Erken Drosophila Embriyosunda İmmünohistokimya ve RNA In-situ Dağılımı için Bir Protokol

Kısa bir gebelik süresine sahip bir organizma olarak, Drosophila melanogaster'in embriyoları, gelişim sırasında proteinlerin ve düzenleyicilerinin dağılımını ve lokalizasyonunu araştırmak için ana çalışma konularıdır. Bununla birlikte, lipit bakımından zengin embriyoları ve kitin bakımından zengin koryonları nedeniyle, faydaları embriyoları cam yüzeylere monte etmenin zorluğu ile sınırlıdır. Bu çalışmada, Drosophila embriyosunun slaytlara bağlanmasını önemli ölçüde artıran pratik bir yöntem tanıtıyoruz ve başarılı histokimya, immünohistokimya ve yerinde hibridizasyon için yöntemlerimizi detaylandırıyoruz.

Burada gösterilen adımlardan önce, slaytlar deterjanla yıkanmalı, daha sonra musluk suyunda durulanmalı ve kuruması için fırına yerleştirilmeden önce damıtılmış su ile durulanmalıdır. Kuru slaytlar, durulanmadan ve tekrar kurutulmadan önce 24 saat boyunca potasyum dikromata hafifçe batırılmalı, daha sonra en az iki saat boyunca% 95 etanol içine yerleştirilmelidir. Bu adım sırasında, yöntemlerimize göre daha fazla slayt veya krom alum-jelatin hazırlayabilirsiniz.

Jelatin daha sonra kullanımdan önce 60 derece banyo suyunda saklanabilir. Slaytları kaplamak için, slaytın bir kenarına az miktarda jelatin bırakın. Ardından, jelatini kaplanacak slaytın yüzeyi boyunca yavaşça ve eşit bir şekilde sürüklemek için başka bir cam slayt kullanın.

Bu ince, eşit bir katman oluşturur. Bir rafa konmadan önce veya bir gece veya 48 saat daha tam kurumaya izin vermek için bir fırında saklanacak kurutma aparatları. Embriyo bir üzüm suyu agar plakası kullanılarak toplanır, hazır olduktan sonra üzüm suyu agar plakası çıkarılabilir.

Plakayı PBS ile doldurun ve ekli embriyoları çıkarmak için yumuşak bir fırçayla hafifçe fırçalayın. PBS içeren embriyoyu 1,5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne çıkarın ve buz üzerinde dinlenmeye bırakın. Embriyo buz üzerine yerleştikten sonra, süpernatant PBS'yi yavaşça çıkarın.

Tüpün altındaki embriyoyu rahatsız etmemeye dikkat edin. Numuneye 1 mL% 50 ağartıcı ekleyin ve iki dakika boyunca hafifçe çalkalayın. Ağartıcıyı filtrasyonla çıkarın ve embriyoları PBS'de üç kez yıkayın.

N-heptan hazırlayın. Hazır olduktan sonra, embriyoları filtre kağıdından n-heptana filtre kağıdını çözelti içinde hafifçe çalkalayarak yıkayın. Embriyoların n-heptan plakasının dibine yerleşmesine izin verin ve bu n-heptanı yeni bir 1.5 mililitrelik santrifüj tüpünde toplayın.

Tüpe bir mililitre metanol ekleyin, çözeltinin çökelmesine izin verin ve ardından n-heptan metanolü aspire edin. Artık metanolü çıkarmak için embriyoyu PBS'de üç ila beş kez yıkayın. Bu ekstra PBS'yi çıkarın ve Bouin'in fiksatif maddesini ekleyin ve embriyoları sabitlemek için 30 ila 60 dakika yerleşmesine izin verin.

Bouin'in fiksatifini çıkarın ve embriyoları PBS'de üç kez tekrar yıkayın. PBS'de% 1.2 agaroz hazırlayın ve 60 derecelik bir su banyosunda sıcak tutun, ardından embriyoları, depolandığı ekstra PBS'yi hafifçe aspire ederek gömmek için hazırlayın. Alttaki embriyoları rahatsız etmemeye dikkat edin ve daha sonra çözeltinin altındaki embriyo tapasını aspire edin ve yavaşça bir şişe kapağı kalıbına yerleştirin.

% 1.2 agaroz jeli eklemeden önce bu kalıptan herhangi bir ek PBS'yi aspire edin. Bu agaroz fişlerini saklamak için bir PBS çözeltisi hazırlayın. Agaroz katılaştıktan sonra, bireysel fişler depolama için bu PBS'ye taşınabilir.

