Name: Erken Drosophila Embriyosunda İmmünohistokimya ve RNA In-situ Dağılımı için Bir Protokol (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 34 s
Description: Öğrenin, Drosophila melanogaster embriyolarında protein ve RNA lokalizasyonunu incelemek için immünohistokimya ve in-situ hibridizasyon protokolleri. Bu yöntemler, gelişim biyolojisi araştırmalarında embriyo tutunmasını ve görüntülemeyi iyileştirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (#31771377 / 31571273 / 31371256), Ulusal Eğitim Bakanlığı'ndan Yabancı Seçkin Bilim İnsanı Programı (#MS2014SXSF038), Ulusal Eğitim Bakanlığı Merkez Üniversiteleri Araştırma Fonu (#GK201301001 / 201701005 / GERP-17-45) tarafından desteklenmiştir ve XZ, Shaanxi İl Eğitim Departmanının Anahtar Programı (#2019TS082 / 2019TS079), Üstün Doktora Tezi Fonu (#20JS138 / 2019TS079) tarafından desteklenmektedir. Shaanxi İl Bilim ve Teknoloji Bölümü Doğa Bilimleri Temel Araştırma Programı Gençlik Projesi (#2020JQ-885).

1. Üzüm suyu agar tabaklarının hazırlanması
<ol><li>150 mL damıtılmış suya 5 g agar ve 5 g sakkaroz ekleyin. Agar ve sakkaroz tamamen çözünene kadar bir mikrodalga kullanarak kaynatın. 50 mL% 100 üzüm suyu ve çözeltiyi birlikte karıştırın.</li>
	<li>Son konsantrasyonu% 0.5 propiyonik aside yapmak için 1 mL% 100 propiyonik asit ekleyin. Hazırlanan çözeltinin 25 mL'sini her plakaya dökün. Agar katılaştıktan sonra, ortamı 4 ° C'de saklayın.</li>
</ol>2. Kaplama slaytları
<ol><li>Slaytlara deterjanla ön işlemden geçirin. Slaytları 3 kez musluk suyuyla ve bir kez damıtılmış suyla yıkayın. Daha sonra slaytları 45 °C fırında 2 saat kurutun.</li>
	<li>Slaytları 24 saat boyunca yaklaşık 450 mL potasyum dikromat sülfürik asit çözeltisine (20 g potasyum dikromat, 40 mL damıtılmış su ve 400 mL konsantre sülfürik asit) batırın. Slaytları 3 kez musluk suyuyla ve bir kez damıtılmış suyla yıkayın.<ol>
<li>Slaytları 45 °C fırında iki saat kurutun. 2 saatten fazla bir süredir% 95 etanol içine daldırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1 L damıtılmış suya 0.5 g krom potasyum sülfat ve 5 g jelatin ekleyin. Kullanmadan önce 60 °C'lik bir su banyosunda çözün. Krom şap jelatini 4 °C'de uzun süre saklanabilir.</li>
	<li>Slaytın üzerine 10 μL krom şap jelatini bırakın ve slaytın tüm yüzeyini çözelti ile tamamen ve eşit şekilde örtün. Slaytı jelatin tarafı yukarı bakacak şekilde 48 saat boyunca 42 °C'de bir fırına yerleştirin. Hazırlanan slaytlar daha sonra kullanılmak üzere 4 °C'de saklanabilir. NOT: Bu kritik bir adımdır. Tam kaplama gereklidir. Meyve sineği ve embriyosu için, bu slayt kaplama yaklaşımı polilizin kaplamadan daha verimli görünmektedir.</li>
</ol>3. Drosophila embriyo gömme
<ol><li>
Drosophila embriyo koleksiyonu NOT: Drosophila embriyolarını 0-2 saat (sinsityal blastoderm), 2-3 saat (hücresel blastoderm), 3-12 saat (erken gastrula) ve 12-24 saat (geç gastrula) olmak üzere dört periyotta topladık18. Ana embriyo tiplerinin her dönemdeki oranı Tablo 1'de gösterilmiştir.<ol>
<li>Plastik bir toplama şişesine 400-500 sinek yerleştirin ve şişeyi maya özü içeren üzüm suyu agar plakasıyla örtün. Drosophila embriyoları oda sıcaklığında üzüm suyu agar üzerine serilir.</li>
		<li>Embriyoları yüzdürmek için her plakaya nazikçe 2 mL PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCL, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4) ekleyerek dört dönem embriyo toplayın. Yaklaşık 200 embriyoyu 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve embriyoları yerleştirmek için 2 dakika boyunca buz üzerinde tutun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ön gömme<ol>
<li>200 Drosophila embriyosunu 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Embriyoları yerleştirmek için tüpü 2 dakika boyunca buz üzerinde tutun ve ardından süpernatantı pipetle dikkatlice atın. Tüpe 1 mL% 50 ağartıcı ekleyin ve 2 dakika boyunca hafifçe çalkalayın. NOT: Ağartıcı taze hazırlanmalıdır ve ağartıcı miktarı toplanan embriyo miktarına bağlı olarak değişebilir.</li>
		<li>Embriyoları filtre kağıdına dökerek yavaşça toplayın ve her seferinde 1 mL PBS ile 3 kez yıkayın.</li>
		<li>Embriyoları filtre kağıdı ile yaklaşık 5 mL n-heptana aktarın.</li>
		<li>Karışımı taze bir 1,5 mL santrifüj tüpüne aktarın. 1 mL metanol ekleyin ve hafifçe sallayın. Sedimantasyondan sonra embriyoları toplayın.</li>
		<li>Süpernatantı çıkarın ve embriyoları 1 mL PBS'de 3-5 kez yıkayın.</li>
		<li>Embriyoları 30 dakika boyunca 400 μL Bouin çözeltisi (% 71 doymuş pikrik asit,% 24 formalin,% 5 asetik asit) ile sabitleyin. Sabit embriyoları her seferinde 5 dakika boyunca 1 mL PBS'de 3 kez yıkayın.</li>
		<li>Embriyoları toplamak için, numuneleri bir lastik tıpaya aktarın ve PBS'yi çıkarın.</li>
		<li>% 1.2 agaroz-PBS çözeltisi hazırlayın ve çözeltiyi 60 ° C'de tutun. Bir agar bloğuna sabitlemek için embriyolara 200 μL% 1.2 agaroz-PBS çözeltisi ekleyin.</li>
		<li>Bloğu tıpadan çıkarın ve bloğu PBS'de saklayın. NOT: Ön gömme yaklaşımı sırasında, ısınma yanlısı başarılı olmak için kritik öneme sahiptir. Bu adımda kullanılacak santrifüj tüplerinin ve mikropipet uçlarının çalışmadan önce tamamen ön sıcak olmasını şiddetle tavsiye ederiz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Parafin gömme<ol>
<li>Önceden gömülü agar bloğunu her biri 15 dakika boyunca% 35 etanol,% 50 etanol,% 75 etanol ve% 85 etanol içine batırın. Daha sonra% 95 etanol ve% 100 etanol içine 2 kez daldırın. NOTLAR: Her birinin yaklaşık 5-10x blok hacmi ve ardından bloktaki embriyo sayısına bağlı olarak 15-30 dakika boyunca derecelendirilmiş bir fiksatif gereklidir.</li>
		<li>Embriyo bloğunu 15 dakika boyunca% 100 etanol ve ksilen (1: 1 oranında) çözeltisine batırın.</li>
		<li>Embriyo dokusunu şeffaf hale getirmek için bloğu 1 dakika boyunca ksilen'e aktarın.</li>
		<li>Bloğu 30 dakika boyunca ksilen ve parafin (1: 1 oranında) içine batırın.</li>
		<li>Bloğu her seferinde 2 saat boyunca parafin I, parafin II ve parafin III'e batırın.</li>
		<li>Gömme kutusunu önceden parafin ile doldurun ve ardından bloğu yavaşça ve yatay olarak gömme kutusunun altına aktarın. Parafin doğal olarak katılaştıktan sonra, katılaşmış parafin bloğu 4 ° C'de saklanabilir. NOTLAR: Önceden gömülü numune, aşağıdaki adımları izleyerek kriyokesitte kullanılabilir. Embriyolar yukarıda tarif edildiği gibi agaroz ile önceden gömüldükten sonra, örnekler basitçe OCT Bileşiğine gömülür. Daha sonra rutin kriyüsit protokolüne göre kriyoseksiyon yapılabilir. Daha sonra kesitlerde düzenli boyama yaklaşımları kullanılabilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Hematoksilin-eozin boyama
<ol><li>Drosophila embriyo bölümlerini hazırlayın. Hazırlanan bölümleri 15 dakika boyunca 60 ° C'de bir fırına yerleştirin ve ardından bölümleri her biri 10 dakika boyunca 2 kez ksilen içine batırın. Bölümleri 2 dakika boyunca% 100 etanol ve ksilene (1: 1 oranında) içinde bir kez batırın.</li>
	<li>Bölümleri %100 etanol I, %100 etanol II, %95 etanol, %85 etanol, %75 etanol, %50 etanol ve damıtılmış suda 3 dakika nemlendirin.</li>
	<li>Bölümleri hematoksilin çözeltisi ile 2 dakika boyunca sabitleyin. Slaytları% 1 asit alkol çözeltisine (1 mL hidroklorik asit, 100 mL% 70 etanol) hızlı bir şekilde batırın ve slaytları damıtılmış suda yıkayın.</li>
	<li>Slaytları sırasıyla% 50 etanol,% 75 etanol,% 85 etanol ve% 95 etanol içine batırın.</li>
	<li>Bölümleri 1 dakika boyunca eozin çözeltisi ile sabitleyin.</li>
	<li>Slaytları her seferinde 1 dakika boyunca% 95 etanol I,% 95 etanol II,% 95 etanol III,% 100 etanol I,% 100 etanol II ve% 100 etanol III içinde kurutun.</li>
	<li>Her seferinde 5 dakika boyunca %100 ksilen I, %100 ksilen II ve %100 ksilen III slaytlarını temizleyin.</li>
	<li>Slaytları üreticinin talimatlarına göre nötr balsamla monte edin.</li>
</ol>5. Periyodik asit-gümüş metenamin boyama
<ol><li>Drosophila embriyosunun parafin bölümlerini damıtılmış suya deparafinize edin ve nemlendirin.</li>
	<li>Bölümleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca% 1 periyodik asit içinde oksitleyin.</li>
	<li>Slaytları damıtılmış suda her biri 1 dakika boyunca 3 kez durulayın.</li>
	<li>Slaytları yaklaşık 40 mL taze filtrelenmiş gümüş metenamin çalışma çözeltisinde (% 3 metenamin,% 5 gümüş nitrat,% 5 sodyum borat çözeltisi) 60 ° C'de 1 saat ve 20 dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra slaytları damıtılmış suda 1 dakika durulayın.</li>
	<li>Slaytları 2 dakika boyunca% 0.2 altın klorür içinde tonlayın ve ardından slaytları 1 dakika damıtılmış suda durulayın.</li>
	<li>Slaytları 3 dakika boyunca% 3 sodyum tiyosülfat içine yerleştirin ve ardından slaytları 1 dakika boyunca damıtılmış suda durulayın.</li>
	<li>Hematoksilin içindeki slaytları 30 sn boyunca karşı boyayın. Slaytları akan musluk suyunda 3-5 dakika yıkayın.</li>
	<li>Slaytları her biri 5 dakika boyunca% 70 etanol,% 80 etanol,% 95 etanol I,% 95 etanol II,% 95 etanol III,% 100 etanol I ve% 100 etanol II'de kurutun.</li>
