χCRAC Kullanarak Yüksek Zamansal Çözünürlükte Protein-RNA Etkileşim Dinamiğinin İn Vivo İzlenmesi

Kinetik CRAC, RNA ve RNA bağlayıcı proteinler arasındaki zamansal ilişkileri benzeri görülmemiş kısa bir zaman ölçeğinde incelemek için kullanılabilir. Çapraz bağlayıcımızla birleştirildiğinde, kinetik CRAC canlı hücreleri saniyeler içinde çapraz bağlayabilir. Bu, UV hasar tepkilerini azaltır ve stres tepkilerinin dakika ölçeğinde çözünürlükte incelenmesini kolaylaştırır.

Kinetic CRAC, yeni kullanıcılar için zorlayıcı olabilecek çok uzun bir protokoldür. Ek olarak, RNA ile çalışmak kendi zorluklarını da beraberinde getirir. RNA bozulmasını önlemek için, tüm solüsyonları filtrelemeli, sterilize etmeli ve pipetlerin ve laboratuvar tezgahının temiz tutulduğundan emin olunmalıdır.

Bu yöntemin görsel gösterimi çok önemlidir çünkü bazı adımlar çok sezgisel değildir. Bu, UV çapraz bağlanması ve hücrelerin toplanmasının yanı sıra jelden çapraz bağlı RNA'ların ekstraksiyonunu içerir. Çözelti içindeki mikroorganizmalar üzerinde UV çapraz bağlama gerçekleştirmek için, istenen ortamın 3,5 litresini maya ile 0,05'lik bir başlangıç OD 600'e aşılayın ve kültürü 180 rpm'de sürekli çalkalama ile gece boyunca 30 santigrat derecede büyütün.

Hücreler istenen OD'ye ulaştığında, 500 mililitre kültürü doğrudan Vari-X-bağlayıcı çapraz bağlayıcıya dökün ve 250 milijul 254 nanometre UV ile ışınlayın. Çapraz bağlamadan sonra, hücreleri filtrelemek için bir vakum filtreleme cihazı kullanın. Membranı filtrelenmiş hücrelerle sarın ve T0 etiketli 50 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin. Kalan hücreleri altı farklı filtreden geçirin ve zarları üç litre önceden ısıtılmış strese neden olan ortama bırakın ve 50 saniye boyunca bir pipetle kuvvetlice karıştırın. Hücreleri istenen zaman noktalarında 500 mililitrelik hacimlerde çapraz bağlamaya devam edin ve numuneleri eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Yapışık hücreleri çapraz bağlamak için, kuvars kültür kabını hücrelerle birlikte özel tepsiye aktarın ve 300 milijul 254 nanometre UV ile ışınlayın. Çanağı hemen buzun üzerine yerleştirin. Büyüme ortamını tabaktan çıkarın ve 10 mililitre buz gibi soğuk PBS ekleyin. Hücreleri kazıyarak toplayın ve 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.

Daha sonra hücreleri, dört santigrat derecede beş dakika boyunca 300 G'de santrifüjleme ile peletleyin. Hücreleri PBS ile yıkadıktan sonra, PBS'yi çıkarın ve hücre peletini kuru buz üzerinde dondurun. Numuneyi gerektiği kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Santrifüjü dört santigrat dereceye ayarlayın ve elüsyon için numune başına iki sıra 1,5 mililitrelik tüp hazırlayın. Boşluk hacminden kurtulmak için sütunları nikel boncuklarla hızlı bir şekilde döndürün. Daha sonra sütunları elüsyon tüplerinin ilk sırasına yerleştirin ve bunları 200 mikrolitre elüsyon tamponu ile doldurun.

İki dakika sonra, sütunları hızlı bir şekilde döndürün ve ikinci tüp sırasına aktarın. Ardından elüsyonu daha önce gösterildiği gibi tekrarlayın. Bittiğinde, tüm elüatları beş mililitrelik bir tüpte birleştirin ve mililitre glikojen başına iki mikrolitre 20 miligram ekleyin.

Daha sonra numuneye 100 mikrolitre trikloroasetik asit ekleyin ve 30 saniye boyunca girdaplayın. Numuneyi asetonla yıkadıktan sonra, 30 mikrolitre protein yükleme tamponunda tekrar süspanse edin. Ardından, Geiger sayacını kullanarak radyoaktiviteyi kontrol edin.

