldurulana kadar PDMS cihazının girişinde 200 μL pipet kullanarak çözüm enjekte edilir. Kollajen karışımı sütunların boşlukları üzerinden taşırsa, jelleşme sonra keskin cerrahi bıçak ile aşırı kollajen jel kesip.</li>
	<li>Cihazı 37 °C ' de,% 5 CO2 ile 1 saat boyunca kuluçkunda tutun.</li>
	<li>Her iki tarafın rezervuarlarını büyüme ortamına doldurun ve cihazı 37 °C ' de kuluçta tutun,% 5 CO2 ile Konfokal görüntüleme gerçekleştirilene kadar.</li>
</ol>4.3B görüntüleme ve miktar
<ol><li>Bir Konfokal mikroskop ve Pre-set sıcaklık ve CO2 Için 37 °c ve% 5, sırasıyla canlı hücre görüntüleme kültürü odası yükleyin. Nem almak için, odanın rezervuar su ekleyin ve gerekirse odaya ıslak mendiller yerleştirin.</li>
	<li>PDMS cihazını Odaya yerleştirin ve EGF 'i gradyan oluşumunda EGF 'in ' kaynak ' olarak bir rezervuar olarak ekleyin. Diğer rezervuar, uzamsal olarak dereceli EGF dağıtımının geliştirilmesi için gerekli olan bir ' lavabo ' hizmet verecektir. 2,5 Bu çalışmada 0,5 nM/mm gradyan yapmak için lavaboya EGF nM eklendi.</li>
	<li>İlgi organoids hacmi kapsayan Z-yığını aralığını ayarlayın ve görüntüleme başlar. DIKKAT: fototoksisite önlemek Için, Konfokal görüntülemede daha düşük bir lazer yoğunluğu deneyin veya Multi-foton görüntüleme teknikleri kullanın.</li>
	<li>Ticari yazılım veya özel yapılan bir program kullanarak 2B görüntü yığınlarından 3B görüntüyü yeniden oluşturun. Organoids veya bireysel hücrelerin göç uzanan dalları uzunluğunu ve açısını ölçmek. Burada, ımagej kullanarak orgoid gövdesinin etrafında bir serbest anahat çizerek miktar ölçümü gerçekleştirin.</li>
</ol>

<ol><li>Humphrey, J. D., Dufresne, E. R., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+and+extracellular+matrix+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction and extracellular matrix homeostasis.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 15 (12), 802-812 (2014).</li>
<li>Schwartz, M. A., Schaller, M. D., Ginsberg, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins%3A+emerging+paradigms+of+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Integrins: emerging paradigms of signal transduction.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 11, 549-599 (1995).</li>
<li>Yin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+Stem+Cell+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Engineering Stem Cell Organoids.</a> Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).</li>
<li>Doyle, A. D., Carvajal, N., Jin, A., Matsumoto, K., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+3D+matrix+microenvironment+regulates+cell+migration+through+spatiotemporal+dynamics+of+contractility-dependent+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Local 3D matrix microenvironment regulates cell migration through spatiotemporal dynamics of contractility-dependent adhesions.</a> Nature Communications. 6, 8720(2015).</li>
<li>Meyvantsson, I., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+models+in+microfluidic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Analytical+Chemistry+%28Palo+Alto%2C+Calif%29%22%5BJournal%5D)">Cell culture models in microfluidic systems.</a> Annual Review of Analytical Chemistry (Palo Alto, Calif). 1, 423-449 (2008).</li>
<li>Bhatia, S. N., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Microfluidic organs-on-chips.</a> Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).</li>
<li>Zervantonakis, I. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+microfluidic+model+for+tumor+cell+intravasation+and+endothelial+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13515-13520 (2012).</li>
<li>Barkefors, I., Thorslund, S., Nikolajeff, F., Kreuger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluidic+device+to+study+directional+angiogenesis+in+complex+tissue+and+organ+culture+models%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A fluidic device to study directional angiogenesis in complex tissue and organ culture models.</a> Lab on a Chip. 9 (4), 529-535 (2009).</li>
<li>Hou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+lapse+investigation+of+antibiotic+susceptibility+using+a+microfluidic+linear+gradient+3D+culture+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Time lapse investigation of antibiotic susceptibility using a microfluidic linear gradient 3D culture device.</a> Lab on a Chip. 14 (17), 3409-3418 (2014).</li>
<li>Ellison, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+communication+enhances+the+capacity+of+cell+ensembles+to+sense+shallow+gradients+during+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cell-cell communication enhances the capacity of cell ensembles to sense shallow gradients during morphogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), E679-E688 (2016).</li>
<li>Nguyen-Ngoc, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+culture+assays+of+murine+mammary+branching+morphogenesis+and+epithelial+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">3D culture assays of murine mammary branching morphogenesis and epithelial invasion.</a> Methods in Molecular Biology. 1189, 135-162 (2015).</li>
</ol>

