Name: Hepatosellüler Karsinomdaki Tümör-Stromal Etkileşimi Araştırmak İçin Üç Boyutlu Sferoid Modeli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-30T13:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Keşfedin, hepatosellüler karsinomda tümör-stromal etkileşimleri incelemek için asma damla yöntemiyle 3D sferoid modeli oluşturmayı. Bu teknik, ilaç tarama ve kanser biyolojisi araştırmaları için güçlü bir platform sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

MYWZ, İngiltere'nin Resmi Kalkınma Yardımı "ODA" ve Newton fonunun bir parçası olarak İş, Enerji ve Sanayi Stratejisinden Sorumlu Devlet Bakanı ve Newton Ödülü 2020 tarafından finanse edilir. SS, Cancer Research UK Advanced Clinician Scientist fellowship C53575/A29959 tarafından desteklenmektedir. SS, FO ve HR, Cancer Research UK, Fondazione AIRC ve Fundacion Cientifica de la Asociacion Espanola Contra el Cancer ortaklığıyla finanse edilen HUNTER'ın bir parçası olarak fon almaktadır.

1. Hücre hazırlığı
<ol><li>Tüm deneyleri Sınıf II laminer akış mikrobiyolojik güvenlik kabininde steril koşullar altında gerçekleştirin (bkz. Malzeme Tablosu).<ol>
<li>Kaputu açın ve hava akışının stabilizasyonuna izin verin.</li>
		<li>Önceki kullanıcıların olası kirlenmelerini ortadan kaldırmak için iç kaput yüzeyini p etanol ile iyice püskürtün.</li>
		<li>Dezenfektan çözeltisinin %5'ini 500 mL'lik bir cam kabın içine hazırlayın. Çözeltinin içindeki herhangi bir hücre üstnatantını veya hücre kalıntılarını atın.</li>
		<li>Tüm mikropipettes ve uç kutularını% 70 etanol ile iyice temizleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dulbecco'nun modifiye Eagle's medium (DMEM) yüksek glikoz ortamını ısı devre dışı fetal sığır serumu (FBS), %1 penisilin/streptomisin (100 birim/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomisin) ve 2 mM L-glutamin ile destekleyerek taze hücre kültürü ortamı hazırlayın. LX2 hepatik yıldız hücre hattı için FBS takviyesinin konsantrasyonunun %2'ye düşürülmesi.</li>
	<li>Deneyi başlatmadan önce sıcak kültür medyası.</li>
	<li>Huh7 ve Hep3B HCC tümör hücre hatlarını ve COS7 ve LX2 fibroblast hücre hatlarını sıvı nitrojen içinde depolama raflarından alın. Kriyoprezidasyonlu hücreleri hızla çözün.</li>
	<li>Çözülen hücreleri 2 mL taze kültür ortamı ile seyreltin. Oda sıcaklığında 4 dakika boyunca 200 x g'da santrifüj hücreleri. Süpernatant atın ve hücre peletini 1 mL taze sıcak kültür ortamına yeniden atın.</li>
	<li>T75 hücre kültürü şişeslerindeki tohum hücreleri. Bir hücre kültürü inkübatöründeki hücreleri% 60-% 70 izdiah edene kadar% 95 nemlendirilmiş koşullarda% 37 ° C'de% 5 CO2'de kuluçkaya yatırın.</li>
</ol>2. Hücre koleksiyonu
<ol><li>Kültür ortamlarını aspire edin ve hücreleri fosfat tampon salin (PBS) ile üç kez yıkayın.</li>
	<li>Yapışan hücreleri T75 şişelerinin altından ayırmak için önceden ısıtılmış 1x Trypsin 2 mL ekleyin. 37 °C'de bir inkübatörde 4 dakika kuluçkaya yatır.</li>
	<li>4 mL tam kültür ortamı ekleyerek trypsin'i devre dışı bırak. Hücre süspansiyonu ve santrifüj hücrelerini oda sıcaklığında 4 dakika boyunca 200 x g'da toplayın. Üstnatant atın ve hücreleri 4 mL taze kültür ortamına yeniden atın.</li>
</ol>3. Hücre sayımı
<ol><li>Santrifüj tüpündeki hücrelerin homojen dağılımını sağlamak için hücre süspansiyonunun hafifçe girdabı.</li>
	<li>10 μL pipet kullanarak, 10 μL hücre süspansiyonu ile 10 μL Trypan mavisi karıştırın. Dış hücre yüzeyinin boya ile tamamen boyanmasını sağlamak için karışımı dört kez hafifçe pipetleyin.</li>
	<li>Hemositometre kullanarak hücre sayısını sayın.<ol>
<li>İlk olarak, lekeli hücre süspansiyonu yüklemeden önce hemositometre sayım alanının üzerine bir kapak yerleştirin.</li>
		<li>Hücre süspansiyonunu içeren pipet ucunu hemositometrenin V kanalına yerleştirin. Uç içeriğini sayım slaydına yavaşça dışarı atabilirsiniz.</li>
		<li>Bulamacı, hücre sayımı için mikroskop aşamasına sabitlemeden önce birkaç dakika yetinmek üzere bırakın. NOT: Çift sayımı önlemek için, yalnızca büyük karenin iki tarafındaki hücreleri sayın.</li>
		<li>Üst veya sağ kararla çakışan hücrelerde sayın ve alt veya sol kararla çakışanlardan kaçının.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Toplam hücre sayısını hesaplayın. NOT: Ml başına hücre sayısı = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62868/62868eq01.jpg">
</li>
</ol>4. Fibroblast şartlandırılmış ortam koleksiyonu (CM)
<ol><li>Kültür medyasını epire edin ve LX2 hücrelerini PBS ile üç kez yıkayın.</li>
	<li>Yapışan hücreleri T75 şişelerinin altından ayırmak için önceden ısıtılmış 1x Trypsin 2 mL ekleyin. Şişeyi 37 °C'de bir inkübatörde 4 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>4 mL tam kültür ortamı ekleyerek trypsin'i devre dışı bırak. Hücre süspansiyonu ve santrifüj hücrelerini oda sıcaklığında 4 dakika boyunca 200 x g'da toplayın. Hücreleri adım 3'e göre sayın.</li>
	<li>Tohum 1 x 106 LX2 hücreleri 10 cm3 yemeklerde 37 °C'de 48 saat boyunca.</li>
	<li>Fibroblast CM'i 48 saat sonra toplayın. Yüzen hücreleri peletmek için oda sıcaklığında 4 dakika boyunca 200 x g'da santrifüj. Steril filtre CM'yi 20 mL şırınnaların altına sabitlenmiş 0,22 μm filtre kullanarak filtreleyin.</li>
	<li>Üst düzey CM'yi toplayın. NOT: Çözelti -80 °C'de 6 ay saklanabilir.</li>
</ol>5. Mükemmel küreseller için hücre yoğunluklarının doğrulanmış hali
<ol><li>Kültür medyasını aspire edin ve HCC hücre hatlarını PBS ile üç kez yıkayın.</li>
	<li>Yapışan hücreleri T75 şişelerinin altından ayırmak için önceden ısıtılmış 1x Trypsin 2 mL ekleyin. 37 °C'de bir inkübatörde 4 dakika kuluçkaya yatır.</li>
	<li>4 mL tam kültür ortamı ekleyerek trypsin'i devre dışı bırak. Hücre süspansiyonu ve santrifüj hücrelerini oda sıcaklığında 4 dakika boyunca 200 x g'da toplayın.</li>
	<li>Hücreleri adım 3'e göre sayın.</li>
	<li>Pipet, petri kabının 10 cm3'lük kapağının iç yüzeyindeki 20 μL'lik ortamda tümör hücre hatlarından (12000, 6000, 3000 , 1500, 1000, 750, 500, 250 ve 125 hücre) farklıdır.</li>
	<li>Küresel oluşum süreci için nemli koşullar sağlamak için kabın altına 10 mL steril PBS ekleyin.</li>
	<li>Hücre süspansiyonu da dahil olmak üzere ortamın nemli bir ortama sarkmasını sağlamak için 10 cm3'lük kabın kapağını ters çevirin. Asılı damlacıkları 3 gün bekletin.</li>
	<li>Orijinal damlacıkları astıktan 3 gün sonra ters bir mikroskop kullanarak 50x büyütmede küresellerin görüntülerini alın.</li>
</ol>6. Heterotipik tümör/stromal sferoidler
<ol><li>Küre oluşturmak için asılı damlacıklarda 1500 COS7 memeli fibroblast hücresi (1:1 oranı) ile 1500 Huh7 HCC hücresini askıya alın. Küreseller için nemli koşullar sağlamak için kabın altına 10 mL steril PBS ekleyin.</li>
	<li>Hücre süspansiyonu da dahil olmak üzere ortamın nemli bir ortama sarkmasını sağlamak için 10 cm3'lük kabın kapağını ters çevirin. Asılı damlacıkları 3 gün bekletin.</li>
	<li>Kültürün 3. gününden 10. gününe kadar ters bir mikroskop kullanarak küresellerin görüntülerini alın.<ol>
<li>10 cm3'lük tabağı mikroskop aşamasına getirin. Mikroskobun büyütmesini tüm küreseller için 50x olarak ayarlayın.</li>
		<li>Ekli bilgisayardaki mikroskop yazılımını açın ve odağını her küreselin net bir görüntüsüne sahip olacak şekilde ayarlayın. Elde edilen resimleri kaydetmek için mikroskop yazılımındaki Yakalama Aracı'nı kullanın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. LX2 CM'de Homotipik Hep3B küreseller
<ol><li>Küre oluşturmak için asılı damlacıklarda 3000 Hep3B HCC hücresini askıya alın. Küreseller için nemli koşullar sağlamak için kabın altına 10 mL steril PBS ekleyin.</li>
	<li>Hücre süspansiyonu da dahil olmak üzere ortamın nemli bir ortama sarkmasını sağlamak için 10 cm3'lük kabın kapağını ters çevirin. Asılı damlacıkları 3 gün bekletin.</li>
	<li>Hep3B küreselleri asılı damlacıklardaki LX2 hücrelerinden 20 μL taze CM'ye aktarın. NOT: Oluşan küresel sferoidlerin herhangi bir bozulmasını veya yaralanmasını önlemek için küresel transfer sürecinde steril otoklavlı filtresiz 200 μL pipet uçları kullanın. Bu aynı zamanda ana tek küresele bağlı olmayan kalan hücreleri ortadan kaldırmaktır.<ol>
<li>Transfer işlemi için otomatik kapatılmış 20 μL pipet kullanın. Pipet hacmini 2 μL'ye ayarlayın.</li>
		<li>Küresellerin oluştuğu 10 cm3'lük kabın kapağını ters çevirin. Kapağı hafif bir mikroskop sahnesinde sabitlayın. Her bir küreseli görünür hale getirmek için mikroskobun ince odağını ayarlayın.</li>
		<li>Piston düğmesine basarak mikropipetten havayı dikkatlice boşaltın. Pipet ucunu transfer edilecek küresel dahil olmak üzere damlacığın içine yerleştirin. Ucuyla dokunmadan küresele çok yaklaşın.</li>
