Hasta Kaynaklı Tümör Organoidleri Kullanılarak Yüksek Verimli In Vitro Tahlil

Hasta kaynaklı tümör organoidleri, hastalığın daha iyi tekrarlanabilirliği ile tümör dokusunun mimarisini ve işlevini doğru bir şekilde yeniden üretir. Bu nedenle, bir hastanın kanser önleyici ilaçlara yanıtı bu model kullanılarak doğru bir şekilde değerlendirilebilir. Tümör organoidleri, kültürde büyük küme oluşumu nedeniyle in-vitro yüksek verim tahlil sistemi veya hücre analizi için uygun değildir.

Bu teknik kullanılarak moleküler hedefe yönelik ilaçların değerlendirilmesi için basit ve daha doğru HTS geliştirilmiştir. Organoid kültürü 2D kültüründen çok farklı olduğundan, ilk başta kültür hakkında kafa karışıklığı hissedilebilir, ancak organoidlerin morfolojik değişikliklerini dikkatlice gözlemlemek önemlidir. Donmuş vile sıvı azot deposundan çıkardıktan sonra, hasta kaynaklı tümör organoidlerini bir dakika boyunca 37 santigrat derecede bir su banyosunda hafifçe çalkalayın.

Aşağılıkları su banyosundan çıkarın ve% 70 etanol ile silin. Daha sonra şişeyi biyogüvenlik kabinine yerleştirin. Tümör organoidlerini organoidler için ortam içeren 15 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Tümör organoidlerini ve ortasını beş kez yukarı ve aşağı pipetleme yaparak hafifçe karıştırmak için üç mililitre transfer pipeti kullanın. Pellet santrifüjleme ile tümör organoidlerini aşağı. Süpernatantı atın ve tümör organoid peletini beş mililitre taze ortamda yeniden dirsindirin.

Tümör organoid süspansiyonu bir T25 şişesine aktarın ve 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte kuluçkaya yatırın. İlk geçişin bir haftasından sonra, tümör organoid süspansiyonunu iki T25 şişesinden iki santrifüj tüpüne aktarın ve tümör organoidlerini santrifüjleme ile aşağı doğru saçma. Tümör organoid pelet hacmini tahmin edin ve peletin tüp başına 2,5 mililitre taze ortamda yeniden dirildi.

Tümör organoid süspansiyonu tek tüpte bir araya. Havuza alınan süspansiyonu 10 mililitre taze orta içeren bir T75 şişesine aktarın ve 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte kuluçkaya yatırın. 24 saatlik orta değişimden sonra, tümör organoidlerini 70 mikrometre ağ filtresi içeren bir filtre tutucu ile donatılmış bir hücre parçalanma ve dispersiyon aleti kullanarak kıymalayın.

15 mililitre tümör organoid süspansiyonu 10 kez seyreltin. Hücre süspansiyon dağıtıcısını kullanarak 384-well ultra düşük bağlanmalı küresel mikro plakada 40 mikrolitre seyreltilmiş tümör organoid süspansiyonu tohumladı. 24 saat sonra, kuyularda 20 mikromolar ila 1,0 nanomolar nihai konsantrasyon aralıklarında 10 seri seyreltmeden 0,04 mikrolitre test ajanı çözeltisi eklemek için sıvı bir işleyici kullanın ve plakayı altı gün boyunca kuluçkaya yatırın.

Kuluçkanın sonunda, test kuyularına hücre içi ATP ölçüm reaktifi ekleyin. Plakanın içeriğini karıştırmak ve plakayı yaklaşık 25 santigrat derecede 10 dakika kuluçkaya yatırmak için bir karıştırıcı kullanın. Hücre içi ATP içeriğini lüminesans olarak ölçmek için bir plaka okuyucu kullanın.

Üçüncü pasajdan 24 saat sonra, hücre toplama ve görüntüleme sistemine 40 mikrolitre orta ile 384 kuyulu ultra düşük ekli bir küresel mikro plaka ve bir hedef plaka yerleştirin. Hava kabarcıklarını çıkarmak için toplama haznesini altı mililitre kültür ortamı ve 1.500 kez G'de santrifüj ile iki dakika boyunca inşa edin. Toplama odasına dört mikrolitre tümör organoid süspansiyonu ekleyin ve toplama odasını sisteme ayarlayın.

Hücre kümelerinin dağıldıktan sonra bir dakika boyunca odanın dibine yerleşmesine izin verin ve ardından oda taramasını başlatın. Hücre kümelerinin otomatik seçimi için sistemde malzeme çekme boyutunu 140 ila 160 mikrometre olarak ayarlayın. Ardından, taranan görüntülerdeki seçili hücre kümelerinin kalitesini kontrol edin ve malzeme çekme ipuçlarını hedef plakaya kullanarak kuyu başına 10 hücre kümesi aktarın.

Mevcut çalışmada anti-kanser ajanlarının hasta kaynaklı tümör organoidi üzerindeki etkisi değerlendirildi. Tüm antikanser ajanlar için yüksek hassasiyet, 282'den küçük eğri değerleri altındaki alanda iki mikromolundan daha az olan yarı maksimal inhibitör konsantrasyon değerleri ile belirtilmiştir. Antikora bağımlı hücresel sitotoksiklik değerlendirmesi için iki farklı antikor varlığında tümör organoidlerinin yüzde sitolizi ölçüldü.

Sitoliz yüzdesi zamanla arttı. Bire bir hedef hücre oranına efektör ile altı saatte antikorlar olmadan, sitoliz %45'e ulaşırken, ikiye bir oranında sitoliz %70'e ulaştı Trastuzumab kullanan doğal öldürücü hücre aracılı sitoliz, bire bir hedef hücre oranına efektörde yaklaşık %60, altı saatte ikiye bir oranında ise %80 idi. Buna karşılık, cetuximab doğal öldürücü hücre aracılı sitoliz üzerinde doz bağımlı bir etkiye sahipti.

En yüksek cetuximab konsantrasyonunda, bire bir hedef hücre oranına efektörde %90 sitoliz, ikiye bir oranında ise %100 sitoliz gözlendi ve bu da cetuximab'ın yüksek etkililiğini gösterdi. Hasta kaynaklı tümör organoidleri kullanan yüksek verimli bir test sistemi, potansiyel anti-kanser ajanlarını değerlendirmekten daha üstündür ve ilaç değerlendirmesi ve kişiselleştirilmiş tıptaki gelişmeler için fırsatlar sunar.