Büyük Ölçekli Nükleer Etkileşimom Profilleme için Etiketsiz İmmünoprekütle Spektrometresi İş Akışı

Bu proteomik iş akışı, endojen protein-protein etkileşimlerinin hücre altı çözünürlüğü ile tarafsız olarak tanımlanmasını ve haritalanmasını sağlar. Bu teknik, dozaj duyarlı yem proteinleri araştırırken özellikle avantajlıdır, düşük bolluk, ya da birden fazla hücre altı lokalizasyonu var. Bu yöntem, uygun bir yakınlık reaktifi mevcut olduğunu varsayarak endojen protein etkileşimleri haritalama uygulanabilir.

Bu, özellikle işlevi bilinmeyen binlerce protein için özellikle önemlidir, bunların çoğu insan hastalığı ile bağlantılı olmuştur. Bu yöntem herhangi bir hücre hattı veya doku subcellular fraksiyonu için uygun adapte edilebilir. Uygun bir afinite reaktifi olan herhangi bir protein hedeflenebilir.

Yakınlık arınma deneyleri için ortak bir sonuç genellikle sonuç değildir. Gerçekten iyi reaktifler, boyunca QC veri toplama ve örnek işleme sınırlayan tüm gerçekten önemlidir. Bir örneğin olduğunu bil.

Başlamak için, proteaz inhibitörleri veya fosfataz inhibitörleri ile soğuk tampon A 1X pelet hacmi 15 dakika boyunca hazırlanan hücre peletleri eritin. Hücre peletini içeren tüpü, 30 dakika boyunca yeniden askıya alınmasına yardımcı olmak için dört derece bir besleyiciye yerleştirin. Sonra pelet için 10 dakika boyunca 2, 000 kez g ve dört derece santigrat bir santrifüj tüp yerleştirin.

Supernatant decant ve 5X ile hücreleri yeniden askıya tampon A.Incubate ile 20 dakika buz üzerinde paketlenmiş hücre hacmi. Sonra, pelet tekrar 2, 000 kez g ve 10 dakika boyunca dört derece santigrat. Tampon decant ve proteaz inhibitörleri veya fosfataz inhibitörleri ile 2X orijinal paketlenmiş hücre hacmi tampon A ile resuspend.

Gevşek pestle A.Centrifuge 2, 000 kez g ve dört derece santigrat 10 dakika boyunca lysatge ile yaklaşık yedi kez dounce. Dikkatle yeni bir tüp ve flaş sıvı nitrojen ile dondurmak supernatant aktarın. Lysate eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Proteaz inhibitörleri veya fosfataz inhibitörleri ile tampon B 0.9X pelet hacmi ile pelet resuspend ve dört santigrat derece beş dakika boyunca bir nutator üzerinde karıştırın. Çekirdekleri lyse için, titrek pestle B.Mix bir nutator üzerinde 30 dakika boyunca 4 santigrat derece de böylece homojen olduğunu 20 kez dounce. Sonra 21, 000 kez g dört santigrat derece 30 dakika boyunca nükleer lysate santrifüj.

Pipet supernatant kapalı ve çözünür bir nükleer protein özü olarak kaydedin. Çözünür nükleer ekstresi diyalize çekmek için, ilk olarak 24 milimetre genişliğinde diyaliz borusu ile sekiz kilodalton moleküler ağırlık kesme ile uygun bir uzunlukta kesti. Tüpün bir tarafını kenetle ve nükleoplazmı boruya yükleyin.

Lysate yüklendikten sonra, diğer ucunu kelepçeleyin ve proteaz inhibitörleri ile tampon C içeren temiz bir cam kap içine batırın. Dört santigrat derecede üç saat diyaliz. Bundan sonra, 30 dakika boyunca 4 santigrat derece de 21, 000 kez g bir tüp ve santrifüj içine diyaliz nükleer özü nükleoplazm aktarın.

Nükleer ekstresin üç 20 mikrolitrelik aliquot'unu batı lekesinin fraksiyonu için yeni mikrosantrifüj tüplere aktarın. Ucunda kesilmiş olan pipet uçlarını kullanarak, 12,5 mikrolitre boncuk hacmini 12,5 mikrolitrelik Protein A Sepharose'u mikrosantrifüj tüplerinde Protein G Sepharose mikrolitreleriyle birleştirerek her çoğaltma için bir protein A/G boncuk karışımı hazırlayın. A/G boncuk karışımını 300 mikrolitre IP tamponu i.Spin boncukları 1, 500 kez g'de dört santigrat derecede bir dakika boyunca iki kez yıkayın ve tamponu decant.

Sonra, antikor proteinA / G boncuk hazırlamak. Antikor boncuklar bağlamak için, tüp 300 ip tampon I mikrolitre ve istenilen antikor 10 mikrogram ekleyin. Boncuk-antikor karışımı bir gecede dört derece santigrat bir nutator üzerinde rock izin verin.

Şimdi nükleer lysates uygun hacimleri düşük tutma mikrosantrifüj tüpler iperatör başına protein girişi bir miligram için. 30 dakika boyunca 16,000 kez g lysate spin ve yeni bir tüp için supernatant aktarın. 10 ila 15 dakika boyunca dört santigrat derecede bir fındık üzerinde nükleer lysate ve kaya her miligram için mikrolitre başına 250 adet Benzonaz bir mikrolitre ekleyin.

Lysate önceden temizlenmesi için boncuk hazırlamak için, 1,5 mililitre düşük tutma tüpleri için her protein A ve protein G boncuk 12,5 mikrolitre ekleyin. Proteaz inhibitörleri ile IP yıkama tampon I ile iki kez yıkayın. Tampon decant ve boncuk lar için hazırlanan nükleer lysate bir miligram ekleyin.

