İnsan İdrar Türemiş Hücrelerden Elde Edilen Doğrudan Yeniden Programlanmış Miyotüplerde Ekson Atlama

İdrisden türemiş hücrelerin miyotüplere doğrudan yeniden programlanması için yeni bir protokol oluşturduk. Bu in vitro modelleme bize Duchenne musküler distrofi ile hastadan türetilen miyotüpler de ekson atlama değerlendirmek sağlar. Biz 3-deazaneplanocin A hidroklorür, DZnep, histone metiltransferaz inhibitörü önemli ölçüde kısa bir süre içinde miyotube içine UDCs doğrudan tarama teşvik edebilir keşfetti.

Bu yeni otolog UDC tabanlı hastalık modelleme çeşitli kas hastalıkları için uygulama hassas ilaç yol açabilir. Başlamak için, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 400 x g tüm idrar örneği santrifüj. Sonra, tüpte bir mililitre bırakarak supernatant aspire.

Kalan bir mililitre idrarda peletleri ayrı ayrı askıya alın. Tek bir 50 mililitrelik tüp bu toplamak ve tüp yıkama tampon 10 mililitre ekleyin. Numuneleri 200 x g'de oda sıcaklığında 10 dakika santrifüj edin.

Tüpte 0.2 mililitre bırakarak süpernatant aspire. Hücre peletlerini 4,5 mililitre birincil ortamda yeniden askıya alın. Jelatin kaplı altı kuyu plaka, iyi başına hücre süspansiyon 1,5 mililitre üç kuyuhücreleri tohum.

Kültür 37 derece santigrat ve% 5 karbondioksit. Üç gün boyunca her gün birincil orta 1,5 mililitre ekleyin. Dördüncü gün, el yazmasında açıklandığı gibi 1,5 mililitre büyüme ortamı ile orta değiştirin.

Dördüncü günden sonra, UDC kültürü %80 ila %90'lık bir aksanına kadar her gün eklenen büyüme ortamını değiştirin. Sonra orta çıkarın ve PBS ile hücreleri yıkayın. Hücreleri %0.25 tripsin-EDTA kullanarak bölün.

Hücreleri 3,000 ila 5, 000 hücre kare santimetrelik bir yoğunlukta, 60 milimetrelik yeni bir jelatin kaplı tabağa yerleştirin. UdC'leri 3,000 ila 5, 000 hücre kare santimetre kare lik bir jelatin kaplı 60 milimetrelik bir tabağa yerleştirin ve kabı kuvöze yerleştirin. Tohumlamadan 24 saat sonra, 200 enfeksiyon çokluğu ile çözülmüş retrovirüs ile hücreleri enfekte.

Mililitre başına 8 mikrogram hexadimethrine bromür konsantrasyonu ile taze orta kullanın. 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitle 24 saat kuluçkaya yat. MYOD1 transduced hücreleri seçmek için, puromisin mililitre başına bir mikrogram içeren taze büyüme ortamı ile kültür ortamı değiştirin.

7-10 gün boyunca her gün orta değiştirmeye devam edin. MIOD1 transduced UDC'leri kollajen kaplı çok kuyulu bir plakaya koyun. Hücreleri 24 saat kuluçkaya yattıktan sonra, büyüme ortamını el yazmasında açıklanan farklılaşma ortamına değiştirin.

Üç gün sonra, DZNep olmadan taze diferansiyasyon ortamı için farklılaşma ortamı değiştirin. Her üç günde bir ortamı değiştirmeye devam edin. Antisense oligonükleotiti MYOD1 transdükse UDC'lerine dönüştürmek için ASO transfeksiyon reaktifini ve farklılaşma ortamını 1 ila 10 mikromonun son konsantrasyonuna karıştırın.

Ve kuyularda orta yerine bu karışımı kullanın. Plakayı 37 santigrat derece ve %5 nem de kuluçkaya yatırın. ASO ile 72 saatlik kuluçkadan sonra, ASO olmadan ortamı taze farklılaşma ortamına çevirin.

ASO transfeksiyonundan 3-7 gün sonra, farklılaşma ortamını çıkarın. UDC'leri PBS ile bir kez yıkayın ve hücre lisis arabelleği ekleyin. Bir RNA ekstraksiyon kiti kullanarak toplam RNA hasat.

RNA konsantrasyonu spektrofotometre ile ölçün. El yazmasında açıklandığı gibi, PCR tüplerinde tek adımlı RT-PCR reaktiflerini birleştirin. PCR tüplerini termocycler'a yerleştirin ve termocycler'ı çalıştırın.

Mikroçip elektroforezini gerçekleştirin ve ekson atlama verimliliğini hesaplayın. UDC'ler, ilköğretim kültürünün bir hafta içinde kolayca ve noninvaziv bir şekilde toplanmış ve koloniler oluşturmuştur. DZNep ile farklılaşma ortamındaki MYOD1 transfeced UDC'ler birbiriyle kaynaşabilir ve multinükleli miyotüpleri verimli bir şekilde oluşturabiliyordu.

RT-PCR, Duchenne musküler distrofisi olan hastalardan elde edilen MYOD1-UDC'lerde ekson atlayarak açıkça saptandı. Verimatlama ASO dozu bağlıydı. Doza bağımlı ekson atlama da Batı leke tarafından tespit edildi.

Distrofin inyoğunlukları ASO transfeksiyonundan bir hafta sonra floresan mikroskopla ölçüldü. ASO ile tedavi edilen MYOD1-UDC'lerde kontrolden belirgin olarak daha yüksek floresan sinyalleri gözlendi. Bu hastalıkların patofizyolojisinin anlaşılmasına yol açan her kas hastalığını modelleyebiliriz.