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

PDMS kalıpları imalat ticari bir 3D baskı hizmeti kullanılarak yapılmıştır, ama aynı zamanda yüksek uç 3D yazıcı-ev tarafından gerçekleştirilebilir. Çeşitli 3D imalat yöntemleri arasında, stereolitografi yüksek çözünürlüklü kalıp üretimi için tavsiye edilir. PDMS kür yüksek sıcaklıkta oluştukları için (80 °C), malzemelerin yeterli sıcaklığa dayanıklı olması, hangi açıkça belirtilmelidir, baskı dış kaynaklı ise. Bir termal Post-Cure parçanın termal direnci artırmak için baskı hizmeti şirketi ile tartışılabilir. Baskı hizm...

Fizyolojik ortamda, hücreler, bir ekstrüle matrisine (ECM) gömülür ve bir bolluk biomolecules maruz kalır. Hücreler ve çevredeki mikroçevre arasındaki etkileşimler, göç, büyüme, farklılaşma ve hayatta kalma dahil olmak üzere farklı phenotypes kontrol hücre içi süreçleri düzenleyen1,2. Konvansiyonel 2D hücre kültüründe hücresel davranışlar hakkında çok şey öğrenildi. Ancak, 3D Hidrojeller gömülü hücreler ile intravital görüntüleme ve deneme gelişiyle, hücre davranışları önemli farklar Basitleştirilmiş 2D in vitro kültürler vs 3D doku benzeri ortamlar tanınmıştır. Hücreler ECM lifleri ile etkileşime girirken ve 3D matriks içindeki mekanik özelliklerini hissederken, jelin malzeme sertliği 2D in vitro sistemde tam bağımsız bir değişken değildir. Ölçümlendirme, fokal yapışma oluşumunu değiştirir, farklı hücre morfolojisi ve davranışları ile sonuçlanır. Ayrıca, 2B yüzeydeki hücreler, 3B 'de tüm yönlere açık olan hücrelerden daha az sinyal verme ipuçları ortaya çıkar.
Bu sınırlamalar, yaşam dokularının uzamsal ve kimyasal karmaşıklığı temsil eden ve daha iyi in vivo doku fonksiyonları tahmin 3D sistemlerin çıkarlarını artmıştır. Bunlar, ECM3,4' te rasgele serpiştirilmiş hücrelere Self-montajı hücresel mikroyapıları olarak organoids birçok formda geliştirilmiştir. Microimalat teknolojileri son gelişmeler 3D kültür sistemleri5,6, 7,8,9 çeşitli türleri gelişlerini kolaylaştırmış fenotipik değişiklikler ve incelemek için çözünür sinyallere hücresel tepkiler; Ancak teknolojik bariyerler araştırma laboratuvarlarında yaygın kullanımı sınırlandırmaktadır. Birçok durumda, imalat süreçleri fotolitografi teknikleri ve yumuşak litografi için arka plan bilgiler gerektirir. Dahası, bir cihaz inşa etmek ve uzun bir süre boyunca cihazın optimum fonksiyonunu elde etmek için çeşitli faktörler kontrol edilmelidir.
Yöntemimiz, hücreleri ve çok hücreli organoidleri tanımlanan kemoçekici degradelerle 3B mikro ortama birleştirmek ve ardından EGF10' a epitelyal yanıtları analiz etmek IÇIN 3B PDMS cihazının nasıl oluşturulacağını açıklar. Verilerimiz, yüzeysel EGF degradelere yanıt vermek için organoidlerin kapasitesinin, hücre içi kimyasal bağlamanın Gap kavşakla ortaya çıkması anlamına gelmiştir. Zayıf ve gürültülü uzamsal olarak dereceli girişlerin daha kesin tespiti için organoidlerin potansiyelini göstermektedir. İmalat süreci temiz oda tesisi veya fotolitografi teknikleri gerektirmez. Ancak, 3D PDMS cihaz 3D fizyolojik çevre gerekli faktörleri içerir. Bu yöntem 3D hücresel davranışlarını incelemek için yararlı olacaktır ve farklı hücre tipleri, kemoçekiciler ve ECM kombinasyonları ile büyük bir araştırma potansiyeline sahiptir.