Burada sıralı dehidrasyon sürecini gösteriyoruz. Her seferinde inkübasyon için 15 dakika izin verilir. Daha sonra% 100 etanolden çıkarın ve bire bir etanol ve ksilen çözeltisinde 15 dakika daha sabitleyin.

Bu bire bir çözeltiden çıkarıldıktan sonra, bir dakika boyunca saf ksilen içinde çıkarın. Şimdi doku örneği, ısıtılmış bire bir ksilen parafin çözeltisine taşınmaya hazırdır. Son gömmeden önce% 100 parafin içine yerleştirmeden önce 30 dakika oturmasına izin verin.

% 100 parafinin ilkine geçin ve iki saat dinlenin. Bu işlemi iki ve üç parafininde tekrarlayın. Numune artık bir kalıba taşınmaya hazırdır ve gömme işlemini tamamlamak için kalıp balmumu ile doldurulmuştur.

Drosophila embriyolarının gömülmesi. Drosophila embriyolarının hazırlanan parafin kesitlerini 60 derece fırında 15 dakika bekletin. Bunları% 100 ksilen çözeltisine yerleştirin.

Daha sonra rehidrasyona başlarız. Slaytları bu çözümlerin her birine her biri üç dakika boyunca yerleştirin. Slayt damıtılmış suya girdikten sonra, hematoksilin çözeltisine iki dakika boyunca yerleştirin.

Tamamlandığında, çözeltinin mümkün olduğunca çoğunu slayttan boşalttığınızdan emin olun. Slayt damıtılmış suda yıkandıktan sonra, slaytı bir dakika boyunca eozin içinde lekeleyin. Son olarak, sürgünü eozinden çıkarın ve damıtılmış suda yıkayın.

Bu slayt temizlendikten sonra, şimdi son dehidrasyon sürecimize başlıyoruz. Sonunda beş dakika boyunca% 100 ksilen içine yerleştirilir. Bu işlem,% 100 ksilenden oluşan iki yeni çözeltide tekrarlanır ve kızağın bir kenarı boyunca az miktarda nötr sakız damlatılır.

Bu kapak kaymasını alın ve kızağın bir kenarına yavaşça yerleştirin. İlk önce slaytları% 100 ksilen içine yerleştirerek deparafinize edin. Slaytlar damıtılmış sudan çıkarıldıktan sonra,% 1 periyodik asit çözeltisi ile kaplanmalıdır.

Daha sonra fazla çözeltiyi atar ve damıtılmış suda durularız. Slaytı doğrudan önceden ısıtılmış bir çözeltiye yerleştirerek. Bu tamamlandıktan sonra, slaytı damıtılmış suda durulayın ve daha sonra çözeltiyi% 0.2 altın klorür ile bir ila iki dakika renklendirin.

Daha sonra, damıtılmış su kullanarak dokuyu% 3 sodyum tiyo sülfat ile üç dakika sabitliyoruz. Ve sonra hematoksilin ile karşı boyama. Karşı boyamadan sonra, leke burada gösterildiği gibi damıtılmış su tüpü ile yıkanabilir.

Sonra dehidrasyon işlemine geçiyoruz. Slaytları doğrudan% 100 ksilene koyarak bunu izleyin ve ardından slaytın köşesine az miktarda nötr sakız uygulayın. Bir kapak kayması ile yavaşça örtün.

Slaytları daha önce olduğu gibi deparafininize ederek ve ksilene ile hazırlamaya başlayın. Ve sonra bire bir ksilen etanolde. Slaytlar deparafinize edildikten sonra, dokularını yeniden sulandırmaya başlarız ve son olarak PBS'de.

Slaytları 10 dakika boyunca metanol içinde yapılmış% 0.3 hidrojen peroksit içine yerleştirin. Daha sonra slaytlar 20 mLs hedef alma çözümü ile kaplanır. Slaytlar daha sonra boyama kutusuna yerleştirilebilir.

Boyama kutusunu bir vapura yerleştirin, hiçbir çözümün kaçmadığından ve slaytların hala tamamen kaplandığından emin olun. Buharlama işlemi sırasında su buharının kaçabilmesi için leke kutusu kapağının tamamen kapatılmaması gerektiğini unutmayın. Ve sonra PBS-T'de üç kez hafifçe durulayın.