		<li>Küreselin 2 μL ortamda mikropipette ucuna emilmesini sağlamak için piston düğmesindeki basıncı hafifçe bırakın.</li>
		<li>Yeni bir ortam / koşullandırılmış medya / tedaviye sahip, 10 cm3'lük yeni bir tabakta asılı yeni bir damlacık içine küresel aktarın. NOT: Işık mikroskobu kullanılarak tüm küresellerin yeni 10 cm3 çanağa başarıyla aktarıldığından emin olun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>LX2 CM'de transfer gününden (3. gün) kültürün 7. gününe kadar ters bir mikroskop kullanarak 50x büyütmede küresellerin görüntülerini alın.</li>
</ol>8. Küresel hacmin hesaplanması
<ol><li>Eşleşen küresellerden gelen görüntülerin günlük olarak yakalanabilmesi için her küreseloid için benzersiz bir sayısal tanımlayıcı atayın.</li>
	<li>Bir görüntü analizi yazılım paketi kullanarak büyüyen küresellerin görüntülerini analiz edin.<ol>
<li>Yazılım paketi içindeki her küresel görüntüyü açın. Freehand seçim aracını kullanarak ve her bir sferoid anahat. Analiz açılan düğmesinden Ölçümü Ayarla'yı ve ardından Alan'ı seçin. Tamam'a basın.</li>
		<li>Her bir küreselin etrafına manuel olarak bir daire çizin. Küre daire içine alınca, programın küresel alanı Piksel cinsinden hesaplamasına izin vermek için Ctrl + M tuşlarına basın. Küresel alanı bir birime dönüştürün. NOT: Sferoidmm3 hacmi =0.09403 × <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62868/62868eq02.jpg">
</li>
		<li>Görüntü yakalamanın ilk gününde hacmine göre küresel hacimdeki değişimi hesaplayın. NOT: Bu, küresel hacmi başlangıç hacmine normalleştirmek ve başlangıç boyutundaki doğal varyasyon göz önüne alındığında doğruluğu artırmaktır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Ferlay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics+for+the+year+2020%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics for the year 2020: an overview.</a> International Journal of Cancer. , (2021).</li>
<li>Llovet, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Hepatocellular carcinoma.</a> Nature Reviews Disease Primers. 7 (1), 6(2021).</li>
<li>Reeves, H. L., Zaki, M. Y., Day, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocellular+carcinoma+in+obesity%2C+Type+2+diabetes%2C+and+NAFLD%5BTitle%5D)+AND+%22Digestive+Diseases+%26+Sciences%22%5BJournal%5D)">Hepatocellular carcinoma in obesity, Type 2 diabetes, and NAFLD.</a> Digestive Diseases & Sciences. 61 (5), 1234-1245 (2016).</li>
<li>Forner, A., Reig, M., Bruix, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Hepatocellular carcinoma.</a> Lancet. 391 (10127), 1301-1314 (2018).</li>
<li>Reig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+treatment+of+hepatocellular+carcinoma.+Update+of+the+consensus+document+of+the+AEEH%2C+AEC%2C+SEOM%2C+SERAM%2C+SERVEI%2C+and+SETH%5BTitle%5D)+AND+%22Medicina+Clinica+%28Barc%29%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and treatment of hepatocellular carcinoma. Update of the consensus document of the AEEH, AEC, SEOM, SERAM, SERVEI, and SETH.</a> Medicina Clinica (Barc). 156 (9), 1-30 (2021).</li>
<li>Pfister, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NASH+limits+anti-tumour+surveillance+in+immunotherapy-treated+HCC%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">NASH limits anti-tumour surveillance in immunotherapy-treated HCC.</a> Nature. 592 (7854), 450-456 (2021).</li>
<li>Llovet, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trial+design+and+endpoints+in+hepatocellular+carcinoma%3A+AASLD+consensus+conference%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Trial design and endpoints in hepatocellular carcinoma: AASLD consensus conference.</a> Hepatology. 73, Suppl 1 158-191 (2021).</li>
<li>Llovet, J. M., Hernandez-Gea, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocellular+carcinoma%3A+reasons+for+phase+III+failure+and+novel+perspectives+on+trial+design%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Hepatocellular carcinoma: reasons for phase III failure and novel perspectives on trial design.</a> Clinical Cancer Research. 20 (8), 2072-2079 (2014).</li>
<li>Brown, Z. J., Heinrich, B., Greten, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+hepatocellular+carcinoma%3A+an+overview+and+highlights+for+immunotherapy+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Mouse models of hepatocellular carcinoma: an overview and highlights for immunotherapy research.</a> Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 15 (9), 536-554 (2018).</li>
<li>Nikolic, M., Sustersic, T., Filipovic, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+and+on-chip+systems%3A+Biomaterial+interaction+studies+with+tissues+generated+using+lung+epithelial+and+liver+metabolic+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">In vitro models and on-chip systems: Biomaterial interaction studies with tissues generated using lung epithelial and liver metabolic cell lines.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 120(2018).</li>
<li>Clark, A. M., Ma, B., Taylor, D. L., Griffith, L., Wells, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+metastases%3A+Microenvironments+and+ex-vivo+models%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Liver metastases: Microenvironments and ex-vivo models.</a> Experimental Biology and Medicine. 241 (15), 1639-1652 (2016).</li>
<li>Paish, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bioreactor+technology+for+modeling+fibrosis+in+human+and+rodent+precision-cut+liver+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">A bioreactor technology for modeling fibrosis in human and rodent precision-cut liver slices.</a> Hepatology. 70 (4), 1377-1391 (2019).</li>
<li>Brassard-Jollive, N., Monnot, C., Muller, L., Germain, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+3D+systems+to+model+tumor+angiogenesis+and+interactions+with+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">In vitro 3D systems to model tumor angiogenesis and interactions with stromal cells.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 594903(2020).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).</li>
<li>Kleinman, H. K., Philp, D., Hoffman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+extracellular+matrix+in+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Role of the extracellular matrix in morphogenesis.</a> Current Opinion in Biotechnology. 14 (5), 526-532 (2003).</li>
<li>Bissell, M. J., Radisky, D. C., Rizki, A., Weaver, V. M., Petersen, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+organizing+principle%3A+microenvironmental+influences+in+the+normal+and+malignant+breast%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">The organizing principle: microenvironmental influences in the normal and malignant breast.</a> Differentiation. 70 (9-10), 537-546 (2002).</li>
<li>Ronnov-Jessen, L., Petersen, O. W., Koteliansky, V. E., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+the+myofibroblasts+in+breast+cancer.+Recapitulation+of+tumor+environment+in+culture+unravels+diversity+and+implicates+converted+fibroblasts+and+recruited+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigations%22%5BJournal%5D)">The origin of the myofibroblasts in breast cancer. Recapitulation of tumor environment in culture unravels diversity and implicates converted fibroblasts and recruited smooth muscle cells.</a> Journal of Clinical Investigations. 95 (2), 859-873 (1995).</li>
<li>Shao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+stromal+fibroblast-modulated+3D+tumor+spheroid+model+for+studying+tumor-stroma+interaction+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A novel stromal fibroblast-modulated 3D tumor spheroid model for studying tumor-stroma interaction and drug discovery.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (156), e60660(2020).</li>
<li>Song, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+hepatic+stellate+cells+play+pivotal+roles+in+hepatocellular+carcinoma+cell+chemoresistance+and+migration+in+multicellular+tumor+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Activated hepatic stellate cells play pivotal roles in hepatocellular carcinoma cell chemoresistance and migration in multicellular tumor spheroids.</a> Scientific Reports. 6, 36750(2016).</li>
<li>Pingitore, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+multilineage+3D+spheroids+as+a+model+of+liver+steatosis+and+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Human multilineage 3D spheroids as a model of liver steatosis and fibrosis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (7), (2019).</li>