	<li>Slaytları %100 ksilen I, %100 ksilen II ve %100 ksilen III olarak her biri 5 dakika boyunca temizleyin.</li>
	<li>Slaytları üreticinin talimatlarına göre nötr balsamlara monte edin.</li>
</ol>6. İmmünohistokimya
<ol><li>Standart protokolü izleyerek Drosophila embriyosunun parafin kesitlerini PBS'ye deparaffinize edin ve rehidratlayın19.</li>
	<li>Slaytları oda sıcaklığında 10 dakika boyunca metanol içinde% 0,3 H2O2 ile tedavi edin ve ışıktan kaçının.</li>
	<li>Uygun antijen alma tamponunu, sebze buharlı pişiricideki slaytlarla birlikte bir kapta yaklaşık 100 ° C olacak şekilde önceden ısıtın. Kabın ayrıca bir kapağı olmalıdır. Slaytları kaba koyun. Vapurun kapağını kapatın.<ol>
<li>Kabı bu noktadan itibaren 20 dakika boyunca vapurda tutun. Sürgülü kabın kapağının tamamen sıkılmaması gerektiğini unutmayın, böylece buharlama işlemi sırasında su buharı girebilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Her biri 5 dakika boyunca 3 kez PBS-T'DE (ARA-20, pH 7.2 ile PBS) hafifçe durulamadan önce slaytların oda sıcaklığına geri dönmesine izin verin ve ardından slaytları PBS'de her biri 1 dakika boyunca 3 kez durulayın.</li>
	<li>Slaytları PBS'de oda sıcaklığında 60 dakika boyunca %1 sığır serum albümini (BSA) ile bloke edin.</li>
	<li>Slaytları primer antikor (1:1000'de anti-FKBP12) ile gece boyunca 4 ° C'de veya 4 saat oda sıcaklığında inkübe edin.</li>
	<li>Slaytları PBS-T'de her biri 5 dakika boyunca 4 kez yıkayın.</li>
	<li>Slaytları, ikincil antikorlarla (anti-Tavşan, 1:5.000) konjuge HRP etiketli polimer ile oda sıcaklığında 90 dakika boyunca uygulayın. Fotoğraf ağartmasını önlemek için bunu karanlıkta yapın.</li>
	<li>Slaytları PBS-T'de her biri 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın.</li>
	<li>Reaksiyon ürünlerinin rengi mikroskop altında uygun olana kadar slaytları% 5 3,3'-diaminobenzidin-tetrahidroklorür (DAB) ile 2-10 dakika boyunca inkübe edin.</li>
	<li>Hematoksilin içindeki slaytları 30 s boyunca karşı lekeleyin ve slaytları damıtılmış suda her biri 5 dakika boyunca 2 kez yıkayın.</li>
	<li>Slaytları her biri 1 dakika boyunca% 50 etanol,% 70 etanol,% 90 etanol,% 95 etanol ve% 100 etanol içinde kurutun.</li>
	<li>Slaytları %100 ksilen I, %100 ksilen II ve %100 ksilen III olarak her biri 5 dakika boyunca temizleyin.</li>
	<li>Slaytları üreticinin talimatlarına göre nötr balsamlara monte edin.</li>
</ol>7. In-situ hibridizasyon
NOT: Drosophila embriyo kesitleri %0.01 dietil pirokarbonat (DEPC) ile arıtılmış su ile hazırlanmıştır. Yerinde hibridizasyon için kullanılan tüm aksesuarlar DEPC gece tedavisini önceden uygular.
<ol><li>Riboprob hazırlama<ol>
<li>5' çıkıntı oluşturan bir kısıtlama enzimi kullanarak klonlanmış uçtan aşağı yönde bir kısıtlama enzimi bölgesinde keserek şablon DNA'yı doğrusallaştırın. Doğrusallaştırmadan sonra, şablon DNA'sını fenol / kloroform ekstraksiyonu ve ardından etanol çökeltmesi yoluyla saflaştırın. Standart protokolleri kullanın.</li>
		<li>RNaz içermeyen bir santrifüj tüpüne 1 μg saflaştırılmış şablon DNA ekleyin. Santrifüj tüpünü buzun üzerine yerleştirin. Toplam hacim 13 μL'ye yeterli DEPC ile arıtılmış su ekleyin.<ol>
<li>Daha sonra aşağıdaki reaktifleri sırayla ekleyin: 2 μL 10x NTP etiketleme karışımı, 2 μL 10x transkripsiyon tamponu, 1 μL koruyucu RNaz inhibitörü, 2 μL RNA Polimeraz SP6 veya RNA Polimeraz T7.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Pipetleme ve santrifüj ile reaksiyonu kısa sürede karıştırın. 37 °C'de 2 saat inkübe edin. NOT: Daha uzun inkübasyonlar, etiketli RNA'nın verimini artırmaz. Reaksiyon tüpüne uygulanan kısa bir spin (~ 800 rpm), bir sonraki adıma geçmeden önce kritik öneme sahiptir. Bu dönüş, inkübasyondan oluşabilecek tüm içeriklerin tüpün dibine gelmesine izin verecektir.</li>
		<li>Şablon DNA'yı çıkarmak için 2 μL RNaz içermeyen DNaz I ekleyin ve 37 ° C'de 15 dakika boyunca inkübe edin.</li>
		<li>Reaksiyonu durdurmak için 2 μL 200 mM EDTA (pH 8.0) ekleyin. NOT: DIG etiketli RNA probları bir yıl boyunca etanolde -15 ila -25 °C'de saklanabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Drosophila embriyo bölümünün ön hibridizasyonu<ol>
<li> Drosophila embriyosunun bölümlerini 48 saat boyunca 42 °C'lik bir fırına yerleştirin.</li>
		<li>Slaytları 10 dakika boyunca iki kez% 100 ksilen içinde deparaffinize edin.</li>
		<li>5 dakika boyunca% 100 etanol,% 95 etanol,% 90 etanol,% 70 etanol ve% 50 etanol içine sırayla batırarak slaytları nemlendirin.</li>
		<li>Fiksatif çözelti / Bouin çözeltisini dokudan çıkarmak için PBS'deki slaytları 5 dakika 3 kez inkübe edin.</li>
		<li>Slaytları her biri 5 dakika boyunca 2 kez 100 mmol / L glisin / PBS çözeltisi ile yıkayın.</li>
		<li>Slaytları PBS ile her biri 5 dakika boyunca 2 kez yıkayın.</li>
		<li>Membranları geçirgenleştirmek için kızakları PBS'de %0,3 Triton X-100 ile 15 dakika boyunca inkübe edin.</li>
		<li>Slaytları PBS ile her biri 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın.</li>
		<li>Slaytları 15 μg / mL RNaz içermeyen proteinaz K'da 37 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.</li>
		<li>Sindirimi durdurmak için slaytları PBS'de% 4 paraformaldehit ile 3 dakika boyunca inkübe edin.</li>
		<li>Slaytları PBS ile her biri 5 dakika boyunca 2 kez yıkayın.</li>
		<li>Kızakları 100 mM trietanolamin tamponunda (pH 8.0) %0,25 (v/v) asetik anhidrit ile her biri 5 dakika boyunca 2 kez inkübe edin.</li>
		<li>Slayt nem odasına DEPC suyu ekleyin. Slaytlara 20 μL ön hibridizasyon çözeltisi (100 μg / mL somon sperm DNA'sı içeren) ekleyin. Slaytları slayt nem odasına yerleştirin. Slaytları 4 saat boyunca 42 ° C'de inkübe edin. NOT: Islak kutunun kapağının sızdırmazlığını sağlamak ve uçuculuğu ve hibridizasyon öncesi çözeltinin ve takip edilen hibridizasyon çözeltisinin dokusundan sapmayı önlemek için ıslak kutunun her zaman yatay olarak tutulması gerekir.</li>
	</ol></li>
	<li>Drosophila embriyo bölümünün hibridizasyonu<ol>
<li>Ön hibridizasyon çözeltisini çıkarın ve slaytları her biri 5 dakika boyunca 3 kez 0,2x SSC (150 mM sodyum klorür, 15 mM sodyum sitrat, pH 7,0) ile yıkayın. Doku örneklerinin etrafındaki fazla 0,2x SSC'yi silin.</li>
		<li>Bir pipetle 30 μL prob hibridizasyon çözeltisi (ön hibridizasyon çözeltisinde seyreltilerek 2-6 ng digoksin etiketli RNA probu içeren) uygulayın. Sürgü nem odasındaki kızakları 42 °C'de yaklaşık 20 saat boyunca inkübe edin. NOT: Son notanın önerisi olarak kapak sızdırmazlığından emin olun. Aksi takdirde, ön hibridizasyon veya ön hibridizasyon sızıntısından kaynaklanan kuruma, slaytlarda sözde pozitif de dahil olmak üzere kirli arka plan oluşturacaktır.</li>
	</ol></li>
	<li>Hibridizasyon<ol>
<li>Hibridizasyon çözeltisini çıkarın ve slaytları 37 ° C'de her biri 15 dakika boyunca 4 kez 4x SSC çözeltisiyle yıkayın.</li>
		<li>Slaytları 2x SSC çözeltisinde 20 μg/mL RNase A ile 37 °C'de 30 dakika boyunca yıkayın.</li>
		<li>Slaytları 1x SSC çözeltisinde 37 ° C'de 15 dakika boyunca yıkayın.</li>
		<li>Slaytları 0,5x SSC çözeltisinde 37 °C'de 15 dakika boyunca yıkayın.</li>
		<li>Slaytları 0,1x SSC çözeltisinde 37 ° C'de 15 dakika boyunca yıkayın.</li>
		<li>Slaytları PBS ile her biri 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın.</li>
		<li>Kızakları yıkama tamponunda (100 mM maleik asit, 150 mM NaCl, %0,3 (v/v) Ara 20, pH 7,5) 1 dakika boyunca yıkayın.</li>
		<li>Slaytları 100 mL'lik taze hazırlanmış bloke edici çözeltide (Tween 20 olmadan maleik asit tamponunda% 2 koyun serumu) 30 dakika boyunca inkübe edin.</li>
		<li>Slaytları 45 dakika boyunca 20 mL antikor çözeltisinde inkübe edin.<ol>
<li>Her kullanımdan önce antikoru orijinal şişede 10.000 rpm'de 5 dakika boyunca santrifüj edin ve gerekli miktarı yüzeyden dikkatlice pipetleyin. Anti-digoxigenin-AP 1:5000 (150 mU/mL) blokaj çözeltisinde seyreltin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bağlanmamış antikor konjugatını çıkarmak için slaytları 100 mL yıkama tamponunda her biri 15 dakika boyunca 2 kez yıkayın.</li>
		<li>Kızakları 2-5 dakika boyunca 20 mL algılama tamponunda (100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 9,5) dengeleyin.</li>
		<li>Slaytları, slayt nem odasında 10 mL taze hazırlanmış renk substratı çözeltisi ile inkübe edin. Reaksiyon birkaç dakika içinde başlar ve 16 saat sonra tamamlanır. Renk gelişirken sallamayın veya karıştırmayın.</li>
		<li>Reaksiyonu durdurmak için slaytları 50 mL damıtılmış suyla 5 dakika yıkayın.</li>
		<li>Numuneyi gece boyunca karanlıkta kurulayın.</li>
		<li>Slaytları her biri 3 dakika boyunca% 70 etanol,% 80 etanol,% 90 etanol,% 95 etanol,% 100 etanol I ve% 100 etanol II'de kurutun.</li>
		<li>Slaytları %100 ksilen I, %100 ksilen II ve %100 ksilen III olarak her biri 20 dakika boyunca temizleyin.</li>
		<li>Slaytları nötr balzamla monte edin.</li>