Fazla çözeltiyi atın ve işlemi bu kez PBS ile tekrarlayın. Daha sonra, slaytları beş ila 10 dakika boyunca bir peroksit bloğunda inkübe ediyoruz ve daha sonra PBS-T'de ve daha sonra PBS'de birkaç kez duruluyoruz. Antikoru hazırlayın ve doğrudan dokunun üzerine bırakın.

Bu dokular daha sonra inkübe edilebilir veya dört saat boyunca oda sıcaklığında olabilir. İkincil antikor, iki ila 10 dakika boyunca% 5 DAB ile boyanan 90 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilmelidir. Uygun renk elde edildikten sonra, damıtılmış suda durulayın ve ardından hematoksilinde karşı leke yapın.

Bu hematoksilin boyamasından sonra, slaytlar sırayla dehidre edilebilir. Slaytları% 100 ksilen içine yerleştirin ve üç dakika bekletin. Ardından, kızağın bir kenarına az miktarda nötr sakız bırakın.

Bir sakız yerleştirildikten sonra, slayt kapağını alın ve slaytın bir kenarından yavaşça yerleştirin. Steril bir RNaz içermeyen reaksiyon şişesine bir mikrogram saflaştırılmış doğrusallaştırılmış şablon DNA ekleyin. Ardından, toplam 13 mikrolitrelik bir numune hacmi oluşturmak için yeterli steril RNase içermeyen DEPC ile işlenmiş çift damıtılmış su ekleyin.

Daha sonra kısa bir süre santrifüj yapın ve 37 santigrat derecede iki saat kuluçkaya yatırın. RNase koruma deneyleri için, şablon DNA'yı çıkarmak için iki mikrolitre Dnaz-1, RNaz içermeyen 15 dakika boyunca inkübe etmenizi öneririz. İnkübasyon adımı tamamlandıktan sonra, sekiz pH'ta iki mikrolitre 0.2 molar EDTA ekleyerek reaksiyonu durdurun.

Burada gösterilen adımlardan önce, daha önce gösterilen protokolümüze göre, slaytlar deparafinize edildi ve rehidre edildi. Rehidrasyondan sonra, fiksatif çözeltiyi dokudan çıkarmak için slaytları litre başına 0.01 mol PBS'de 7.4 pH'ta beş dakika boyunca inkübe edin. PBS'de duruladıktan sonra, serbest aldehit gruplarını dokudan çıkarmak için litre başına 100 milimolar glisin çözeltisi ile beş dakika boyunca iki kez durularız.

Bu adımdan sonra, slaytları PBS ile beş dakika durulayın. Daha sonra, durulamadan önce 15 dakika boyunca% 0.3triton X-100 içeren PBS'de inkübe edin ve daha sonra mikrolitre proteinaz K.Next başına bir mikrogram ile tekrar inkübe edin, slaytları% 4 paraformaldehit ve PBS ile üç dakika boyunca 7.2 pH'ta sabitleyin. Daha sonra,% 0.25 asetik anhidrit içeren 0.1 molar trietanolamin tamponu pH 8 ile inkübe etmeden önce slaytları yıkayın.

Çözümle tam kapsama alanı sağlamak için kutuyu bu aşamada eğmeyi seçebilirsiniz. Kutu, kuru bir hibridizasyon kutusunun dibine % 20 gliserol veya DEPC suyu eklenerek hazırlanır. Ardından, slaytları 20 mikrolitre ön hibridizasyon çözeltisinde örtün.

Somon'un sperm DNA'sı, her slaytta mililitre başına 100 mikrogram konsantrasyonda. Ve sonra dört saat boyunca 42 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Bu, bu işlem sırasında çözeltinin kurumamasını sağlamak için önceden hazırlanmış nemlendirilmiş bir kutuda yapılır.

Hibridizasyon sonrası aşamada, hibridizasyon çözeltisinin numunelerinizden tamamen durulanması çok önemlidir. Bu, dört kez konsantrasyon SSC, iki kez konsantrasyon bir kez konsantrasyon, 0.5 kez konsantrasyon ve 0.1 kez konsantrasyon SSC çözeltisi kullanılarak 37 derecede 15 dakikalık ardışık durulamalarda yapılabilir. Her biri 37 santigrat derecede 15 dakika kuluçkaya yatar.