<li>Kozyra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hepatic+3D+spheroids+as+a+model+for+steatosis+and+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Human hepatic 3D spheroids as a model for steatosis and insulin resistance.</a> Scientific Reports. 8 (1), 14297(2018).</li>
<li>Khawar, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+dimensional+mixed-cell+spheroids+mimic+stroma-mediated+chemoresistance+and+invasive+migration+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Three dimensional mixed-cell spheroids mimic stroma-mediated chemoresistance and invasive migration in hepatocellular carcinoma.</a> Neoplasia. 20 (8), 800-812 (2018).</li>
<li>Feaver, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+in+vitro+human+liver+system+for+interrogating+non-alcoholic+steatohepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigations+Insight%22%5BJournal%5D)">Development of an in vitro human liver system for interrogating non-alcoholic steatohepatitis.</a> Journal of Clinical Investigations Insight. 1 (20), 90954(2016).</li>
<li>Wartenberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+multidrug+resistance+transporter+P-glycoprotein+in+multicellular+tumor+spheroids+by+hypoxia-inducible+factor+%28HIF-1%29+and+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology+Journal%22%5BJournal%5D)">Regulation of the multidrug resistance transporter P-glycoprotein in multicellular tumor spheroids by hypoxia-inducible factor (HIF-1) and reactive oxygen species.</a> Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 17 (3), 503-505 (2003).</li>
<li>Chen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+candidate+metastasis-associated+genes+in+three-dimensional+HCC+spheroids+with+different+metastasis+potential%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Clinical+Experimental+Pathology%22%5BJournal%5D)">Screening candidate metastasis-associated genes in three-dimensional HCC spheroids with different metastasis potential.</a> International Journal of Clinical Experimental Pathology. 7 (5), 2527-2535 (2014).</li>
<li>Venkataraman, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+self-association+of+basic+fibroblast+growth+factor+is+stabilized+by+heparin+during+receptor+dimerization+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Preferential self-association of basic fibroblast growth factor is stabilized by heparin during receptor dimerization and activation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (2), 845-850 (1996).</li>
<li>Bissell, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+structure%2C+nuclear+organization%2C+and+gene+expression+in+normal+and+malignant+breast%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tissue structure, nuclear organization, and gene expression in normal and malignant breast.</a> Cancer Research. 59, 1757-1763 (1999).</li>
<li>Ghosh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+of+melanoma+cells+profoundly+affects+gene+expression+profile%3A+a+high+density+oligonucleotide+array+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture of melanoma cells profoundly affects gene expression profile: a high density oligonucleotide array study.</a> Journal of Cellular Physiology. 204 (2), 522-531 (2005).</li>
<li>Delcommenne, M., Streuli, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+integrin+expression+by+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Control of integrin expression by extracellular matrix.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (45), 26794-26801 (1995).</li>
<li>Meshel, A. S., Wei, Q., Adelstein, R. S., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+mechanism+of+three-dimensional+collagen+fibre+transport+by+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Basic mechanism of three-dimensional collagen fibre transport by fibroblasts.</a> Nature Cell Biology. 7 (2), 157-164 (2005).</li>
<li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).</li>
<li>Yu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+therapy.+Ex+vivo+culture+of+circulating+breast+tumor+cells+for+individualized+testing+of+drug+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer therapy. Ex vivo culture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility.</a> Science. 345 (6193), 216-220 (2014).</li>
<li>Weiswald, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newly+characterised+ex+vivo+colospheres+as+a+three-dimensional+colon+cancer+cell+model+of+tumour+aggressiveness%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Newly characterised ex vivo colospheres as a three-dimensional colon cancer cell model of tumour aggressiveness.</a> British Journal of Cancer. 101 (3), 473-482 (2009).</li>
<li>Kondo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retaining+cell-cell+contact+enables+preparation+and+culture+of+spheroids+composed+of+pure+primary+cancer+cells+from+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Retaining cell-cell contact enables preparation and culture of spheroids composed of pure primary cancer cells from colorectal cancer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (15), 6235-6240 (2011).</li>
<li>Rajcevic, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorectal+cancer+derived+organotypic+spheroids+maintain+essential+tissue+characteristics+but+adapt+their+metabolism+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proteome+Sciences%22%5BJournal%5D)">Colorectal cancer derived organotypic spheroids maintain essential tissue characteristics but adapt their metabolism in culture.</a> Proteome Sciences. 12, 39(2014).</li>
<li>Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid-based+drug+screen%3A+considerations+and+practical+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach.</a> Nature Protocols. 4 (3), 309-324 (2009).</li>
<li>Friedrich, J., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+anti-tumor+therapy+in+3-D%3A+spheroids--old+hat+or+new+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Biology%22%5BJournal%5D)">Experimental anti-tumor therapy in 3-D: spheroids--old hat or new challenge.</a> International Journal of Radiation Biology. 83 (11-12), 849-871 (2007).</li>
<li>Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+generation+of+homogeneous+multicellular+tumor+spheroids+applicable+to+a+wide+variety+of+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+%26+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types.</a> Biotechnology & Bioengineering. 83 (2), 173-180 (2003).</li>
<li>Esparza-Baquer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TREM-2+defends+the+liver+against+hepatocellular+carcinoma+through+multifactorial+protective+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">TREM-2 defends the liver against hepatocellular carcinoma through multifactorial protective mechanisms.</a> Gut. 70 (7), 1345-1361 (2021).</li>
<li>Dangles-Marie, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+tumor+cell+defect+in+activating+autologous+CTLs+is+associated+with+inefficient+antigen+presentation+correlated+with+heat+shock+protein-70+down-regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional tumor cell defect in activating autologous CTLs is associated with inefficient antigen presentation correlated with heat shock protein-70 down-regulation.</a> Cancer Research. 63 (13), 3682-3687 (2003).</li>
<li>Timmins, N. E., Dietmair, S., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hanging-drop+multicellular+spheroids+as+a+model+of+tumour+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Hanging-drop multicellular spheroids as a model of tumour angiogenesis.</a> Angiogenesis. 7 (2), 97-103 (2004).</li>
<li>Mayer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+gastric+cancer+spheroids+recapitulate+growth+pattern+and+differentiation+phenotype+of+human+gastric+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Multicellular gastric cancer spheroids recapitulate growth pattern and differentiation phenotype of human gastric carcinomas.</a> Gastroenterology. 121 (4), 839-852 (2001).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hepatic+stellate+cell+lines%2C+LX-1+and+LX-2%3A+new+tools+for+analysis+of+hepatic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Human hepatic stellate cell lines, LX-1 and LX-2: new tools for analysis of hepatic fibrosis.</a> Gut. 54 (1), 142-151 (2005).</li>
</ol>

FO, Fibrofind limited'in yöneticisi ve hissedarıdır.