		<li>Görüntüleri belgeleyin ve ters mikroskopi ve üretici yazılımı ile analiz edin. ImageJ kullanarak pozitif sinyalin yoğunluğuna göre uzunlamasına eksen boyunca veya embriyoların diferansiyel bölgesi içinde dağılım analizi yapın. NOT: Adım 7.4.12'deki taze hazırlanmış renk substrat çözeltisi ile inkübasyon sırasında, reaksiyon rengi çıplak gözle bile görülebilir. Renk gelişiminin stereoskop altında nasıl incelenebileceğine dair bu gözlem. Reaksiyon rengi makul olduğunda ve reaksiyonu durdurmak için 7.4.13 adımı gerçekleştirilebilir.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Weisleder, N., Ma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+Ca2%2B+sparks+in+aging+skeletal+and+cardiac+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Research+Reviews%22%5BJournal%5D)">Altered Ca2+ sparks in aging skeletal and cardiac muscle.</a> Ageing Research Reviews. 7 (3), 177-188 (2008).</li>
<li>Cheng, H., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Sparks%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Calcium Sparks.</a> Physiological Reviews. 88 (4), 1491-1545 (2008).</li>
<li>Fan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ryanodine+Receptors%3A+Functional+Structure+and+Their+Regulatory+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Ryanodine Receptors: Functional Structure and Their Regulatory Factors.</a> Chinese Journal of Cell Biology. 37 (1), 6-15 (2015).</li>
<li>Xu, X., Balk, S. P., Isaacs, W., Ma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling%3A+an+underlying+link+between+cardiac+disease+and+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+%26+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling: an underlying link between cardiac disease and carcinogenesis.</a> Cell & Bioscience. 8 (39), 1-2 (2018).</li>
<li>Xu, X., Bhat, M. B., Nishi, M., Takeshima, H., Ma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+of+cDNA+encoding+a+Drosophila+ryanodine+receptor+and+functional+studies+of+the+carboxyl-terminal+calcium+Release+Channel%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning of cDNA encoding a Drosophila ryanodine receptor and functional studies of the carboxyl-terminal calcium Release Channel.</a> Biophysical Journal. 78 (3), 1270-1281 (2000).</li>
<li>George, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+FKBP+family+protein%3A+evaluation%2C+structure%2C+and+function+in+mammals+and+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of FKBP family protein: evaluation, structure, and function in mammals and Drosophila melanogaster.</a> BMC Developmental Biology. 18 (1), 1-12 (2018).</li>
<li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syncytium+calcium+signaling+and+macrophage+function+in+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+%26+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Syncytium calcium signaling and macrophage function in the heart.</a> Cell & Bioscience. 8 (1), 1-9 (2018).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+and+CaSR%2FIP3R+in+prostate+cancer+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+%26+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Calcium and CaSR/IP3R in prostate cancer development.</a> Cell & Bioscience. 8 (1), 1-7 (2018).</li>
<li>Xu, M., Seas, A., Kiyani, M., Ji, K. S., Bell, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+temporal+examination+of+calcium+signaling+in+cancer-+from+tumorigenesis%2C+to+immune+evasion%2C+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+%26+Bioscience%22%5BJournal%5D)">A temporal examination of calcium signaling in cancer- from tumorigenesis, to immune evasion, and metastasis.</a> Cell & Bioscience. 8 (1), 1-9 (2018).</li>
<li>Shou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+defects+and+altered+ryanodine+receptor+function+in+mice+lacking+FKBP12%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cardiac defects and altered ryanodine receptor function in mice lacking FKBP12.</a> Nature. 391 (6666), 489-492 (1998).</li>
<li>Xin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oestrogen+protects+FKBP12.6+null+mice+from+cardiac+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oestrogen protects FKBP12.6 null mice from cardiac hypertrophy.</a> Nature. 416 (6878), 334-337 (2002).</li>
<li>Zalk, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+mammalian+ryanodine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of a mammalian ryanodine receptor.</a> Nature. 517 (7532), 44-49 (2015).</li>
<li>Ridgway, E. B., Gilkey, J. C., Jaffe, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+calcium+increases+explosively+in+activating+medaka+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Free calcium increases explosively in activating medaka eggs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (2), 623-627 (1977).</li>
<li>Gilkey, J. C., Jaffe, L. F., Ridgway, E. B., Reynolds, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+free+calcium+wave+traverses+the+activating+egg+of+the+medaka%2C+Oryzias+latipes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A free calcium wave traverses the activating egg of the medaka, Oryzias latipes.</a> Journal of Cell Biology. 76 (2), 448-466 (1978).</li>
<li>Kreko-Pierce, T., Azpurua, J., Mahoney, R. E., Eaton, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extension+of+health+span+and+life+span+in+Drosophila+by+S107+requires+the+calstabin+homologue+FK506-BP2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Extension of health span and life span in Drosophila by S107 requires the calstabin homologue FK506-BP2.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (50), 26045-26055 (2016).</li>
<li>Sullivan, K. M., Scott, K., Zuker, C. S., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ryanodine+receptor+is+essential+for+larval+development+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The ryanodine receptor is essential for larval development in Drosophila melanogaster.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 5942-5947 (2000).</li>
<li>Feng, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+expression+of+DmFKBP12%2FCalstabin+during+embryonic+early+development+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+%26+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Dynamics expression of DmFKBP12/Calstabin during embryonic early development of Drosophila melanogaster.</a> Cell & Bioscience. 9 (1), 1-16 (2019).</li>
<li>Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCampos-Ortega%2C+JA+%22The+embryonic+development+of+Drosophila+melanogaster%22">The embryonic development of Drosophila melanogaster</a>. , Springer. 633-645 (1958).</li>
<li>Xu, X., Dong, C., Vogel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemicentins+Assemble+on+Diverse+Epithelia+in+the+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Hemicentins Assemble on Diverse Epithelia in the Mouse.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (2), 119-126 (2007).</li>
<li>Wehrens, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FKBP12.6+deficiency+and+defective+calcium+release+channel+%28ryanodine+receptor%29+function+linked+to+exercise-induced+sudden+cardiac+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death.</a> Cell. 113 (7), 829-840 (2003).</li>
<li>Wehrens, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+from+cardiac+arrhythmia+through+ryanodine+receptor-stabilizing+protein+calstabin2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Protection from cardiac arrhythmia through ryanodine receptor-stabilizing protein calstabin2.</a> Science. 304 (5668), 292-296 (2004).</li>
<li>Bellinger, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+of+ryanodine+receptor+complex+causes+%26%2334%3Bleaky%26%2334%3B+channels%3A+a+molecular+mechanism+for+decreased+exercise+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Remodeling of ryanodine receptor complex causes &#34;leaky&#34; channels: a molecular mechanism for decreased exercise capacity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (6), 2198-2202 (2008).</li>
<li>Maruyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FKBP12+is+a+critical+regulator+of+the+heart+rhythm+and+the+cardiac+voltage-gated+sodium+current+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">FKBP12 is a critical regulator of the heart rhythm and the cardiac voltage-gated sodium current in mice.</a> Circulation Research. 108 (9), 1042-1052 (2011).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FKBP12+is+the+only+FK506+binding+protein+mediating+T-cell+inhibition+by+the+immunosuppressant+FK506%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">FKBP12 is the only FK506 binding protein mediating T-cell inhibition by the immunosuppressant FK506.</a> Transplantation. 73 (11), 1835-1838 (2002).</li>
<li>Zalk, R., Marks, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+release+channels+join+the+%27resolution+revolution%27%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Ca2+ release channels join the 'resolution revolution'.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42 (7), 543-555 (2017).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