Dört santigrat derecede bir saat boyunca bir nutator üzerinde sallanan iken kuluçka. Önceden temizlenmiş lysates 1, 500 kez g ve dört derece santigrat bir dakika için santrifüj. Daha sonra antikor proteini A veya G boncukları proteaz inhibitörleri ile IP tampon I ile iki kez yıkayın.

1, 500 kez g ve dört santigrat derece bir dakika santrifüj sonra, tampon decant. Şimdi önceden temizlenmiş nükleer lysate antikor proteini A veya G boncuk üzerine aktarın. Dört saat boyunca dört santigrat derecede bir nutator üzerinde sallanan iken kuluçka.

Kuluçkadan sonra, santrifüj 1, 500 kez g ve bir dakika için dört derece santigrat. Supernatant'ı her çoğaltma için akış olarak etiketlenmiş tüplere aktarın. Antikor proteini A veya G boncukları bir mililitre IP tampon II ile proteaz inhibitörleri ile dört kez yıkayın.

Sonra proteaz inhibitörleri ile IP tampon I bir mililitre ile boncuk iki kez yıkayın. Son yıkamadan sonra tüm arabellek kaldırıldığından emin olun. PH 2.75 her bir nutator üzerinde 30 dakika boyunca 0.1 molar glisin 20 mikrolitre ile kuluçka yada tarafından boncuk kapalı elute protein.

Sonra 750 kez g ve dört derece santigrat bir dakika ve pipet supernatant kapalı spin. Bu kuluçka yı ikinci kez elüsasyon tamponu ile tekrarlayın. Protein peletini hazırladıktan sonra, 30 mikrolitre SDS alkililasyon tamponu ile yeniden askıya alın.

Örneği 95 derecelik bir ısı bloğunda beş dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra oda sıcaklığında 15 dakika soğumaya bırakın. Her numuneye 300 mililitre UA çözeltisi ve 30 mikrolitre 100 milimolar TCEP ekleyin.

Çözeltiyi 30K santrifüj filtresine yükleyin. Santrifüj filtreyi oda sıcaklığında 21,000 kez 10 dakika döndürdükten sonra, filtrede bir sorun olması durumunda akışı koruyun. Filtreyi el yazmasına göre yıkadıktan sonra, 0,1 molar Tris pH 8.5'te mikrolitre başına bir mikrogram ekleyin.

100 mikrolitre işaretine kadar olan filtreleri 0,1 molar Tris pH 8,5 ile doldurun. Bir nutator üzerinde sallanan ise 37 santigrat derece bir saat sindirmek için izin verin. Daha sonra, mikrolitre MS sınıfı tripsin başına bir mikrogram ekleyin.

Hafifçe karıştırın ve bir nutator üzerinde sallanan ise 37 santigrat derece bir gecede örnek ile inkübün için trypsin sağlar. Sabahları, 21,000 kez g 20 dakika boyunca temiz bir düşük tutma mikrosantrifüj tüp içine filtreden peptidler temizlemek için birden fazla kez santrifüj. C18 spin kolonları kullanarak peptidleri tuzdan arındırdıktan sonra, liyofilize peptidlerin yedi mikrolitrede %0.1 TFA'da %5 asetonitrilin istilâsı.

Peptidlerin askıya alınmasından emin olmak için numuneyi üç dakika sonicate edin, sonra 10 dakika boyunca 14,000 kez g'de aşağı doğru döndürün. Numunenin %15-30'u analiz için sıvı kromatografi kütle spektrometresi sistemine yükleyin. Bu çalışmada, sadece boncuk kontrolü kullanılarak beş miligram HeLa nükleer ekstresinden triplicate immünoprepitasyonlar analiz edilmiştir.

Yem DYRK1A, yapılan IP-MS deneyinin güvenilir olduğunu gösteren kontrol üzerinde zenginleştirilmiş ilk üç protein arasında yer aldı. Yüksek güven interaktörleri arasında net bir ayrım gösterilmiştir ve saflaştırılmış proteinlerin %95'inden fazlası nonspesifik olarak tanımlanmıştır. Örneğin DYRK1A veri seti için, IREF etkileşim ortakları fc-A değerlerini 0,45 gibi düşük bir değer sunarak kontrol üzerinde çok düşük bir zenginleştirme yi temsil eder.

Buna göre, bu daha önce bildirilen etkileşimlerin çoğu üç FC-A eşiğinin altına düşerek bu veri kümesi içinde yanlış negatifler vardır. Her IREF etkileşiminin hesaplanan mutlak kopya sayısı, ip-MS tarafından bir etkileşim ortağının algılama düzeyleriyle hiçbir korelasyon göstermedi. FC-A'nın üçten büyük ve 0,9'dan büyük azizin kombine kullanımı yüksek güven interaktörlerlistesini altı proteine indirgedi.

Ancak, izole olarak üçten fazla FC-A kesiği uygulanırken, ağa sekiz ek protein eklendi. Bu protokolün en önemli kısmı immünopresipitasyon için antikor reaktifseçimidir. Bu iş akışını tamamlamadan önce seçiciliğin Batı lekeveya Coomassie doğrulaması önerilir.

Protein-protein etkileşimlerinin destekleyici kanıtları, tanımlanan interaktörlerin co-IP batı lekelenmesinden elde edilebilir. Protein kimyasal çapraz bağlama, daha karmaşık olsa da, interaktörlerin etkileşim etki alanlarını ortaya çıkarabilir. Bu yöntemi kullanarak, benim araştırma grubu DYRK1A, bir protein kimyaz memeli beyin gelişimi için gerekli ve Alzheimer hastalığı nöropatoloji ile bağlantılı için yeni fonksiyonlar ortaya çıkardı.