Deneysel hücre çizgilerinin büyüdüğü bağlam gen ekspresyon profillerini, yol analizlerini ve fonksiyonel kriterlerini etkiler. Örneğin, meme kanseri hücrelerinde, farklı onkojenik yollar arasındaki koordinasyon sadece kanser hücreleri 3D konformasyonda yetiştirilirse korunur27. 3D melanom ve meme kanseri sferoidlerinde deregüle edilmiş genler, ancak monolayer hücrelerde değil, in vivo insan tümörü ile daha alakalıdır28,29. Örneğin, meme epitel hücrelerinde ve tümör meslektaşlarında β1 integrin düzeyleri 2D formatta yetişen seviyelerden daha düşüktü29. Ayrıca, 3D yapılardaki fibroblastlar, plastik üzerinde kültürlenenlere kıyasla morfoloji ve hız açısından belirgin bir şekilde göç etme eğilimindedir30. Ek olarak, büyüme substratının mekanik sertliği, epitel hücrelerinde hücre dışı sinyalle düzenlenmiş kinazın (ERK)/Rho'nun deregülasyonu yoluyla normal epitel hücrelerinin kötü huylu dönüşümini teşvik eden spesifik yolları aktive eder31. Bu faktörler, 3D kültürler insan hastalığına daha uygun olduğu için geleneksel 2D kültüründen 3D küresel modellere geçişi tercih eder.
Mevcut çalışmada 3D tümör sferoid modeli üretmek için geleneksel laboratuvar araçları ve malzemeleri kullanılmıştır. Oluşan küreseller, fibroblastlardan gelen çoğalma sinyallerine, önemli ölçüde artan büyümelerinin gösterdiği gibi yanıt verdi. Bu model çok hücreli tümör sferoidler kategorisine aittir. Tümörosferler32, dokudan türetilmiş tümör küreleri33,34 ve organotipik çok hücreli sferoidler35 dahil olmak üzere üç farklı 3D tümör sferoid kategorisi daha vardır. Çok hücreli tümör sferoidlerinde tümör hücreleri, kültür damarının dibine dokunmadan küre oluşturmak için bir araya gelebilmeleri için düşük yapışkanlı koşullarda askıya alınır36. Bu ankrajdan bağımsız tekniği sunmak için döner sistemlerden, sıvı kaplama tekniklerine ve kaplamasız ultra düşük ataşmanlı U şeklindeki plakalara kadar çeşitli yaklaşımlar 37 uzadı. HCC'de, in vitro sferoid kültürlerinin çoğu yuvarlatılmış küreseller oluşturmak için ultra düşük ataşman 24 veya 96 kuyu plakalarını kullanır18,19,20,21,22. Ancak bu teknik uygun maliyetli değildir ve herhangi bir yanlışlıkla hücre-plastik temasını dışlamaz. Diğer sistemler karaciğer mikro dokuları üretmek için trans-wells23 veya karaciğer dilimleri12 kullanır. Çeviri çalışmalarında insan dokularını kullanmak altın standarttır, ancak birçok araştırma grubu tarafından her zaman mevcut veya erişilebilir değildir. Mevcut yaklaşım asılı damlacıklar teorisinden yararlandı. Hücre süspansiyonu eklenir, böylece tümör sferoidleri erişilebilir bir sıvı-hava arayüzünde oluşturularak tek yuvarlatılmış küreler oluşturur38. Bu tekniği kullanmanın avantajları, herhangi bir hücre-plastik temasının olmaması ve tümör ve fibroblast hücreleri arasındaki otokrin ve parakrin çapraz sapı inceleme kolaylığıdır. Bu model, karaciğeri HCC gelişiminden korumada parenkimal olmayan TREM2'nin önemini deşifre eden başka bir çalışmada daha da doğrulandı39. Bu çalışma, hem Hep3B hem de PLC/PRF5 sferoidlerinin hacminin kontrol LX2 CM ile TREM2-overexpressing LX2 CM'nin Wnt'ye bağımlı bir şekilde daha yüksek olduğunu göstermiştir39.
Mevcut çalışmada fibroblastlar, bu ortak kültürün proliferatif etkisini araştırmak için küresel oluşumdan önce tümör hücreleri ile karıştırıldı. Diğerleri, tümöre stromal hücre göçini incelemek için bir tümör küreseli oluşturduktan sonra tümör hücre süspansiyonu ile fibroblastlar, endotel hücreleri ve bağışıklık hücreleri ekledi40,41. Mevcut heterotipik sferoid modeli, daha önce bildirilen modellere ve orijinal in vivo tümöre benzer bir büyüme modeli gösterdi; küresel büyüme ve ardından gecikmiş bir büyüme evresi gösterir, büyük olasılıkla besinlerin tükenmesi ve nekrotik çekirdeğin genişlemesi nedeniyle42. Bu çalışma, küresel oluşuma yardımcı olmak için büyüme faktörleri ve mitojenler eklemek yerine, fibroblastlarla doğrudan temastan veya fibroblast CM'deki salgılarından bu büyüme faktörlerine sahip olarak daha fizyolojik bir yaklaşım kullanmıştır. LX2 hücrelerinin TGFβ1 veya PDGF43 ile tedavi edilerek daha fazla aktive edilebileceğinden bahsetmek önemlidir. LX2 hücreleri, farklı deneysel ayarlar için ortamı çıkarmadan önce 48 saat boyunca 10 ng/mL TGFβ1 ile tedavi edilmiştir. LX2 hücreleri PBS ile üç kez yıkandı (herhangi bir doğrudan TGFβ1 etkisini dışlamak için) ve daha sonra CM'yi toplamadan önce 24 saat daha taze ortam eklendi. TGFβ1 uyarılmış LX2'den toplanan CM, Hep3B küresellerinin büyümesini LX2 kontrolünden CM'den daha yüksek bir oranda indüklemektedir (veriler gösterilmemektedir). Bu esnek sistem, farklı kanser hücrelerinin ortak kültürlerine artı/eksi fibroblastların yanı sıra hasta kaynaklı çizgilere de kendini ödünç verebilir. Ayrıca, in vivo çalışmalar için dozlamayı bilgilendirmek için hızlı bir şekilde benimsenebilecek ve çevirisel bir ilaç keşif boru hattına eklenebilen ilaçlar için orta verimli bir tarama tahlilini sunabilir.