RyRs ve IP3Rs aracılı kalsiyum sinyalizasyonu, hem omurgalı hem de omurgasız hayvanların birçok fizyolojik ve patolojik sürecinde temel bir yoldur1,2,3,4. İnsanlarda, RyR2 genindeki CPVT ile ilişkili R4496C mutasyonu gibi nokta mutasyonları, kardiyomiyositin sarkoplazmik retikulumundan kalsiyum sızıntısına yol açarak kardiyak disfonksiyona neden olur. Bu mutasyonlar, fiziksel aktivite sırasında...

Kalsiyuma bağlı kalsiyum salınım sinyalizasyonu (CICR), iskelet/düz kas ve kardiyak vasküler fonksiyon, hücre proliferasyonu ve apoptoz, gelişim, yaşlanma, nöronal sinaptik plastisite ve rejenerasyon gibi birçok biyolojik süreçte kritik rol oynar1,2,3,4,5,6 . Ryanodin reseptörleri (RyR'ler) ve inositol 1,4,5-trisfosfat reseptörleri (IP3R), düzenleyicileri protein kinaz A (PKA), Ca2 + / kalmodüline bağımlı protein kinaz II (CaMKII), FK506 bağlayıcı proteinler (FKBP'ler), kalsequestrin (CSQ), triadin ve junktin1,2,3,4,5,6 tarafından kontrol edilen kalsiyum sinyal yolundaki önemli oyunculardır. . Anormal insan ekspresyonu ve bu proteinlerdeki mutasyonlar, aritmi7 ve onkojenik proliferasyon gibi patolojik fizyolojiye yol açabilir8,9.
FKBP'ler, RyR'ler tarafından endoplazmik retikülerden (ER) kalsiyum salınımını düzenler. Bu süreç, kasılma mekanizması için gereklidir ve bu nedenle, embriyonik RyRs1,2 ile birlikte kalsiyum kaynaklı kalsiyum salınımı yoluyla miyosin-aktin kontraksiyonu tarafından üretilen tüm mekanik hareketlerden sorumludur. Fare modellerinde, RyR2 ve regülatörü FKBP12 / Calstabin'in eksikliği, embriyonik gelişim sırasında veya erken doğum sonrası dönemde10,11,12 her zaman öldürücüdür. FKBP12 / Calstabin nakavt fareleri, embriyonik gelişim sırasında düzensiz uyarılma-kasılma kuplajları (EC) ve serebral ödem ile kritik kalp defektleri sergiler. Bu, FKBP12 / Calstabin'in hem kardiyak hem de serebral gelişim için önemli olan RyR2 kanal ekspresyonunun düzenlenmesinde önemli bir rol oynadığını göstermektedir10.
RyR tarafından yürütülen kalsiyum kıvılcımları başlangıçta döllenmiş Medaka yumurtalarının zigot oluşum aşamasında keşfedilmiştir13,14. Bununla birlikte, erken embriyonik gelişimde kalsiyum sinyalizasyonunun işlevi hakkında çok az araştırma yapılmıştır. Drosophila melanogaster'da, DmFKBP12 S107 mutantlarından elde edilen sonuçlar, bu genin larva gelişimi ve oksidatif strese karşı işlevine atfedilen sağlıklı bir yaşam süresi için önemini destekleyen güçlü kanıtlar sunmaktadır15,16. Son zamanlarda, erken Drosophila melanogaster gelişimi sırasında FKBP12 / Calstabin proteini ve mesajcı RNA'nın dinamik lokalizasyonunu tanımladık17. Bu metodolojide açıklanan yaklaşımları kullanarak, sinsityal blastoderm (0-2 saat), hücresel blastoderm (2-3 saat), erken gastrula (3-12 saat) ve geç gastrula (12-24 saat) sırasında D. melanogaster'de FKBP12 / Calstabin ekspresyonunu izleyebildik. Bu yazıda, klasik parafin kesitleme için embriyo öncesi gömme, embriyonik kesitler için ön kaplama slayt tedavisi, histo-kimya boyama ve immünoboyama ve gen ekspresyonunun tanımlanması için mRNA in-situ hibridizasyonu dahil olmak üzere önceki çalışmadaki her yaklaşımın ayrıntılı protokolleri sunulmuştur.