<table><tbody><tr><td>22mm x 22mm lamel</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>Kollajen I, Rat</td><td>Fisher Scientific</td><td>CB-40236</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>COMSOL Multiphysics 4.2</td><td>COMSOL Inc</td><td></td><td>Difüzyon dinamiklerini simüle etmek için kullanılır</td></tr><tr><td>10x DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2429</td><td></td></tr><tr><td>DEME / F12</td><td>Thermo Fisher</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4623</td><td></td></tr><tr><td>EGF Rekombinant Fare Proteini</td><td>Thermo Fisher</td><td>PMG8041</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>Fiji-ImageJ</td><td></td><td></td><td>Dallanma uzunluğu ve açılarını ölçmek için kullanılır</td></tr><tr><td>Gentamisin</td><td>GIBCO&nbsp;</td><td>5750-060</td><td></td></tr><tr><td>IMARIS</td><td>Bit Düzlemi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İnsülin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19278</td><td></td></tr><tr><td>İnsülin-Transferrin-Selenyum-X</td><td>GIBCO&nbsp;</td><td>51500</td><td></td></tr><tr><td>Düşük tiftikli doku</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>Kimtech mendil</td><td></td></tr><tr><td>Kalıp Malzemesi</td><td>Proto labs Accura</td><td>SL5530&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kalıp baskı ekipmanları</td><td>Proto labs</td><td>Stereolithogrphy</td><td>Maksimum boyut: 127mm x 127mm x 63.5mm, Katman kalınlığı: 0.0254mm</td></tr><tr><td>Kalıp baskı Hizmeti</td><td>Proto labs</td><td>Özel</td><td></td></tr> <tr><td>https://www.protolabs.com/ NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2770</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>VWR</td><td>16777-164P</td><td></td></tr><tr><td>Eğirme diski konfokal mikroskop</td><td>Solamere Teknoloji Grubu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>184 SIL ELAST KIT&nbsp;</td><td>PDMS kiti</td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9935</td><td></td></tr></tbody></table>

chemoattractant degradelere multi-hücresel tepkiler 3d analizi

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

2D hücre kültürü sistemlerinin çeşitli sınırlamaları, canlı dokuların uzamsal ve kimyasal karmaşıklığını daha iyi taklit eden ve in vivo doku fonksiyonlarını taklit etmek üzere 3D hücre kültürü ve analiz platformlarına ilgi uyandırdı. Mikrofabrikasyon teknolojilerinde son gelişmeler, hücrelerin iyi tanımlanmış bir ekstrasellüler matrisin (ECM) ve tanımlanan çözünür veya matris ilişkili biomolecules setine entegre edilebilir 3D in vitro ortamlarda gelişimini kolaylaştırmış. Ancak teknolojik engelleri araştırma laboratuvarlarında yaygın kullanımı sınırlıdır. Burada, 3 boyutlu kültür ve hücre ile deney için basit cihazlar oluşturmak için bir yöntem tarif ve 3D mikro ortamlarda çok hücreli organoids tanımlı bir kemoçekici gradyan ile. Biz bu platformun epitelyal hücrelerin ve organoidlerin epidermal büyüme faktörü (EGF) gibi büyüme faktörlerinin degradelere tepkisini analiz etmek için kullanımını göstermektedir. EGF degradeler, meme organoidlerde yönlendirilmiş şube oluşumuna yol açan birkaç gün boyunca cihazlarda istikrarlı oldu. Bu analiz bize hücre grupları tarafından toplu degrade algılama daha hassas vs tek hücreler sonucuna izin verdi. Ayrıca fotolitografi tesisleri veya gelişmiş yumuşak litografi teknikleri gerektirmeyen imalat yöntemini de tarif ediyoruz. Bu yöntem, kanser dahil olmak üzere kalkınma ve patolojik devletlerin Analizi bağlamında 3D hücresel davranışları incelemek için yararlı olacaktır.