Mevcut çalışmanın bir sınırlaması, ölümsüzleştirilmiş hücre çizgilerinin yeni izole edilmiş HCC tümör hücreleri ve kanserle ilişkili fibroblastlar yerine küresel oluşumda kullanılmasıdır. Diğer bir sınırlama, homotipik Hep3B sferoidinin LX2'den CM ile diğer fibroblast olmayan hücre çizgilerinden CM yerine taze medyada büyümesini karşılaştırmaktır. İkinci sınırlama, fibroblastlara ilgi çekici bir genin genetik olarak değiştirilmesi ve ardından CM'nin vahşi tipten genetik olarak tasarlanmış fibroblastlara homotipik sferoidlere uygulanması ile ele alınabilir.

Karaciğer hastalığı ve diğer kanser türlerinin tedavilerindeki gelişmelere rağmen, karaciğer kanserinden kaynaklanan küresel insidans ve mortalite artmaya devam etti. 2018 yılında karaciğer kanseri kolorektal ve mide kanserini geçerek küresel olarak kansere bağlı ölümlerin en yaygın ikinci nedeni oldu1. 2020 yılında, dünya çapında toplam kanser vakalarının% 4,7'sini oluşturan 9.00.000'den fazla yeni tanı vardı1. Karaciğer kanserinin en yaygın şekli olan HCC'nin gelişimi için önemli risk faktörlerinin iyi karakterize olduğu göz önüne alındığında, bu özellikle hayal kırıklığı yaratmaktadır2. Siroz, HCC gelişimi için en yaygın risk faktörüdür ve vakaların% 80'i yerleşik sirozun arka planında gelişir2. Siroza ve dolayısıyla HCC'ye ilerleyen kronik karaciğer hastalıkları hepatit B virüsü (HBV), Hepatit C virüsü (HCV), alkole bağlı karaciğer hastalığı (ARLD), alkolsüz yağlı karaciğer hastalıkları (NAFLD) - ikincisi obezite ve tip 2 diabetes mellitus (T2DM)2,3'e atfedilir. HCC için mevcut yönetim protokolleri evreye bağlıdır ve en sık kötü bir sonuca sahip olan ileri kanserli olanlar için sınırlıdır4. Kinaz inhibitörleri kullanılarak önemli gelişmeler olmuştur ve daha yakın zamanda, bağışıklık-onkoloji tedavileri, gerçekçi olmak gerekirse, ileri karaciğer kanserleri olan hastaların sadece bir azınlığı yararınadır5. Ayrıca, batı ülkelerinde yeni teşhis edilen HCC vakalarının% 50'sinden fazlasını oluşturan en hızlı büyüyen temel neden olan NAFLD'li hastalarda ortaya çıkan HHC'lerin Programlanmış ölüm 1 (PD1) kontrol noktası inhibitörü tedavisine daha dirençli olabileceğinden endişe edilmektedir6.
HCC'li hastalar için klinik çalışmalara büyük bir yatırım yapıldı, klinik çalışmalarda ve uç noktalarında önemli gelişmeler de dahil olmak üzere7. On yıllık başarısızlıklardan sonra, bu yatırımlar hastalar için fırsatları değiştirmeye başladı. Bununla birlikte, gerçek şu ki, yanıt verenlerin genel oranı nispeten zayıf kalır ve denemelere alınan hastalar genellikle kliniklerde bakılanları kötü temsil eder. Tehlike, ilerlemelerin maliyetli olması ve çoktan çok az sınaya fayda sağlamasıdır. Tek kullanımlık veya kombinasyon için daha fazla aday tedavi ortaya çıktıkça, in vivo yanıtları daha tahmin eden preklinik modellere sahip olmak önemlidir. Bunlar, insan HCC heterojenliğini ve patolojik karmaşıklığı daha iyi yansıtan hasta yanıtlarında görülen değişkenliğe katkıda bulunan ek faktörleri içeren modeller olması muhtemeldir8. Tümör evrimi, büyümesi ve ilerlemesinin biyolojisini anlamaya yardımcı olmak için HCC'nin in vivo patofizyolojik koşullarını yeniden yaratan sistemlere ihtiyaç vardır. Kronik karaciğer hastalıklarının ve HCC'nin mevcut deneysel modelleri genellikle üç ana kategoriye ayrılır: in vivo hayvan bazlı modeller (gözden geçirilmiş in9), in vitro kültürler10 ve ex vivo11,12 modelleri. Hayvan temelli yaklaşımlar, HCC de dahil olmak üzere kronik karaciğer hastalıklarını incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır; bununla birlikte, genetik değişkenlik, yüksek işletme maliyetleri ve türler arasındaki farklı bağışıklık sistemleri bu modellerin uygulanmasındaki ana sınırlamalar arasındadır9. Bazı ex vivo modelleri, diğer in vitro hücre hattı modellerine kıyasla insan dokularına odaklanmak için mükemmel bir araç sağlarken, doku mevcudiyeti ve sınırlı deneysel zaman seyri büyük ölçekte kullanımlarını engeller.
Öte yandan, in vitro hücre hattı modelleri sınırlı kaynaklarla çalışan bilim adamları için iyi bir seçenek olmaya devam ediyor, daha az taze insan dokusu kaynağına ihtiyaç duyuyor10. Bu modeller ayrıca daha karmaşık in vivo modellere geçmeden önce ilaç seçiminin hedef doğrulamasına yardımcı olmak için ilk ekran olarak kullanılabilecek bir araç sağlar. Geleneksel 2D monolayer kültürlerinin 3D kültürler halinde son zamanlarda değiştirilmesi, bu in vitro modellerin etkinliğini artırmıştır13,14.
3D in vitro modeller, insan normal ve patolojik koşullarında görülen kritik özellikleri yeniden yakalayabilir. Fizyolojik koşullar altında, sinyal transdüksiyonu hücresel çapraz konuşma ve diğer bağ dokusu molekülleri ile etkileşim yoluyla başlatılır, yani hücre dışı matris (ECM) proteinleri, 3D etkileşim ağı oluşturur15,16. Tümör, kötü huylu dönüşüm sırasında 3D küresel bir formda gelişir ve bunun için tümör dışı / tümör ara fazında oksijen ve besin maddeleri kolayca bol miktarda bulunur. Aynı zamanda, hipoksik durumlar tümör çekirdeğinde baskındır. Besin mevcudiyetinde bu heterojenlik, tümörogenez düzenleyen mekansal olarak farklı sinyalizasyon ve metabolik yolların aktivasyonu ile sonuçlanır. Bu koşullar, hücrelerin fizyolojik olarak alakasız bir şekilde sert kültür plastiği üzerinde büyüdüğü geleneksel 2D monolayer kültürlerinde14'te zayıf bir şekilde yeniden kapsüllenir. Kanser hücreleri ayrıca tümör mikroçevrim içindeki birincil EKM, büyüme ve istila sinyali kaynağı olan diğer parenkimal olmayan hücrelerle de iletişim kurar. 2D kültürlerin aksine, 3D in vitro modeller bu tümör-stromal etkileşimi incelemek için daha uygun bir platform sağlayabilir17.
3D modeller HCC alanında yaygın olarak kullanılmaktadır ve mikro dokunun oluşma şekline göre değişir18,19,20,21,22,23. Bu modellerin çoğu, küresel oluşum sürecinde ultra düşük bağlayıcı plakalar18,19,20,21,22 veya trans-wells23'ü kullandı. Açıklanan protokol, asılı damlacık tekniğini alternatif, plastik içermeyen ve uygun maliyetli in vitro 3D tümör sferoid modeli olarak tanıtmaktadır. Bu, fibroblastların tümör hücrelerinin çoğalması üzerindeki parakrin ve otokrin rollerini 3D formatta değerlendirmeyi kolaylaştırabilir.