<table><tbody><tr><td>-20& derece; C Buzdolabı</td><td>Meiling Biyoloji & Tıbbi</td><td>DW-YL270</td><td>Naip depolama için</td></tr> <tr><td>kullanılır-80 derece; C Ultra düşük sıcaklıklı buzdolabı</td><td>Thermo</td><td>Forma 90 Serisi</td><td>Naip depolama için kullanılır</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WXBB6360V</td><td>Üzüm suyu agar plakalarının hazırlanması</td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenin-AP, Fab parçaları</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td>Digoxigenin etiketli bileşiğin tespiti için</td></tr><tr><td>Biyokimyasal inkübatör</td><td>Shanghai Bluepard Instruments</td><td>LRH-250</td><td>In-situ Hybridization</td></tr><tr><td>Bouin'in çözümü</td><td>Pekin'de Sinopharm Kimyasal Reaktifi</td><td>69945460</td><td>Drosophila Embriyo Gömme</td></tr><tr><td></td><td>Santrifüjü Eppendorf</td><td>540BH07808</td><td>In-situ Hibridizasyon</td></tr><tr><td>Santrifüj tüpü</td><td>Denville</td><td>C-2170</td><td>Drosophila Embriyo Toplama</td></tr><tr><td>Krom Şap</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktif Pekin</td><td>10001018</td><td>Kaplama Slaytları</td></tr><tr><td>Sabit sıcaklıkta su banyosu</td><td>Jintan Henfeng Aletleri</td><td>KW-1000DC</td><td>Hematoksilen-Eozin Boyama, İmmünohistokimya, Yerinde Hibridizasyon ve Periyodik Asit-Gümüş Metenamin Boyama</td></tr><tr><td>Dako REAL EnVision Algılama Sistemi</td><td>Dako</td><td>K5007</td><td>İmmünohistokimyasal reaksiyonda veya in situ hibridizasyon reaksiyonunda, primer antijen antikoruna bağlanır ve hedef boyama ile işaretlenir.</td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td>Yerinde Hibridizasyon</td></tr><tr><td>DIG RNA Etiketleme Kiti</td><td></td><td>SP6 ve T7 RNA polimeraz<td></td></tr><tr><td>>Drosophila melanogaster</td><td>Bloomington Stok Merkezi</td><td>BDSC_16799, BDSC_19894, BDSC_11664</td><td>Drosophila melanogaster mutant</td></tr> <tr><td>stoklarıElektrikli yüksek kurutma fırını</td><td>Tianjin Taiste Instruments</td><td>101-0AB</td><td>Slaytları ve parafin gömme kaplama için</td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230251</td><td>Hematoksilen-Eozin Boyama</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sinopharm Pekin'de Kimyasal Reaktif</td><td>100092680</td><td>Parafin Gömme, Hematoksilen-Eozin Boyama, İmmünohistokimya, Yerinde Hibridizasyon ve Periyodik Asit-Gümüş Metenamin Boyama</td></tr><tr><td>Pekin</td><td>10010328</td><td>Kaplama Slaytlarında</td>Jelatin <td>Sinopharm Kimyasal Reaktifi</td></tr><tr><td>Altın klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>379948</td><td>Periyodik Asit-Gümüş Metenamin Boyama</td></tr><tr><td>Hematoksilen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3136</td><td>Hematoksilen-Eozin Boyama</td></tr><tr><td>Yüksek Saf PCR Ürün Saflaştırma Kiti</td><td>Roche</td><td>11732668001</td><td>PCR ürünlerinin</td></tr> <tr><td>saflaştırılması içinAkıllı sabit sıcaklık ve nem kutusu</td><td>Sinek bakımı için</td><td>Ningbo Jiangnan Instruments</td><td>HWS</td></tr><tr><td>LE Agarose</td><td>HyAgarose</td><td>14190108029</td><td>Pekin'de Önceden Gömülü</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktifi</td><td>10014108</td><td>Drosophila Embriyo</td></tr><tr><td>Toplama Mikroskobu</td><td>ZEISS</td><td>Observer.A1</td><td>Hematoksilen-Eozin Boyama, İmmünohistokimya, Yerinde Hibridizasyon ve Periyodik Asit-Gümüş Metenamin Boyama</td></tr><tr><td>Mikroskobu Slaytları</td><td>MeVid Labware İmalatı</td><td>P105-2001</td><td>Kaplama Slaytları</td></tr><tr><td>Nötr Sakız</td><td>Pekin'de Sinopharm Kimyasal Reaktif</td><td>10004160</td><td>Hematoksilen-Eozin Boyama</td></tr><tr>Pekin <td>40026768</td> Drosophila Embriyosunda<td>N-heptan</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktif</td><td> Koleksiyon</td></tr><tr><td>Parafin dilimleyici</td><td>Huahai bilim aleti</td><td>HH-2508III</td><<td>em>In-situ Hibridizasyon</td></tr><tr><td>Parafin</td><td>Sinopharm Pekin'de Kimyasal Reaktif</td><td>69019461</td><td>Parafin Gömme</td></tr><tr><td>pH / mV Metre</td><td>Sartorius</td><td>PB-10</td><td>Bir çözeltinin pH değerini belirlemek için</td></tr><tr><td>Pekin</td><td>10018461'da gümüş nitrat Sinopharm Kimyasal Reaktif</td><td></td><td>Periyodik Asit-Gümüş Metenamin Boyama</td></tr><tr><td>Ultra saf su sayacı</td><td>Thermo</td><td>AFXI-0501-P</td><td>In-situ Pekin'de</td></tr><tr><td>Ksilen</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktif</td><td>10023418</td><td>Parafin Gömme</td></tr></tbody></table>

erken drosophila embriyosunda İmmünohistokimya ve rna in-situ dağılımı için bir protokol