EGF, meme bezlerinde morfojenin dallanma ve invaziv kanser büyümesinde memenin epitelyal hücrelerinin göçüne rehberlik eden kritik bir kemoçekicinin temel düzenleyicisidir. Yukarıda açıklanan mezoskopik fluidik cihazları, hücrelerin tanımlanabilen EGF degradeleri (Şekil 1a, B)10' a yanıtını incelemek için kullandık. Cihaz 5 mm genişliğinde, 10 mm uzunluğunda ve 1 mm boyunda bir kültür alanı verir. Kültür alanının kenar...

Biz 3D kültür ve hücreler ve çok hücreli organoids ile deney için cihazlar oluşturmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu cihaz, tanımlanan kemoçekici degradeler ile 3D mikro ortamlarda çözünür sinyallere hücresel tepkiler analizi sağlar. Organoids zayıf gürültülü girişleri tespiti tek hücrelerden daha iyidir.

Chemoattractant degradelere Multi-hücresel tepkiler 3D Analizi

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...

Basitleştirilmiş 2D in vitro kültürlerile 3D doku benzeri ortamlardaki farklılıklar, canlı dokuların mekansal ve kimyasal karmaşıklığını temsil eden 3D sistemlere olan ilgiyi artırmıştır. Üretim süreci tesis veya fotolitografi teknikleri gerektirmez. Ancak, 3D PDMS cihazı 3D fizyolojik ortam uygulamaları için gerekli vektörleri içerir.Mezofluidic cihaz hazırlanması için, polidimethylsiloxane veya PDMS cihazı için kalıbın maskesini tasarlamak ve termostata dayanıklı reçine sahip stereo litografi ekipmanı kullanarak kalıbı yazdırmak için uygun bir üç boyutlu bilgisayar destekli tasarım yazılımı programı kullanın. Kalıp hazır olduğunda, kabaca 10-1 oranında bir kür maddesi ile kalıp başına PDMS monomer çözeltisi üç mililitre karıştırın ve bir saat boyunca bir vakum desiccator karışımı degas için bir vakum kullanın. Desiccation sonunda, kalıp yüzeyinden herhangi bir toz kaldırmak ve dikkatlice gazdan PDMS çözeltisi ile kalıp doldurmak için yapışkan bant bir parça kullanın.Daha sonra, kalıp oda sıcaklığında soğumasını izin vermeden önce iki saat boyunca 80 santigrat derecede PDMS tedavi. Kalıp dokunmak için soğutulduğunda, kalıp ve PDMS arasındaki sınırı kesmek ve dikkatle kalıp PDMS soymak için bir bıçak kullanın. PDMS'yi 22'ye 22 milimetrelik bir kapak kaymasını sığdıracak şekilde kırpın ve girişte bir delik aç.Düşük tiftik dokuları ve %70 etanol kullanarak cihazı ve coverslip'i silin ve cihazı büyük toz parçacıklarını gidermek için yeni bir yapışkan bant parçasıyla dab. Daha sonra PDMS cihazını otoklavlayın ve 121 santigrat derecede 8 dakika ıslak ve 15 dakika kurulayın ve parçaları birbirine bağlamadan önce bir doku kültürü başlığında beş dakika boyunca PDMS kısmının alt yüzeyini ve kapak lı kapağı bir doku kültürü başlığında beş dakika boyunca bir korona deşarj tabancası ile tedavi edin. Cihazı yüklemek için, ilk büyüme ortamı uygun bir hacimde ilgi hücreleri resuspend 1% penisilin ve streptomisin ve% 1 insülin-transferrin-selenyum-x ile takviye.Sonraki karışımı ile meme bezi hücre süspansiyon 50 mikrolitre 425 taze hazırlanmış nötralize kollajen çözeltisi mikrolitre ve kollajen hücre süspansiyon ile 200 mikrolitre pipet doldurun. Tüm oda dolana kadar PDMS cihazına giriş yoluyla süspansiyon enjekte ve büyüme ortamı ile her iki tarafta rezervuarları doldurmadan önce jelasyon neden olmak için bir saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derece inkuvatör cihaz yerleştirin ve konfokal görüntüleme kadar kuvöz cihaz dönmek. 