<table><tbody><tr><td>1x Tripsin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>59429C</td><td></td></tr><tr><td>2 mL tüpler</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biorender</td><td>Biorender.com</td><td>Çevrimiçi</td><td></td></tr><tr><td>Sınıf II laminer akış BioMAT2 başlık</td><td>Medair Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s değiştirilmiş Kartal' s orta (DMEM)</td><td>Biosera</td><td>M-D1107</td><td></td></tr><tr><td>Excel yazılımı</td><td>Microsoft office 365</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Graphpad prizma yazılımı</td><td>GraphPad yazılımı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isı devre dışı bırakılmış fetal sığır serumu (FBS)</td><td>life tech</td><td>105000064</td><td></td></tr><tr><td>Image J yazılımı</td><td>Fiji</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-glutamin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7513-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / streptomisin (100 birim / ml penisilin ve 100 &mu; g / ml streptomisin)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>P0781-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Petri kabı 90 mm, üç bacalı</td><td>Greiner</td><td>633175</td><td></td></tr><tr><td>Tripan mavisi</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Virkon ve ticaret; Geniş Spektrumlu Dezenfektan, 5kg Kova Rely</td><td>+ On & Trade;</td><td>SCI-129999</td><td></td></tr><tr><td>Ziess ters mikroskop</td><td>Ziess</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

hepatosellüler karsinomdaki tümör-stromal etkileşimi araştırmak İçin Üç boyutlu sferoid modeli

A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma

Karaciğer kanserinin baskın formu olan ileri hepatosellüler karsinom (HCC) için iyi tolere edilen ve yaygın olarak etkili tedavilerin agresifliği ve eksikliği, kansere bağlı ölümlerin ikinci en yaygın nedeni olarak derecesini rasyonelleştirir. Klinik gelişim için en iyi terapötik adayları seçmek ve kişiselleştirilmiş tıbbın teslimine yardımcı olmak için insan koşullarını yeniden sağlamak için preklinik modellerin uyarlanmış olması gerekir. Üç boyutlu (3D) hücresel küresel modeller, iki boyutlu (2D) monolayer kültürlere yeni bir in vitro alternatif olarak umut vaat ediyor. Burada, tek tek hücrelerin asılı damlacıklarda muhafaza edildiğinde agrega yeteneğini sömüren ve standart monolayerlerden daha fazla in vivo ortamı temsil eden bir 3D tümör küresel modelini tanımlıyoruz. Ayrıca, 3D sferoidler homotipik veya heterotipik hücrelerin birleştirilmesiyle üretilebilir, hücresel heterojenliğin daha fazla yansıtıcısı vivo, potansiyel olarak ilerlemeyi ve tedavi yanıtlarını etkileyebilecek çevresel etkileşimlerin incelenmesini sağlar. Mevcut araştırma, standart 10 cm3 Petri tabaklarının kapaklarındaki hücre süspansiyonlarını hareketsiz hale getirerek hücre yoğunluğunu 3D homotipik ve heterotipik tümör sferoidleri oluşturacak şekilde optimize etti. Homotipik ve heterotipik tümör/fibroblast sferoidler için büyüme eğrileri oluşturmak için boyuna analiz yapıldı. Son olarak fibroblastların (COS7 hücreleri) ve karaciğer miyofibroblastlarının (LX2) homotipik tümör (Hep3B) sferoidler üzerindeki proliferatif etkisi araştırıldı. 3.000 hücrelik bir tohumlama yoğunluğu (20 μL ortamda) başarılı bir şekilde Huh7 /COS7 heterotipik sferoidleri verdi ve bu da 8. Bu bulgu LX2 (insan hepatik yıldız hücre hattı) şartlandırılmış ortamda (CM) kültürlenen Hep3B homotipik sferoidler kullanılarak doğrulandı. LX2 CM, tümör sferoidlerini kontrol etmekle karşılaştırıldığında Hep3B sferoidlerinin çoğalmasını tetikledi. Sonuç olarak, bu protokol 3D tümör sferoidlerinin tümör-stromal etkileşimleri daha kapsamlı bir şekilde incelemek için basit, ekonomik ve ön ekran bir in vitro araç olarak kullanılabileceğini göstermiştir.

Çok katmanlı 3D formatta kültürlenen hücreler, tümör mikroçevrinin karmaşıklığını geleneksel 2B kültürlere göre daha doğru bir şekilde yansıtır24,25. Daha önce, birçok çalışma sferoid oluşumunu başlatmak için farklı mitojenler ve büyüme faktörleri26 ile küresel kültür medyasını desteklemiştir. Bununla birlikte, bu çalışmada fibroblastların veya CM'lerinin eklenmesi, küresel büyümeyi hızlandırmak için temel mitojenler ve büyüme faktörleri sağlar.
Şekil 1, Huh7 insan HCC hücrelerinin 3 gün boyunca 20 μL taze ortamda 12.000'den 125 hücreye kadar azalan bir tohumlama yoğunluğunda tohumlandığını gösteren bir pilot çalışmadan elde edilen verileri tasvir ediyor. 12.000 hücrelik bir tohumlama yoğunluğu, hücre tohumlama yoğunluğunu yarıya indirtikten sonra bile düzeltilmeyen asimetrik bir şekle sahip küreseller elde etti. Bununla birlikte, 3000 hücreden oluşturulan küreseller daha yuvarlak göründü (Şekil 1, üst sıra). Hücre konsantrasyonunun daha da azalması ne tek küreler (125, 250, 500 hücre yoğunluklu küreler) oluşturmayı başardı ne de düzenli küresel benzeri bir görünüme (1000 ve 1500 hücre yoğunluklu küreseller) sahipti. 500 tümör hücresi yoğunluğunda birçok küçük küre oluştuğunu belirtmek gerekir; ancak 50x büyütmede sadece bir küçük sferoid yakalanmıştı (Şekil 1, üst sıra). Aynı optimize edilmiş protokol COS7 primat böbrek fibroblast hücre hattına da uygulanmıştır (Şekil 1, orta sıra). 20 μL asılı damlacıklarda 125, 250 ve 500 COS7 fibroblastlarının askıya alması, birden fazla küçük küresel sferoid ile bir yuvarlatılmış küresel ile sonuçlanırken, daha yüksek hücre yoğunlukları (1000, 1500 ve 3000) tek yarı yuvarlak sferoidler oluşturdu. Huh7 tümör sferoidlerine benzer şekilde, daha yüksek hücre süspansiyonları (6.000 ve 12.000 hücre/küre) düzensiz hücre agregalarının oluşumuna neden oldu ve bu nedenle daha yüksek hücre konsantrasyonları atıldı (Şekil 1, orta sıra). Huh7/COS7 heterotipik hücre süspansiyonlarının düşük yoğunlukları (125, 250 ve 500 hücre/küre) birden fazla yüzen veya yarı bağlı küresel ile tek bir küresel üretti (Şekil 1, alt sıra). 1000 ve 1500 hücreli heterotipik küreseller yarı yuvarlakken, 3000 hücrelik (hücre tipi başına 1500) tohumlama yoğunluğu yuvarlatılmış bir 3D küreseloid verdi. Daha önce de belirtildiği gibi, daha yüksek hücre yoğunlukları iyi tanımlanmış küreseller yerine agregaların oluşumuna neden oldu (Şekil 1, alt sıra). Sonuç olarak, insan HCC tümörlerine benzer şekilde 3000 hücre yoğunluklu küreseloid yuvarlandı ve daha fazla deney için uyarlandı. Hücre süspansiyonlarının 3 gün boyunca asılı damlacıklar olarak kültlendirilmesi küresel oluşumu teşvik etmek için yeterliydi.