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

Kalsiyuma bağlı kalsiyum salınım sinyalizasyonu (CICR) birçok biyolojik süreçte kritik bir rol oynar. Hücre proliferasyonu ve apoptoz, gelişim ve yaşlanmadan nöronal sinaptik plastisite ve rejenerasyona kadar her hücresel aktivite Ryanodin reseptörleri (RyR) ile ilişkilendirilmiştir. Kalsiyum sinyalizasyonunun önemine rağmen, erken gelişimdeki işlevinin kesin mekanizması belirsizdir. Kısa gebelik periyoduna sahip bir organizma olarak, Drosophila melanogaster'in embriyoları, CICR ile ilişkili proteinlerin ve bunların gelişim sırasındaki düzenleyicilerinin dağılımını ve lokalizasyonunu araştırmak için birincil çalışma konularıdır. Bununla birlikte, lipit bakımından zengin embriyoları ve kitin bakımından zengin koryonları nedeniyle, faydaları embriyoları cam yüzeylere monte etmenin zorluğu ile sınırlıdır. Bu çalışmada, Drosophila embriyosunun slaytlara bağlanmasını önemli ölçüde artıran pratik bir protokol ve başarılı histokimya, immünohistokimya ve yerinde hibridizasyon için ayrıntılı yöntemler sunuyoruz. Krom şap jelatin slayt kaplama yöntemi ve embriyo ön gömme yöntemi, Drosophila embriyo proteini ve RNA ekspresyonunun incelenmesinde verimi önemli ölçüde artırır. Bu yaklaşımı göstermek için, Drosophila melanogaster'ın erken embriyonik gelişimi sırasında RyR'nin iyi bilinen bir düzenleyicisi olan DmFKBP12 / Calstabin'i inceledik. DmFKBP12'yi sinsityal blastoderm aşaması kadar erken bir zamanda tanımladık ve gelişim sırasında DmFKBP12'nin dinamik ekspresyon paternini bildirdik: başlangıçta sinsityal blastodermde eşit olarak dağılmış bir protein olarak, daha sonra hücresel blastoderm sırasında korteksin bodrum tabakasına önceden lokalize olarak, erken gastrülasyonda üç mücevherli tabaka fazı sırasında ilkel nöronal ve sindirim mimarisinde dağılmadan önce. Bu dağılım, RyR'nin bu katmanlardan kaynaklanan hayati organ sistemlerinde oynadığı kritik rolü açıklayabilir: subözofageal ve supraözofageal ganglion, ventral sinir sistemi ve kas-iskelet sistemi.

Şekiller, yüksek lipid ve kitin içeren koryon Drosophila embriyolarının (Tablo 1) inceleme ve deney için cam slayt yüzeyine bağlanma zorluğunun üstesinden gelmek için kullanılan protokolleri açıklamaktadır. Şekil 1'de gösterilen krom şap jelatin slayt kaplama yöntemini kullanarak, Drosophila embriyolarının slaytların yüzeyine bağlanmasını arttırırken, Şekil 2'de gösterilen embriyo ön gömme yöntemi, dört erken gelişim aşamasının...

Burada, Drosophila embriyo proteini ve RNA'nın toplanmasından ön gömülmesine ve gömülmesine, immünoboyamaya ve mRNA in situ hibridizasyonuna kadar tespiti ve lokalizasyonu için bir protokol tarif ediyoruz.

Erken Drosophila Embriyosunda İmmünohistokimya ve RNA In-situ Dağılımı için Bir Protokol

Calcium induced calcium release signaling (CICR) plays a critical role in many biological processes. Every cellular activity from cell proliferation and ...

