Polianhidrit IL-1α Nanopartiküllerinin In vivo Antitümör Aktivitesinin Değerlendirilmesi

Bu protokoller, immün modülatör ataklarının antitümör aktivitesini incelemek için etkili bir yol sağlar. Ayrıca, dolaşımdaki sitokinler ve immün hücre popülasyonlarındaki ilişkili şansların analizi, önerilen bu yöntemler kullanılarak yapılabilir. Bu protokolün ana avantajı, bir tümörü implante etmenin ve büyümesini izlemenin kolay ve basit bir yolu olmasıdır. Bu tekniğin doğrudan anlamı, anti-kanser araştırmalarında belirli tedavilerin veya zorlukların etkinliğini değerlendirmektir. Ek olarak, bu tekniklerin bazı yönleri toksisite çalışmaları için uygundur. Başlamak için, donmuş bir murin EERL hücresi şişesini 37 santigrat derecede önceden ısıtılmış bir su banyosunda çözün ve bunları sıcak kültür ortamı içeren 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Ortamı çıkarmak için konik tüpü 25 santigrat derecede beş dakika boyunca 277 kez G'de santrifüjleyin. Daha sonra hücre damağını üç ila beş mililitre taze ortamda yeniden süspanse edin ve bir T25 hücre kültürü şişesine aktarın. Hücrelerin nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte büyümesine izin verin, Daha büyük şişelere genişletin ve her üç günde bir geçiş yapın. Tüm farelere istenen implantasyon için yeterli hücre olduğunda, şişeleri çıkarın, ortamı atın ve PBS hücrelerini nazikçe durulayın. Daha sonra dört mililitre% 0.25 tripsin EDTA ekleyin ve iki dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Tripsin reaksiyonunu durdurmak için taze ortam ekleyin ve hücre süspansiyonunu 50 mililitrelik konik tüplerde toplayın. Hücreleri taze ortamda yeniden askıya alın ve hücreleri sayın. Bir kez daha santrifüjleyin, ardından mililitre başına 10 milyon hücrelik bir son konsantrasyon elde etmek için hücrelere soğuk PBS ekleyin. Enjeksiyondan önce hücre süspansiyonunu buz üzerinde tutun. Yan bölgeyi bir etanol pedi ile dezenfekte edin. Farelere hücre süspansiyonu enjekte etmek için, şırıngaya 100 mikrolitre hücre süspansiyonu aspire edin ve tüm kabarcıkları ve ölü alanı üstten çıkarın. Daha sonra hücre süspansiyonunu anestezi uygulanmış farelere yavaş ve sabit bir şekilde deri altına enjekte edin. Hayvanları kendi kafeslerine yerleştirin ve anesteziden kurtulana kadar izleyin. Kan toplamak için, baskın olmayan elinizi kullanarak gevşek deriyi omzunuzun üzerinden kavrayın ve submandibular damarı 18 gauge iğne veya neşterle delin. 200 ila 300 mikrolitre kanı 1.5 mililitrelik bir polipropilen mikro santrifüj tüpüne veya serum ayırıcı tüpe toplayın. Kan alındıktan sonra, kanama durana kadar delinme bölgesine hafif bir baskı uygulayın. Fareleri kendi kafeslerine geri koyun ve anesteziden kurtulana kadar gözlemleyin. Toplanan kanın oda sıcaklığında 20 ila 30 dakika pıhtılaşmasına izin verin. Ardından tüpleri santrifüjlenmeye hazır olana kadar buzun üzerine yerleştirin. Pıhtılaşmış kanı dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 1.540 kez G'de santrifüjleyin ve serum tabakasını üstten dikkatlice toplayın. Serum veya plazma örneklerini buz üzerinde tutarken çözdürün. Daha sonra, herhangi bir hücre kalıntısını çökeltmek ve serum tabakasını üstten dikkatlice toplamak için numuneleri dört santigrat derecede beş dakika boyunca 1.540 kez G'de santrifüjleyin. Multipleks kiti oda sıcaklığına yerleştirin ve testi üreticinin protokolüne göre gerçekleştirin. Her fareyi sırt üstü yatırın ve karın bölgesi derisine% 70 etanol püskürtün. Farelerin sağ tarafından lenf düğümünü ve sol taraftan tümörü kesmek için forseps ve makas kullanın. Tümör büyükse, küçük parçalara ayırın ve dokudan yaklaşık 500 ila 600 miligram alın. Dokuları, üç ila beş mililitre RPMI ortamı içeren ilgili ayrıştırıcı tüplere yerleştirin. Otomatik bir ayrıştırıcı kullanarak dokuyu homojenize edin. Homojenizasyondan sonra, hücre süspansiyonunu 70 mikrometrelik bir filtreden 50 mililitrelik bir konik tüpe süzün. Ortamı çıkarmak için 25 santigrat derecede beş dakika boyunca 277 kez G'de santrifüjleyin. Hücreleri bir ila iki mililitre soğuk PBS'de yıkayın ve yeniden süspanse edin. Bir hemositometredeki canlı hücreleri saymak için% 0.4 tripsin mavisi boyama kullanın.İki ila üç milyon hücre almak için gereken hacmi hesaplayın ve bunları ilgili faks tüpüne aktarın. Santrifüj, hücreleri 25 santigrat derecede beş dakika boyunca 277 kez G'de saydı.Süpernatanı boşaltın ve hücreleri 300 mikrolitre PBS'ye yeniden süspanse edin. Tüp başına 0,5 ila bir mikrolitre zombi boyası ekleyin ve karanlıkta 20 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Hücreleri santrifüjleyin: Bir ila iki mililitre faks arabelleği ile yıkayın ve 200 mikrolitre faks arabelleğine yeniden süspanse edin. Üreticinin protokolüne göre FC reseptör blokeri ekleyin ve hücreleri 10 dakika inkübe edin. Daha önce açıklanan ayarlarda tekrar santrifüjleyin ve hücreleri bir ila iki mililitre faks tamponu ile yıkayın. Antikor kokteylini ekleyin ve karanlıkta dört santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, hücreleri santrifüjleyin ve bir ila iki mililitre faks tamponu ile yıkayın. 300 ila 400 mikrolitre% 2 paraformaldehit çözeltisi ekleyin ve fiksasyon için yeniden askıya alın. Hücreleri birkaç gün boyunca dört santigrat derecede saklayın veya çok renkli akış sitometresi ile hemen analiz edin. Bu çalışmada, polianhidrit IL-1'in antitümör aktivitesi