Hücre ve İlaç Dağıtım Uygulamaları için Enjekte Edilebilir Supramoleküler Polimer-Nanopartikül Hidrojelleri

Protokolümüz polimer-nanopartikül hidrojellerin biyomalzeme olarak kullanılmasını kolaylaştırır. Araştırmacıların bu materyali çeviri uygulamaları ve temel biyolojik soruları araştırmak için geliştireceğini umuyoruz. PNP hidrojelleri küçük çaplı iğneler ve kateterler aracılığıyla kolayca enjekte edilir, ancak enjeksiyondan sonra hızlı bir şekilde kendiliğinden iyileşir.

Bu, ilaçların ve hücrelerin uzun zaman ölçeklerinde invaziv olmayan kontrollü teslimatına izin verir. Bu teknoloji, kanserden doku yenilenmesine ve pasif bağışıklamaya kadar geniş öfkeli koşulların etkileri ile lokalize tedavi ve genişletilmiş ilaç salınımı için sınırları zorlar. Nano parçacıkları nano çökeltme ile sentezlemek için, sekiz mililitrelik cam scintillation şişesine 50 miligram PEG-PLA polimer ekleyin ve şişeye bir mililitre asetonitril ekleyin.

Girdap tamamen çözülecek. Daha sonra küçük bir karıştırma çubuğu ile 20 mililitrelik cam scintillation şişesine 10 mililitre ultra saf su ekleyin ve şişeyi dakikada 600 devire ayarlanmış bir karıştırma plakasına yerleştirin. Su şişesine damla yönünde polimer çözücü çözeltisinin bir mililitresini eklemek için 200 mikrolitre pipet kullanın.

Polimer çözücü çözeltisi hızla suya dağıldığı için çekirdek kabuklu nanopartiküller oluşacaktır. Standart protokollere göre dinamik ışık saçılımı ile parçacık boyutunu doğrulayın. Daha sonra nano parçacık çözeltisini bir santrifüj filtre ünitesine aktarın ve çözeltiyi 250 mikrolitreden daha az birine konsantre edin ve nanopartikülleri uygun bir tamponda yeniden depoleyin.

Hidrojel hazırlamak için, bir mililitre Luer kilit şırıngasına 333 miligram%6 HPMC-C12 stok çözeltisi ekleyin ve sekiz mililitrelik şişeye %20 nanopartikül stok çözeltisinin 500 mikrolitresini ve 167 mikrolitre PBS'yi ekleyin. Karıştırdıktan sonra, bir mililitre luer kilit şırıngasını seyreltilmiş nano parçacık çözeltisi ile doldurmak için bir iğne kullanın ve iki şırıngayı bir dirsek mikserine takın. Homojen, opak beyaz bir hidrojel malzeme oluşana kadar iki çözeltiyi yaklaşık 60 döngü boyunca karıştırın.

Formüle edilmiş hidrojenin reolojik özelliklerini ölçmek için, seçilen geometri boşluğuna göre uygun hidrojel hacmini tırtıklı bir reometre plakasının ortasına enjekte edin ve numunenin mekanik özelliklerini ölçmek için osilatör ve akış testlerini kullanın. Hidrojelden ilaç salınımını karakterize etmek için, önce, her tüpün bir ucunun mühürlenilmesi için epoksi kullanarak bir cam kılcal damar hazırlayın. Epoksi ayarlandığında, numune başına en az üç tüpe 100 ila 200 mikrolitre hidrojel enjekte etmek için dört inç 22 kalibrelik bir hipodermik iğne kullanın ve her bir hidrojel hacmine dikkatlice 200 ila 300 mikrolitre PBS ekleyin.

Uygun zaman noktalarında, beklenen ilaç salınımı zaman ölçeğine göre, PBS'yi hidrojel yüzeyi bozmadan her kılcal damardan dikkatlice çıkarmak ve taze bir PBS hacmi eklemek için bir iğne kullanın. Çalışmanın tamamlanmasıyla, toplanan PBS aliquotlarını her zaman noktasında salınan ilaç miktarını ölçmek için uygun bir yöntemle analiz edin. Jel kapsüllenmiş insülinin termal stabilitesini karakterize etmek için, gösterildiği gibi hidrojele hem insülin hem de thioflavin T yükleyin ve 200 mikrolitre yükü enjekte etmek için 21 kalibrelik bir iğne kullanın ve numune başına en az üç siyah 96 kuyu plakası kuyusuna hidrojel yükleyin.