Mevcut bağlamda küresel oluşum için en iyi hücre konsantrasyonu ve zaman noktası optimize edildikten sonra, birlikte kült olan tümör ve fibroblast hücre hatlarının proliferatif etkisi boyuna olarak değerlendirildi. Şekil 2 ve Şekil 3, 3 . günden 10. güne kadar izlenen Huh7/COS7 heterotipik sferoidleri (küresel başına 3000 toplam hücre numarası) göstermektedir. Homotipik Huh7 ve COS7 küreselleri (her biri 1500 hücre) kontrol görevi gördü. 4. günden itibaren heterotipik küreseller homotipik sferoidlere kıyasla ideal yuvarlak benzeri bir şekilde büyüdü (Şekil 2). Heterotipik sferoidin başlangıç hacmi her homotipik sferoidden daha büyüktü. Küresellerin büyümesi, küresel hacimde normal varyasyonu önlemek için küresel oluşum gününde başlangıç hacmine göre hacimlerindeki değişiklik olarak hesaplanmıştır (gün 3, Şekil 3). Heterotipik küreseller başlangıçta 4. günden 7. güne kadar hızlı bir büyüme evresi ve ardından 8. günde daha yavaş bir büyüme evresi göstermiştir (Şekil 2, üst sıra ve Şekil 3). Küresel hacim 9 ve 10 günlerinde azaldı, muhtemelen besinlerin tükenmesini veya hipoksik bir çekirdek ve hücre ölümünü yansıttı.
Buna karşılık homotipik Huh7 ve COS7 küreselleri çok daha yavaş bir hızda büyüdü (Şekil 2, orta ve alt sıralar; Şekil 3). Homotipik sferoidler kültürün beşinci gününe kadar (küresel oluşumdan iki gün sonra) nispeten statik bir büyüme eğrisi sergilediler. 6. günden itibaren homotipik sferoidler, heterotipik küresellerden önemli ölçüde daha düşük bir oranda da olsa büyüme eğrilerinde kademeli bir artış göstermeye başladı (Şekil 3). Sonuç olarak, tümör/fibroblast heterotipik sferoidler homotipik sferoidlerden daha yüksek oranda büyür ve tümör hücrelerinin ve fibroblastların doğrudan temasının tümör sferoidlerinin boyutunu artırdığını düşündürür.
Son olarak, yukarıdaki bulguları doğrulamak ve mezenkimal hücrelerin karaciğerle ilgili bir bağlamda HCC sferoidlerinin çoğalması üzerindeki parakrin etkisini incelemek için, LX2 hepatik yıldız hücrelerinden (Şekil 4 ve Şekil 5) düzenli taze medyada (Şekil 4 ve Şekil 5) düzenli taze medyada 3 günlük homotipik Hep3B HCC sferoidleri yetiştirildi. İlk bakışta, 3000 Hep3B hücresi 3 gün sonra mükemmel yuvarlatılmış küreseller oluşturdu (Şekil 4). Hep3B sferoidleri 3. günden 7. güne kadar taze medyada sürekli çoğalma gösterdi (Şekil 4, üst sıra). Hep3B sferoidleri LX2 CM'de (Şekil 4, alt sıra) korunduğunda büyüme hızı artmıştır. Hep3B küresel büyümesinde medyaya bağımlı bu dönüşüm, 4. günden deneyin sonuna kadar istatistiksel öneme sahiptir (Şekil 5), tümör sferoidlerinin fibroblast güdümlü çoğalmasını düşündürmektedir.
Sonuç olarak, bu çalışma HCC tümör hücreleri ve farklı fibroblast hücre hatları arasındaki çapraz sapı kullanmak ve bu doğrudan ve dolaylı hücresel etkileşimin proliferatif önemini araştırmak için mevcut 3D küresel kültürleri başarıyla değiştirmektedir (Şekil 6). Tümör hücrelerinin çevredeki mikroçevre ile etkileşimini iyileştirmek için oluşan küresellerin daha fazla karakterizasyonuna ihtiyaç vardır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62868/62868fig01.jpg"> Şekil 1: Küresel oluşum için en uygun hücre yoğunluğunun optimizasyonu. Sütunlar farklı hücre tohumlama yoğunluklarını, satırlar ise Huh7 hücrelerinden (üst satır), COS7 hücrelerinden (orta satır) ve Huh7/COS7 heterotipik hücrelerinden (alt satır) oluşan küreselleri temsil eder. Görüntüler, 125, 250, 500, 1000, 1500, 3000, 6000 ve 12000 hücreleri (soldan sağa) 20 μL ortamda 3 gün boyunca askıya aldıktan sonra oluşan küreselleri temsil eder. Pilot çalışma durum başına iki küresel içeriyordu ve görüntüler 50x büyütme, ölçek çubuğu = 200 μm'de çekildi <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62868/62868fig01large.jpg" target="_blank">.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62868/62868fig02.jpg"> Şekil 2: Heterotipik ve homotipik küresel büyüme. Sütunlar küresel görüntülerin çekildiği günü temsil eder ve satırlar Huh7 hücrelerinden (üst satır), COS7 hücrelerinden (orta satır) ve Huh7/COS7 hücrelerinden (alt satır) oluşan küreseller için temsili görüntüler gösterir. Görüntüler, soldan sağa farklı zaman noktalarının her durumundan (homotipik Huh7, COS7 veya Huh7/COS7 heterotipik küreseller) 3000 hücreyi askıya aldıktan sonra oluşan küreselleri temsil eder. Deney, durum başına 10 küresel içeriyordu ve görüntüler 50x büyütme, ölçek çubuğu = 200 μm'de çekildi <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62868/62868fig02large.jpg" target="_blank">.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62868/62868fig03.jpg"> Şekil 3: Heterotipik ve homotipik küresel büyümenin boyuna analizi. Grafikte heterotipik Huh7/COS7 küresellerinin homotipik Huh7 ve COS7 küresellere karşı büyüme eğrisi göstermektedir. Veriler ortalama ± s.e.m olarak sunulur; n = 10 bağımsız küresel. ** s &lt; 0.01; s &lt; 0.001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62868/62868fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62868/62868fig04.jpg"> Şekil 4: LX2 CM'de Homotipik Hep3B sferoidlerin büyümesi. Sütunlar küresel görüntülerin yakalandığı günü temsil eder ve satırlar, taze DMEM kültür medyasında (üst satır) veya LX2 CM'de (alt satır) kültürlenen Hep3B küresellerinin temsili görüntülerini gösterir. Deney, durum başına yedi küresel (taze ortam veya LX2 CM) içeriyordu ve görüntüler 50x büyütme, ölçek çubuğu = 200 μm'de çekildi <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62868/62868fig04large.jpg" target="_blank">.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62868/62868fig05.jpg"> Şekil 5: Homotipik Hep3B küresel büyümenin boyuna analizi. Grafik, taze DMEM kültür medyasında veya LX2 CM'de Hep3B küresellerinin büyüme eğrisini gösterir.m ±. n = 7 bağımsız küresel. s &lt; 0.001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62868/62868fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62868/62868fig06.jpg"> Şekil 6: Küresel oluşum sürecinin şematik gösterimi. Hücre süspansiyonu 10 cm3 Petri kabının iç kapağına pipetlenmiştir. Kapak ters çevrilir ve homotipik veya heterotipik küresel oluşuma izin vermek için 3 gün boyunca tutulur. Küresel görüntüler 50x büyütmede alınır. Şekil, web tabanlı bir bilim çizim aracı kullanılarak oluşturulur (bkz. Malzeme Tablosu). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62868/62868fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

İlgili insan hastalığını sadakatle nükseden kapsamlı in vitro modeller eksiktir. Mevcut çalışma, insan hepatosellüler karsinomunda tümör-stromal etkileşimi incelemek için güvenilir bir in vitro araç olan üç boyutlu (3D) tümör sferoid oluşturma ve kültürü ssunuyor.

Hepatosellüler Karsinomdaki Tümör-Stromal Etkileşimi Araştırmak İçin Üç Boyutlu Sferoid Modeli

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver ...