Bu yapıldıktan sonra, yıkama tamponunu eklemeden önce PBS ile her biri beş dakika boyunca üç kez yıkayın. Yıkama tamponu, sonraki adımlardan önce bir dakika durulanmalıdır Bir sonraki çözeltiyi eklemeden önce yıkama tamponunun slaytlardan tamamen kuruduğundan emin olun. Her slayta 100 mililitre blokaj çözeltisi ekleyin ve slaytı 30 dakika boyunca inkübe edin.

Bu, iyi lekelenmeyi sağlamak için en iyi şekilde ışıksız bir ortamda yapılır. Daha sonra slaytları 20 mLs antikor çözeltisinde 30 dakika boyunca tekrar inkübe edin. Dokunuzun tam olarak kaplanması için antikor çözeltisini doğrudan slaytlara uygulayın.

Kuluçka tamamlandıktan sonra, 100 mililitre yıkama tamponu uygulayın. Bağlanmamış antikor konjugatlarını çıkarmak için ışıksız koşullarda 15 dakika boyunca inkübe edin. Yıkama tamponunu çıkarın.

Daha sonra, 20 mililitre algılama tamponu uygulayın ve yaklaşık dört dakika boyunca inkübe edilmesine izin verin. Dört dakika sonra algılama arabelleğini çıkarın. Ek bir çözelti olmadığından emin olmak için slaytları kurutun ve 10 mililitre taze hazırlanmış renkli substrat çözeltisi ekleyin.

Bu reaksiyon birkaç dakika içinde başlar, ancak 16 saat sonra tamamlanır. Bu nedenle, bu süre boyunca ışıksız bir durumda kuluçkaya yatmanıza izin verin. Bantların tespit edildiği istenen noktalar reaksiyonu durdurmak için slaytı 50 mililitre TE tamponu ile yıkayın.

Daha sonra nötr sakız için daha önce gösterilen dehidrasyon işlemimizi ve montaj işlemimizi tamamlayın. Şekil bir ve iki, parafin kesitleri için krom alüminyum jelatin kaplama yöntemini ve Drosophila embriyolarının geliştirilmesinde FKBP12 ve DmFKBP12'nin ekspresyon profili için gömme yöntemini göstermektedir. Şekil üç, sinsityal hücresel blastoderm aşamalarında FKBP12 tespit edilen antikorun protein dağılımını göstermektedir.

Bu histokimyasal sonuçlardan, FKBP12 ekspresyonunun sinsityal blastodermde daha az polarize olduğu, daha sonra trofektoderm epitelinin altındaki bazal membran içinde lokalize olmaya başladığı ve ön ve arka kutuplarda bulunan daha fazla ekspresyon ile gradyanı bilgilendirdiği görülebilir. Drosophila embriyosunun erken ve geç gaz ilişkisi aşamalarını takip eden dördüncü Şekil, FKBP12 proteininin ilkel embriyonik dokunun belirli mimari bileşenleriyle sınırlı hale geldiğini göstermektedir. Erken ve geç gastro embriyonik evrelerde gözlenenden daha az hücre dışı dağılım ile.

İlginçtir ki, yukarıda tarif edilen dinamik protein dağılımına, şekil beşte görüldüğü gibi FKBP12'nin MRG düzeylerindeki karşılık gelen değişiklikler eşlik etmemektedir. Protein ekspresyonunun, transkripsiyon sonrası moleküler mekanizmanın hala bilinmeyen bir sonucu olduğunu göstermek. Ryanodin reseptörü aracılı kalsiyum sinyalizasyonu, hem omurgalı hem de omurgasız hayvanların birçok fizyolojik ve patolojik sürecinde temel bir yoldur.

Bu gendeki mutasyonların, hastalığa veya erken kardiyak ölüme yol açan birçok fizyolojik rahatsızlığa neden olduğu bilinmektedir. Bununla birlikte, bu genin erken Drosophila gelişiminde oynadığı rolü incelemek zor olmuştur. Embriyonun bir transit bileşeni olarak, lipit bakımından zengin embriyo ve kitin bakımından zengin koryon, erken Drosophila gelişiminde protein ve embriyonik ekspresyon çalışmalarını zorlaştırır.

Bu yazıda açıklanan slayt kaplama, embriyo gömme ve immünohistokimyasal teknikler, ryanodin reseptör proteini ve mRNA'nın dinamik dağılımını ayrıntılı olarak incelememizi sağlamıştır. Bu teknikleri ve Drosophila'nın erken gelişim aşamalarında başkalarının diğer proteinleri incelemesine izin verecekleri umudunu paylaşıyoruz.