Daha sonra buharlaşmayı önlemek için plakayı optik olarak netleştirilmiş yapışkan plaka contası ile kapatın ve plakayı sıcaklık kontrolü, sallama ve kinetik okuma programlama ile donatılmış bir plaka okuyucusuna yerleştirin. Hidrojel kapsüllenmiş hücre canlılığını değerlendirmek için, numune başına üç kuyunun her birine uygun hücre konsantrasyonu içeren 150 mikrolitre hidrojel enjekte etmek için 21 kalibrelik bir iğne kullanın ve her bir hidrojel hacmine uygun hücre ortamının 100 mikrolitresini ekleyin. Kültürün ilk gününde, her bir hidrojel üzerindeki süpernatantı her örnek grubu için uygun zaman noktasında iki milimoler Calcein çözeltisinin 50 mikrolitresi ile değiştirin.

30 dakikalık bir inkübasyondan sonra, konfokal mikroskopi ile her kuyunun merkezini görüntüleyin. Kapsüllenmiş hücrelerin enjeksiyondan önce bir şırıngaya yerleşme yeteneğini değerlendirmek için, ilgi çekici hücreleri PBS konsantrasyonunda mililitre başına altı hücreye bir kez 10'a seyreltin ve hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca iki milimoler Kalsein AM'nin 50 mikrolitresi ile lekeleyin. Kuluçkanın sonunda, hücreleri gösterildiği gibi 500 ila 700 mikrolitre hidrojel ile karıştırın ve örnek başına en az bir cuvette'in dibine hidrojel içeren 100 ila 200 mikrolitre hücre enjekte etmek için 21 kalibrelik bir iğne kullanın.

Daha sonra cuvettes enjeksiyondan hemen sonra ve tohumlamadan hemen sonra bir ve dört saat sonra hücrelerin hidrojel içine yerleşip yerleşmediğini veya askıya alınıp alınmadığını gözlemlemek için konfokal mikroskop sahnesinde yanlarında düz yatan cuvetteleri görüntüleyin. Jelin kesme inceltme ve kendi kendini iyileştirme yetenekleri, sırasıyla akış süpürme ve adım kesme protokolleri kullanılarak gözlemlenebilir. Saniyede 0,1 ila 100 radyan frekans aralığında doğrusal viskoelastik rejimde salınımlı kesme frekansı süpürme deneyi kullanılarak depolama ve kayıp modülerinin karakterizasyonu katı benzeri özellikleri ortaya koymaktadır.

Genellikle daha sert formülasyonlar için düşük frekanslarda gözlenen kesme depolama ve kayıp modülünün bir geçişi olmamalıdır, ancak daha zayıf bir hidrojel formülasyonları için çaprazlama olayları beklenebilir. PNP hidrojellerinin polimer içeriğinin değişmesi, kargonun polimer ağı üzerinden yayılması ve malzemelerden salınma oranı üzerinde doğrudan bir etkiye sahip olabilir. PNP hidrojelleri ayrıca termal kararsızlığa duyarlı kargoyu stabilize edebilir, kargo raf ömrünü önemli ölçüde uzatabilir ve soğuk zincir depolama ve dağıtımına olan güveni azaltabilir.

Integrin motiflerinin dahil edilmesi, PNP hidrojellerinin hücresel tedaviler için uyarlaması için yararlı olabilir. Kapsüllenmiş hücreler, görselleştirmelerini ve nicelemelerini kolaylaştırmak için floresan olarak etiketlenebilir. Örneğin, yapışıklık bölgelerinden yoksun formülasyonlar, kapsüllenmiş hücreler kapsüllenmiş hücrelere ve RGD gibi yapışıklık motiflerine sahip formülasyonlara kıyasla çoğalamadığı için düşük hücre canlılığına sahip olacaktır.

Formülasyondaki değişikliklerin polimer matrisinin reolojik özelliklerini ve dinamik örgüsünü nasıl etkilediğini hala araştırıyoruz. Ayrıca hidrojel içindeki moleküllerin difüzyonunu incelemek için FRAP kullanıyoruz. Bu malzemeler, sürekli doğumun ilaç dağıtımını, aşı geliştirmeyi veya kanser immünoterapisini nasıl etkileyebileceği hakkında yeni biyolojik sorular sormak için kullanılabilir.