3D görüntüleme ve niceleme için, bir konfokal mikroskosa canlı hücre görüntüleme kültür odası kurun ve sıcaklık ve karbondioksiti sırasıyla 37 santigrat derece ve %5'e önceden ayarlayın.Odayı nemleştirmek için görüntüleme odası rezervuarına su ekleyin, gerektiği gibi ıslak mendilleri odaya yerleştirin ve PDMS cihazını odaya yerleştirin. Degrade oluşumunda faktör kaynağı olarak rezervuarlardan birine epidermal büyüme faktörü ekleyin ve diğer rezervuarı mekansal olarak dereceli epidermal büyüme faktörü dağılımının gelişimi için bir lavabo görevi olarak bırakarak bırakalım. Daha sonra z destesinin aralığını ilgilendiren organoidlerin hacmini kapsayan ayarlayın ve görüntülemeye başlayın.Deneyin sonunda, organoidlerden veya tek tek hücrelerin göçünden yayılan dalların uzunluk ve açısını ölçmek için uygun bir görüntü analiz programı kullanın. Hem silico hem de in vitro testlerinde, hücre kültürü alanında, kaynak veya lavabo rezervuarlarının yenilenmeden yaklaşık iki gün süren, epidermal büyüme faktörü olan 6.4 kilodalton proteininin, nispeten kısa bir süre içinde hazırlandığı gibi kollajen içinde kararlı bir difüzyon bazlı degrade oluşturabileceğini düşündüren kararlı bir lineer epidermal büyüme faktörü gradyanı nın oluşumu ortaya konmuştur. Meme organoidleri, mililitrede 0,5 nanomolar olması için doğrusal degradeye epidermal büyüme faktörü eklenirse, üç gün boyunca yön seli olmayan 2.5 nanomolar epidermal büyüme faktörü varlığında birden fazla dal oluştururlar.Ancak, dal oluşumu önemli bir yön önyargısı gösterir. Dikkat, boşluk kavşak inhibitörleri eklenmesi degrade yanıt organoidlerin yeteneğini bastırır. Kollajen çözeltisinin pH jelasyon ve hücre canlılığı için önemlidir.Karıştırmadan önce kollajen nötralize edilmezse, hücre canlılığı düşük olacaktır. Bu yöntem daha gerçekçi doku modelleme karşılamak için uzatılabilir ve jel içinde bireysel hücrelerden vasküler ağ oluşumu nu barındırabilir.

3d-analysis-of-multi-cellular-responses-to-chemoattractant-gradients

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu protokol, chemoeffectors istikrarlı konsantrasyon gradyanlar bakteriyel kemotaksis soruşturma için bir mikroakışkan aygıt geliştirme açıklar.

Kararlı Konsantrasyon Degradeler Bakteriyel Kemotaksis miktarının mikroakışkan Aygıt

Eksplante hücreleri (gövde nöral krest hücreleri) göçü analiz etmek bir yaklaşım tarif edilmiştir. Bu yöntem, pahalı yumuşak, ve bu gibi ana gövde tepe nöral hücre kültürü içinde hücre-hücre etkileşimleri türetilmiş olanlar gibi, göç polarite hem chemokinesis ve diğer etkilerden kemotaksisi ayrım yapabilmektedir.

Bir Modifiye Zigmond Odası Testi kullanılarak Trunk Sinir Crest Hücre Göç Analizi

Bu video, hepsi çip üzerinde bir yöntem kullanılarak nötrofil kemotaksisi testini göstermektedir. Yöntem, immünomanyetik negatif seçim ve ardından bir mikroakışkan çip üzerinde kemotaksis testi ile nötrofillerin tam kandan doğrudan izolasyonuna izin verir.