Numuneyi 65 santigrat derecede 10 dakika ısıtın ve bir milimetre dört ila %12 prekast Bis-Tris jeli üzerine yükleyin. Jeli MOPS tamponunda 125 voltta 90 dakika çalıştırın. Bittiğinde, jeli streç filme sarın ve bantla hafif sıkı bir kasetin içine sabitleyin.

Jeli oto radyografik filme maruz bıraktıktan sonra, jeli kaplayan streç filmi keserek, jeli hareket ettirmemeye ve görüntüyü kaydırmamaya dikkat ederek filmi geliştirin. Filmi jelin üzerine yerleştirin ve ilgilendiğiniz bandı çıkarın. Jel dilimini iki mililitrelik bir tüpe koyun ve bir P1000 pipet ucuyla ezin.

Daha sonra proteinaz K tamponu ve proteinaz K ekleyin. Numuneyi kuvvetli çalkalama ile 55 santigrat derecede inkübe edin. Kısa DNA parçalarının nicelleştirilmesi için uygun bir merdiven kullanarak, cDNA'yı bir saat boyunca 100 voltta prekast% 6 TBE jel üzerinde çalıştırın. Bittiğinde, jeli üzerini örtecek kadar TBE içeren sıvı geçirmez bir kaba koyun ve uygun miktarda SYBR Safe boya ekleyin.

Jeli oda sıcaklığında 15 dakika lekeleyin. Ardından SYBR içeren tamponu taze TBE ile değiştirin. Jeli hafifçe çalkalayarak 10 dakika yıkayın.

TBE'yi boşaltın ve jeli şeffaf bir klasöre yerleştirin. Klasörü uygun bir boyuta kesin ve jeli bir görüntü niceliği ile görüntüleyin. DNA parçalarını 175 ila 400 baz çifti arasında kesin ve jel parçasını 1.5 mililitrelik bir tüpe koyun.

Jeli bir P1000 pipet ucuyla parçalayın ve 400 mikrolitre su ekleyin. Daha sonra çalkalarken 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin. Numuneyi kuru buz üzerinde 10 dakika dondurun.

Ardından inkübasyonu 37 santigrat derecede tekrarlayın. Bir tüpe yerleştirilmiş bir filtre sütununun içine iki cam mikrofiber filtre yerleştirin. Ardından, TBE jel süspansiyonunu filtre ünitesine aktarmak için kesilmiş bir P1000 pipet ucu kullanın ve 30 saniye boyunca 17.000 G'de döndürün.

Bu protokol, glikoz açlığı çeken bir ortama maruz kalan maya hücrelerinde Nrd1-RNA etkileşimlerini izlemek için kullanıldı. Numuneler, glikoz olmadan ortama geçişten önce ve ayrıca bir, iki, dört, sekiz, 14 ve 20 dakika sonra çapraz bağlandı. Deneyden elde edilen otoradyograflar, Nrd1'in beklenen moleküler ağırlığında, dizileme için uygun olmayan kısa radyo etiketli RNA'lara bağlı proteini temsil eden yoğun bir sinyal gösterdi.

Daha uzun RNA parçalarına çapraz bağlı protein olan bu bandın üzerindeki sinyal izole edildi. Memeli hücreleri için kinetik CRAC protokolünü değiştirmek için, yapışık hücrelere sahip bulaşıkların UV ışınlamasına izin vermek için özel bir aşama geliştirilmiştir. Bu kurulumun verimliliği, kararlı bir şekilde etiketlenmiş GFP RBM7'nin çapraz bağlanması ve yakalanması yoluyla ölçüldü.

Çapraz bağlayıcı, yaygın olarak kullanılan bir UV ışınlama cihazıyla karşılaştırılabilir verimliliklerde 254 nanometre UV ışınlaması kullanarak memeli hücrelerinden protein RNA komplekslerini geri kazanmayı başardı. Çapraz bağlama sırasında UV geçirgen bir kuvars Petri kabının geliştirilmesi, protein RNA komplekslerinin geri kazanımını daha da artırdı. Nrd1 verileri, proteinin birçok kodlamayan RNA transkriptine bağlandığını gösterir ve bu transkriptlerin bozunmasında rol oynadığını gösterir.

Her ikisi de glikoz açlığı sırasında yukarı regüle edilen HXT6 ve HXT7'yi kodlayan transkriptlere bağlanma da gösterilmiştir. Kinetik CRAC, hücre gelişimi, stres tepkileri ve ribozom veya splisozom gibi makromoleküler komplekslerin montajı sırasında protein RNA'ları arasındaki dinamik etkileşimlerin ölçülmesine izin verir.