Kısa bir gebelik süresine sahip bir organizma olarak, Drosophila melanogaster'in embriyoları, gelişim sırasında proteinlerin ve düzenleyicilerinin dağılımını ve lokalizasyonunu araştırmak için ana çalışma konularıdır. Bununla birlikte, lipit bakımından zengin embriyoları ve kitin bakımından zengin koryonları nedeniyle, faydaları embriyoları cam yüzeylere monte etmenin zorluğu ile sınırlıdır. Bu çalışmada, Drosophila embriyosunun slaytlara bağlanmasını önemli ölçüde artıran pratik bir yöntem tanıtıyoruz ve başarılı histokimya, immünohistokimya ve yerinde hibridizasyon için yöntemlerimizi detaylandırıyoruz.Burada gösterilen adımlardan önce, slaytlar deterjanla yıkanmalı, daha sonra musluk suyunda durulanmalı ve kuruması için fırına yerleştirilmeden önce damıtılmış su ile durulanmalıdır. Kuru slaytlar, durulanmadan ve tekrar kurutulmadan önce 24 saat boyunca potasyum dikromata hafifçe batırılmalı, daha sonra en az iki saat boyunca% 95 etanol içine yerleştirilmelidir. Bu adım sırasında, yöntemlerimize göre daha fazla slayt veya krom alum-jelatin hazırlayabilirsiniz.Jelatin daha sonra kullanımdan önce 60 derece banyo suyunda saklanabilir. Slaytları kaplamak için, slaytın bir kenarına az miktarda jelatin bırakın. Ardından, jelatini kaplanacak slaytın yüzeyi boyunca yavaşça ve eşit bir şekilde sürüklemek için başka bir cam slayt kullanın.Bu ince, eşit bir katman oluşturur. Bir rafa konmadan önce veya bir gece veya 48 saat daha tam kurumaya izin vermek için bir fırında saklanacak kurutma aparatları. Embriyo bir üzüm suyu agar plakası kullanılarak toplanır, hazır olduktan sonra üzüm suyu agar plakası çıkarılabilir.Plakayı PBS ile doldurun ve ekli embriyoları çıkarmak için yumuşak bir fırçayla hafifçe fırçalayın. PBS içeren embriyoyu 1,5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne çıkarın ve buz üzerinde dinlenmeye bırakın. Embriyo buz üzerine yerleştikten sonra, süpernatant PBS'yi yavaşça çıkarın.Tüpün altındaki embriyoyu rahatsız etmemeye dikkat edin. Numuneye 1 mL% 50 ağartıcı ekleyin ve iki dakika boyunca hafifçe çalkalayın. Ağartıcıyı filtrasyonla çıkarın ve embriyoları PBS'de üç kez yıkayın.N-heptan hazırlayın. Hazır olduktan sonra, embriyoları filtre kağıdından n-heptana filtre kağıdını çözelti içinde hafifçe çalkalayarak yıkayın. Embriyoların n-heptan plakasının dibine yerleşmesine izin verin ve bu n-heptanı yeni bir 1.5 mililitrelik santrifüj tüpünde toplayın.Tüpe bir mililitre metanol ekleyin, çözeltinin çökelmesine izin verin ve ardından n-heptan metanolü aspire edin. Artık metanolü çıkarmak için embriyoyu PBS'de üç ila beş kez yıkayın. Bu ekstra PBS'yi çıkarın ve Bouin'in fiksatif maddesini ekleyin ve embriyoları sabitlemek için 30 ila 60 dakika yerleşmesine izin verin.Bouin'in fiksatifini çıkarın ve embriyoları PBS'de üç kez tekrar yıkayın. PBS'de% 1.2 agaroz hazırlayın ve 60 derecelik bir su banyosunda sıcak tutun, ardından embriyoları, depolandığı ekstra PBS'yi hafifçe aspire ederek gömmek için hazırlayın. Alttaki embriyoları rahatsız etmemeye dikkat edin ve daha sonra çözeltinin altındaki embriyo tapasını aspire edin ve yavaşça bir şişe kapağı kalıbına yerleştirin.% 1.2 agaroz jeli eklemeden önce bu kalıptan herhangi bir ek PBS'yi aspire edin. Bu agaroz fişlerini saklamak için bir PBS çözeltisi hazırlayın. Agaroz katılaştıktan sonra, bireysel fişler depolama için bu PBS'ye taşınabilir.Burada sıralı dehidrasyon sürecini gösteriyoruz. Her seferinde inkübasyon için 15 dakika izin verilir. Daha sonra% 100 etanolden çıkarın ve bire bir etanol ve ksilen çözeltisinde 15 dakika daha sabitleyin.Bu bire bir çözeltiden çıkarıldıktan sonra, bir dakika boyunca saf ksilen içinde çıkarın. Şimdi doku örneği, ısıtılmış bire bir ksilen parafin çözeltisine taşınmaya hazırdır. Son gömmeden önce% 100 parafin içine yerleştirmeden önce 30 dakika oturmasına izin verin.% 100 parafinin ilkine geçin ve iki saat dinlenin. Bu işlemi iki ve üç parafininde tekrarlayın. Numune artık bir kalıba taşınmaya hazırdır ve gömme işlemini tamamlamak için kalıp balmumu ile doldurulmuştur.Drosophila embriyolarının gömülmesi. Drosophila embriyolarının hazırlanan parafin kesitlerini 60 derece fırında 15 dakika bekletin. Bunları% 100 ksilen çözeltisine yerleştirin.Daha sonra rehidrasyona başlarız. Slaytları bu çözümlerin her birine her biri üç dakika boyunca yerleştirin. Slayt damıtılmış suya girdikten sonra, hematoksilin çözeltisine iki dakika boyunca yerleştirin.Tamamlandığında, çözeltinin mümkün olduğunca çoğunu slayttan boşalttığınızdan emin olun. Slayt damıtılmış suda yıkandıktan sonra, slaytı bir dakika boyunca eozin içinde lekeleyin. Son olarak, sürgünü eozinden çıkarın ve damıtılmış suda yıkayın.Bu slayt temizlendikten sonra, şimdi son dehidrasyon sürecimize başlıyoruz. Sonunda beş dakika boyunca% 100 ksilen içine yerleştirilir. Bu işlem,% 100 ksilenden oluşan iki yeni çözeltide tekrarlanır ve kızağın bir kenarı boyunca az miktarda nötr sakız damlatılır.Bu kapak kaymasını alın ve kızağın bir kenarına yavaşça yerleştirin. İlk önce slaytları% 100 ksilen içine yerleştirerek deparafinize edin. Slaytlar damıtılmış sudan çıkarıldıktan sonra,% 1 periyodik asit çözeltisi ile kaplanmalıdır.Daha sonra fazla çözeltiyi atar ve damıtılmış suda durularız. Slaytı doğrudan önceden ısıtılmış bir çözeltiye yerleştirerek. Bu tamamlandıktan sonra, slaytı damıtılmış suda durulayın ve daha sonra çözeltiyi% 0.2 altın klorür ile bir ila iki dakika renklendirin.Daha sonra, damıtılmış su kullanarak dokuyu% 3 sodyum tiyo sülfat ile üç dakika sabitliyoruz. Ve sonra hematoksilin ile karşı boyama. Karşı boyamadan sonra, leke burada gösterildiği gibi damıtılmış su tüpü ile yıkanabilir.Sonra dehidrasyon işlemine geçiyoruz. Slaytları doğrudan% 100 ksilene koyarak bunu izleyin ve ardından slaytın köşesine az miktarda nötr sakız uygulayın. Bir kapak kayması ile yavaşça örtün.Slaytları daha önce olduğu gibi deparafininize ederek ve ksilene ile hazırlamaya başlayın. Ve sonra bire bir ksilen etanolde. Slaytlar deparafinize edildikten sonra, dokularını yeniden sulandırmaya başlarız ve son olarak PBS'de.Slaytları 10 dakika boyunca metanol içinde yapılmış% 0.3 hidrojen peroksit içine yerleştirin. Daha sonra slaytlar 20 mLs hedef alma çözümü ile kaplanır. Slaytlar daha sonra boyama kutusuna yerleştirilebilir.Boyama kutusunu bir vapura yerleştirin, hiçbir çözümün kaçmadığından ve slaytların hala tamamen kaplandığından emin olun. Buharlama işlemi sırasında su buharının kaçabilmesi için leke kutusu kapağının tamamen kapatılmaması gerektiğini unutmayın. Ve sonra PBS-T'de üç kez hafifçe durulayın.Fazla çözeltiyi atın ve işlemi bu kez PBS ile tekrarlayın. Daha sonra, slaytları beş ila 10 dakika boyunca bir peroksit bloğunda inkübe ediyoruz ve daha sonra PBS-T'de ve daha sonra PBS'de birkaç kez duruluyoruz. Antikoru hazırlayın ve doğrudan dokunun üzerine bırakın.Bu dokular daha sonra inkübe edilebilir veya dört saat boyunca oda sıcaklığında olabilir. İkincil antikor, iki ila 10 dakika boyunca% 5 DAB ile boyanan 90 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilmelidir. Uygun renk elde edildikten sonra, damıtılmış suda durulayın ve ardından hematoksilinde karşı leke yapın.Bu hematoksilin boyamasından sonra, slaytlar sırayla dehidre edilebilir. Slaytları% 100 ksilen içine yerleştirin ve üç dakika bekletin. Ardından, kızağın bir kenarına az miktarda nötr sakız bırakın.Bir sakız yerleştirildikten sonra, slayt kapağını alın ve slaytın bir kenarından yavaşça yerleştirin. Steril bir RNaz içermeyen reaksiyon şişesine bir mikrogram saflaştırılmış doğrusallaştırılmış şablon DNA ekleyin. Ardından, toplam 13 mikrolitrelik bir numune hacmi oluşturmak için yeterli steril RNase içermeyen DEPC ile işlenmiş çift damıtılmış su ekleyin.Daha sonra kısa bir süre santrifüj yapın ve 37 santigrat derecede iki saat kuluçkaya yatırın. RNase koruma deneyleri için, şablon DNA'yı çıkarmak için iki mikrolitre Dnaz-1, RNaz içermeyen 15 dakika boyunca inkübe etmenizi öneririz. İnkübasyon adımı tamamlandıktan sonra, sekiz pH'ta iki mikrolitre 0.2 molar EDTA ekleyerek reaksiyonu durdurun.Burada gösterilen adımlardan önce, daha önce gösterilen protokolümüze göre, slaytlar deparafinize edildi ve rehidre edildi. Rehidrasyondan sonra, fiksatif çözeltiyi dokudan çıkarmak için slaytları litre başına 0.01 mol PBS'de 7.4 pH'ta beş dakika boyunca inkübe edin. PBS'de duruladıktan sonra, serbest aldehit gruplarını dokudan çıkarmak için litre başına 100 milimolar glisin çözeltisi ile beş dakika boyunca iki kez durularız.Bu adımdan sonra, slaytları PBS ile beş dakika durulayın. Daha sonra, durulamadan önce 15 dakika boyunca% 0.3triton X-100 içeren PBS'de inkübe edin ve daha sonra mikrolitre proteinaz K.Next başına bir mikrogram ile tekrar inkübe edin, slaytları% 4 paraformaldehit ve PBS ile üç dakika boyunca 7.2 pH'ta sabitleyin. Daha sonra,% 0.25 asetik anhidrit içeren 0.1 molar trietanolamin tamponu pH 8 ile inkübe etmeden önce slaytları yıkayın.Çözümle tam kapsama alanı sağlamak için kutuyu bu aşamada eğmeyi seçebilirsiniz. Kutu, kuru bir hibridizasyon kutusunun dibine % 20 gliserol veya DEPC suyu eklenerek hazırlanır. Ardından, slaytları 20 mikrolitre ön hibridizasyon çözeltisinde örtün.Somon'un sperm DNA'sı, her slaytta mililitre başına 100 mikrogram konsantrasyonda. Ve sonra dört saat boyunca 42 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Bu, bu işlem sırasında çözeltinin kurumamasını sağlamak için önceden hazırlanmış nemlendirilmiş bir kutuda yapılır.Hibridizasyon sonrası aşamada, hibridizasyon çözeltisinin numunelerinizden tamamen durulanması çok önemlidir. Bu, dört kez konsantrasyon SSC, iki kez konsantrasyon bir kez konsantrasyon, 0.5 kez konsantrasyon ve 0.1 kez konsantrasyon SSC çözeltisi kullanılarak 37 derecede 15 dakikalık ardışık durulamalarda yapılabilir. Her biri 37 santigrat derecede 15 dakika kuluçkaya yatar.Bu yapıldıktan sonra, yıkama tamponunu eklemeden önce PBS ile her biri beş dakika boyunca üç kez yıkayın. Yıkama tamponu, sonraki adımlardan önce bir dakika durulanmalıdır Bir sonraki çözeltiyi eklemeden önce yıkama tamponunun slaytlardan tamamen kuruduğundan emin olun. Her slayta 100 mililitre blokaj çözeltisi ekleyin ve slaytı 30 dakika boyunca inkübe edin.Bu, iyi lekelenmeyi sağlamak için en iyi şekilde ışıksız bir ortamda yapılır. Daha sonra slaytları 20 mLs antikor çözeltisinde 30 dakika boyunca tekrar inkübe edin. Dokunuzun tam olarak kaplanması için antikor çözeltisini doğrudan slaytlara uygulayın.Kuluçka tamamlandıktan sonra, 100 mililitre yıkama tamponu uygulayın. Bağlanmamış antikor konjugatlarını çıkarmak için ışıksız koşullarda 15 dakika boyunca inkübe edin. Yıkama tamponunu çıkarın.Daha sonra, 20 mililitre algılama tamponu uygulayın ve yaklaşık dört dakika boyunca inkübe edilmesine izin verin. Dört dakika sonra algılama arabelleğini çıkarın. Ek bir çözelti olmadığından emin olmak için slaytları kurutun ve 10 mililitre taze hazırlanmış renkli substrat çözeltisi ekleyin.Bu reaksiyon birkaç dakika içinde başlar, ancak 16 saat sonra tamamlanır. Bu nedenle, bu süre boyunca ışıksız bir durumda kuluçkaya yatmanıza izin verin. Bantların tespit edildiği istenen noktalar reaksiyonu durdurmak için slaytı 50 mililitre TE tamponu ile yıkayın.Daha sonra nötr sakız için daha önce gösterilen dehidrasyon işlemimizi ve montaj işlemimizi tamamlayın. Şekil bir ve iki, parafin kesitleri için krom alüminyum jelatin kaplama yöntemini ve Drosophila embriyolarının geliştirilmesinde FKBP12 ve DmFKBP12'nin ekspresyon profili için gömme yöntemini göstermektedir. Şekil üç, sinsityal hücresel blastoderm aşamalarında FKBP12 tespit edilen antikorun protein dağılımını göstermektedir.Bu histokimyasal sonuçlardan, FKBP12 ekspresyonunun sinsityal blastodermde daha az polarize olduğu, daha sonra trofektoderm epitelinin altındaki bazal membran içinde lokalize olmaya başladığı ve ön ve arka kutuplarda bulunan daha fazla ekspresyon ile gradyanı bilgilendirdiği görülebilir. Drosophila embriyosunun erken ve geç gaz ilişkisi aşamalarını takip eden dördüncü Şekil, FKBP12 proteininin ilkel embriyonik dokunun belirli mimari bileşenleriyle sınırlı hale geldiğini göstermektedir. Erken ve geç gastro embriyonik evrelerde gözlenenden daha az hücre dışı dağılım ile.İlginçtir ki, yukarıda tarif edilen dinamik protein dağılımına, şekil beşte görüldüğü gibi FKBP12'nin MRG düzeylerindeki karşılık gelen değişiklikler eşlik etmemektedir. Protein ekspresyonunun, transkripsiyon sonrası moleküler mekanizmanın hala bilinmeyen bir sonucu olduğunu göstermek. Ryanodin reseptörü aracılı kalsiyum sinyalizasyonu, hem omurgalı hem de omurgasız hayvanların birçok fizyolojik ve patolojik sürecinde temel bir yoldur.Bu gendeki mutasyonların, hastalığa veya erken kardiyak ölüme yol açan birçok fizyolojik rahatsızlığa neden olduğu bilinmektedir. Bununla birlikte, bu genin erken Drosophila gelişiminde oynadığı rolü incelemek zor olmuştur. Embriyonun bir transit bileşeni olarak, lipit bakımından zengin embriyo ve kitin bakımından zengin koryon, erken Drosophila gelişiminde protein ve embriyonik ekspresyon çalışmalarını zorlaştırır.Bu yazıda açıklanan slayt kaplama, embriyo gömme ve immünohistokimyasal teknikler, ryanodin reseptör proteini ve mRNA'nın dinamik dağılımını ayrıntılı olarak incelememizi sağlamıştır. Bu teknikleri ve Drosophila'nın erken gelişim aşamalarında başkalarının diğer proteinleri incelemesine izin verecekleri umudunu paylaşıyoruz.