Tam Kan Kullanılarak Hızlı Nötrofil Kemotaksisi Analizi için Mikroakışkan Çip Tabanlı Bir Yöntem

Canlı hücre göç çalışmaları için bir mikroskop odasında yapıştırıcı ve çözünür degradelerin montajı için bir yöntem tarif edilmiştir. Mühendislik ortamı çözümü degradelerle antifouling yüzeyleri ve yapıştırıcı parçaları birleştirir ve bu nedenle bir rehberlik ipuçları göreli önemini belirlemek için izin verir.

Floresan Mikroskobu ile Görüntüleme Hücre Göç Yapıştırıcı ve Çözünür Degradeler oluşturma

Fizyolojik Akış Koşullarında Sirkülasyon Hücre Kemokin-yönettiği Ekstravazasyon Eğitim Bir Roman Üç boyutlu Akış Odası Cihazı

Hücre göçü, insan gelişiminin ve yaşamının önemli bir parçasıdır. Hücre göçünü değiştirebilecek mekanizmaları anlamak için, mevcut tahlillerin modern difüzyon odası sınırlamalarının üstesinden gelmeye izin veren bir 3D kollajen matrisinde kemotaksisi araştırmak için düzlemsel bir gradyan difüzyon sistemi sunuyoruz.

Planar Gradient Difüzyon Sistemi 3D Kollajen Matrix Kemotaksis Araştırma

Görsel kemotaksis deneyleri kemoatraktan aracılı yönlü hücre göçü nasıl kontrol ökaryotik hücreler daha iyi anlaşılması için gereklidir. 1) Gerçek zamanlı, çoklu kemotaksis deneyleri yüksek çözünürlüklü izleme ve 2) aynı anda kemoatraktan degrade görselleştirmek ve nötrofil gibi HL60 hücrelerinde sinyal olaylarının zamanmekansal dinamiği: Burada ayrıntılı yöntemler açıklanmaktadır.

Görüntüleme G Nötrofil gibi HL60 Hücreleri Kemotaksis ve Sinyal Olaylar Reseptör aracılı Protein-çiftli

Bu makale, tam kandan alınan çipte nötrofil izolasyonunu ve kemotaks testini tek bir mikroakışkan yonga üzerine entegre ederek hızlı bir nötrofıl kemotaksis tahlilini gerçekleştirmek için ayrıntılı bir yöntem sunmaktadır.

Hızla Nötrofil Kemotaksis Analizinde Doğrudan Bir Damla Kan Alınacak Bütünleşik Çip Yöntemi

Burada akut mekanik stimülasyon hücresel yanıt değerlendirmek için yöntemleri açıklanmaktadır. Mikroskopi tabanlı tahlil fluorescently etiketli biyosensörler kesme akışı ile kısa stimülasyon takip yerelleştirilmesini inceleyin. Ayrıca akut mekanik stimülasyon karşılık olarak ilgi çeşitli proteinlerin aktivasyonu biyokimyasal olarak test ediyoruz.

Dictyostelium discoideum yanıt-e doğru akut mekanik stimülasyon değerlendirilmesi

Gelişimkolektif hücre göçü, yara iyileşmesi, ve kanser metastazı genellikle büyüme faktörleri veya sinyal moleküllerinin gradyanları tarafından yönlendirilir. Burada açıklanan bir mikroakışkan sistem ve biyokimyasal gradyan altında kolektif göç mekaniği ölçmek için nasıl bir gösteri ile çekiş mikroskobu birleştiren deneysel bir sistemdir.

Kemotaktik Kolektif Göç için Mikroakışkanlarla Entegre Çekiş Mikroskobu

Keşfedin, 3D PDMS cihazları kullanarak kemotaktik gradyanlara karşı çok hücreli organoid yanıtlarını nasıl analiz edeceğinizi. Bu yöntem, hücre davranışlarını ve zayıf sinyal algılamasını in vivo benzeri ortamlarda çalışmanıza olanak tanır.

Chemoattractant degradelere Multi-hücresel tepkiler 3D Analizi

Daha fazla video keşfet