a-protocol-for-immunohistochemistry-rna-situ-distribution-within

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu protokol disseke Drosophila larva immünohistokimya nasıl gerçekleştirileceği göstermektedir.

Drosophila Larvaların NMJ İmmünohistokimya

Biz sahnelenen hazırlamak için prosedürü...

Tüm montaj Embriyonik Sinir Sistemi Görselleştirme Drosophila Embriyolar

Drosophila pupa Karın İmmünohistokimya

Tüm Dağı RNA Floresan<em&gt; In situ</emVe&gt; Hibridizasyon<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

İmmün boyama, dokulardaki belirli hücre tiplerini ve proteinleri görselleştirmek için etkili bir tekniktir. Sonikasyonu kullanarak, burada açıklanan protokol, immünostainingden önce Drosophila melanogaster dokularını geç evre embriyolardan ve larvalardan ayırma ihtiyacını hafifletir. Formaldehitle sabitlenmiş bütün mount larvalarının immün boyaması için etkili bir metodoloji sunuyoruz.

Geç evre embriyonik ve larva soniklenmesi-kolaylaştırdı Immunoflorasan Boyama<em&gt; Drosophila</em&gt; Dokular<em&gt; Yerinde</em

Biz renkli çökeltilerin zıt üç farklı mRNA dağıtım desen eşzamanlı ve belirli algılama izin bozulmamış Drosophila embriyolar bir çoklu hedef kromojenik tüm montaj in situ hibridizasyon (MC-DİLERİZ) prosedürü açıklar.

Çoklu hedef Kromojenik Tüm montaj<em&gt; In Situ</em&gt; Melezleme Gen İfade Etki karşılaştırılması için<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

Açıklanan RNA in situ hibridizasyon Protokolü RNA algılama bütün Drosophila embriyo veya disseke doku sağlar. 96-de microtiter plakaları ve tyramide sinyal Güçlendirme kullanma, yüksek kararlılık, duyarlılık ve işlem hacmi ve nispeten düşük bir maliyetle transkript tespit edilebilir.

Yüksek çözünürlüklü Floresan Situ hibridizasyon Drosophila embriyo ve Tyramide sinyal güçlendirme kullanarak doku

Burada sunulan mikroenjekte etmek ve aynı anda görüntü birden fazla Drosophila embriyoembriyonik gelişim sırasında bir plaka tabanlı, yüksek içerik görüntüleyici kullanarak bir protokoldür.

Drosophila Embriyo Hazırlama ve Canlı Hücre Mikroskopisi Için Mikroenjeksiyon Otomatik Yüksek İçerik Analizörü Kullanılarak Gerçekleştirildi

Bu çalışma, dekapitasyon, fiksasyon, kriyoseksiyon, floresan boyama, immün boyama ve görüntülemeyi içeren, konfokal ve multifoton görüntülemeye genişletilebilen basitleştirilmiş bir doku işleme protokolü sunmaktadır. Yöntem, gelişmiş motor becerilere olan ihtiyacı atlayarak karmaşık diseksiyonlarla karşılaştırılabilir etkinliği korur. Kantitatif görüntü analizi, kapsamlı bir araştırma potansiyeli sağlar.

Gelişmiş beyin floresan boyaması ve immün boyama için Drosophila kafalarının doğrudan kriyoseksiyonu

Bu protokoller, kontrol ve mutant Drosophila embriyonik epitelisindeki pileli septat bağlantılarının organizasyonu ve kapatma fonksiyonunun nasıl karakterize edileceğini açıklar.

Drosophila embriyonik epitelinde çekirdek pileli septat bağlantı proteinlerini tanımlamak için immünboyama ve boya penetrasyonu deneyleri

Öğrenin, Drosophila melanogaster embriyolarında protein ve RNA lokalizasyonunu incelemek için immünohistokimya ve in-situ hibridizasyon protokolleri. Bu yöntemler, gelişim biyolojisi araştırmalarında embriyo tutunmasını ve görüntülemeyi iyileştirir.

Erken Drosophila Embriyosunda İmmünohistokimya ve RNA In-situ Dağılımı için Bir Protokol

Daha fazla video keşfet