3D tümör sferoidleri in vitro kanser araştırmalarında altın standart olarak geleneksel 2D monolayer tekniğinin yerini almıştır. Bu modeller, tümör mikroçevrinin heterojenliğini yansıtan ve mekansal etkileşimlerin sömürülmesine izin veren birden fazla hücre tipinin ortak kültürüne izin verir. 3D sferoidler oluşturmak için asılı damlacık yöntemini kullanmanın avantajları, hücre-plastik etkileşiminin olmaması ve tümör hücreleri ile tümör olmayan hücreler arasındaki etkileşimi inceleme kolaylığıdır.Bu teknik aynı zamanda tümör-stromal etkileşimi modellemek için tekrarlanabilir ve uygun maliyetli bir yol sağlar. 3D tümöroidler değerli preklinik modellerdir ve genellikle ilaç tarama aracı olarak kullanılırlar. Bu yöntem, birden fazla bileşiğin tümör büyümesi ve çevresindeki mikroçevrim üzerindeki farmakolojik etkilerini incelemek için uygulanabilir.Küresel oluşum süreci kullanıcı dostudur ve geleneksel hücre kültürü laboratuvar ekipmanı gerektirir. Küreseller herhangi bir tezgah üstü ters ışık mikroskobu kullanılarak görüntülenebilir ve küresel boyut ve şeklin analizi yaygın olarak bulunan çevrimiçi görüntü analiz yazılımı kullanılarak gerçekleştirilebilir. Başlamak için, Huh7 ve Hep3B HCC tümör hücre hatlarını ve COS-7 ve LX2 fibroblast hücre hatlarını sıvı nitrojen içinde depolama raflarından çıkarın ve hızla çözün.Buzları çözdükten sonra, çözülmüş hücreleri iki mililitre taze kültür ortamı ile seyreltin. Hücreleri santrifüjle. Süpernatant atın ve hücre peletini bir mililitre taze sıcak kültür ortamında yeniden atın.Daha sonra T75 hücre kültürü şişelerindeki hücreleri tohumlayın ve hücreler 60 ila 70 ve konfluensiye ulaşana kadar bir hücre kültürü inkübatöründe kuluçkaya yatırın. Hücre koleksiyonu için, kültür medyasını aspire edin ve hücreleri PBS ile üç kez yıkayın. Daha sonra yapışık hücreleri şişelerin dibinden ayırmak için iki mililitre önceden ısıtılmış tripsin ekleyin ve 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.Dört dakika sonra, dört mililitre tam kültür ortamı ekleyerek tripsin'i devre dışı bırakın ve hücre süspansiyonu toplayın, ardından hücreleri santrifüjleyin ve hücreleri bir mililitre taze kültür ortamında canlandırmadan önce süpernatantı atın. Son olarak, üç mililitrelik taze kültür ortamı ekleyin. Hücreleri saymak için, hücre süspansiyonu hafifçe girdap.Daha sonra 10 mikrolitre pipet kullanarak, hücre süspansiyonunun 10 mikrolitresini 10 mikrolitre trypan mavisi ile karıştırın ve dış hücre yüzeyinin boya ile tamamen boyanmasını sağlamak için karışımı dört kez hafifçe pipetleyin. Ardından, hemositometre sayım alanının üzerine bir kapak yerleştirin. Ardından hücre karışımını içeren pipet ucunu kapak kapağının kenarına yerleştirin ve uç içeriğini hafifçe sayım slaydına atın.Bulamacın oturması için birkaç dakika bekledikten sonra, mikroskop aşamasında hemositometreyi sabitleyin ve alt veya sol kararla çakışanlardan kaçınırken üst veya sağ kararla örtüşen hücreleri sayın. Son olarak, bu formülü kullanarak toplam hücre sayısını hesaplayın. Kültür ortamını aspire ettikten sonra, LX2 hücrelerini PBS ile üç kez yıkayın.Hücreleri daha önce gösterildiği gibi tripsin kullanarak ayırın ve santrifüj edin. Hücreleri daha önce gösterildiği gibi saydıktan sonra, 10 santimetreküp tabaktaki altıncı LX2 hücrelerine bir kez 10 kez tohumlayın ve 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. 48 saat sonra, fibroblast şartlandırılmış ortamı toplayın ve yüzen hücreleri peletmek için santrifüj.Filtre, 20 mililitrelik bir şırıngaya bağlı 0,22 mikron filtre kullanarak şartlandırılmış ortamı sterilize eder. Sonra medyayı eksi 80 santigrat derecede depolamak için iki mililitre tüpe ayırın. Küreseller için nemli koşullar sağlamak için 10 santimetreküp bir kabın dibine 10 mililitre steril PBS ekleyin.Daha sonra küre oluşturmak için asılı damlacıklarda 1.500 COS-7 memeli fibroblast hücresi ile 1.500 HuH7 HCC hücresini askıya alın. Hücre süspansiyonu da dahil olmak üzere ortamın nemli bir ortama sarkmasını sağlamak için kabın kapağını ters çevirin. Üç gün sonra, küresellerin görüntülerini çekmek için, tabağı ters bir mikroskop sahnesine koyun ve büyütmeyi beş kez ayarlayın.Ardından, ekli bilgisayardaki mikroskop yazılımını açın ve odağını her küreselin net bir görüntüsüne sahip olacak şekilde ayarlayın. Ardından, görüntüleri elde etmek ve elde edilen resimleri kaydetmek için mikroskop yazılımındaki yakalama aracını kullanın. 10 santimetreküp kabın altına 10 mililitre steril PBS ekleyin.Daha sonra asılı damlacıklardaki 3.000 Hep3B HCC hücresini küre oluşturmak için askıya alın ve damlacıkların üç gün boyunca nemli bir ortama sarkmasını sağlayan kabın kapağını ters çevirin. Daha sonra, Hep3B küresellerini asılı damlacıklardaki LX2 hücrelerinden 20 mikrolitre taze durum ortamına aktarın. Daha sonra küresellerin oluştuğu kabın kapağını ters çevirin ve kapağı hafif bir mikroskop aşamasına sabitlayın.Her bir küreseli daha önce gösterildiği gibi görünür hale getirmek için mikroskobun ince odağını ayarlayın. Mikropipetten havayı dikkatlice boşaltmak için piston düğmesine bastıktan sonra, pipet ucunu aktarılacak küreseli içeren damlacığın içine yerleştirin. Ucuyla dokunmadan küresele çok yaklaşın.Daha sonra, küreselin mikropipette ucuna iki mikrolitrelik ortamda emilmesini sağlamak için piston düğmesindeki basıncı hafifçe bırakın. Daha sonra küreseli yeni bir 10 santimetreküp kabın üzerinde asılı yeni bir damlacık içine aktarın. LX2 şartlandırılmış ortamda, transfer gününden yedinci kültür gününe kadar ters bir mikroskop kullanarak beş kat büyütmede küresellerin görüntülerini alın.Büyüyen küresellerin görüntülerini analiz etmek için, her bir küresel görüntüyü bir görüntü analizi yazılımında açın ve her bir küreseli ana hatlarıyla belirlemek için serbest seçim aracını kullanın. Ardından analiz açılır düğmesinden ölçü ayarla'yı seçin ve ardından alan ve Tamam'a basın. Ardından, her bir küreselin etrafına manuel olarak bir daire çizin ve küre daire içine alındıktan sonra, programın küresel alanı piksel cinsinden hesaplamasına izin vermek için Kontrol M tuşuna basın. Daha sonra bu formülü kullanarak küresel alanı bir birime dönüştürün.Son olarak, görüntü yakalamanın ilk gününde hacmine göre küresel hacimdeki değişimi hesaplayın. Küresel oluşum için hücre yoğunluğunun optimizasyonu sırasında, 12. Böylece, 3.000 hücre yoğunluğu sferoidi daha fazla deney için uyarlanmıştır.Birlikte kült olan tümör ve fibroblast hücre çizgilerinden kaynaklanan proliferatif etkinin uzunlamasına değerlendirilmesi, dördüncü günden itibaren heterotipik sferoidlerin homotipik sferoidlere kıyasla ideal yuvarlak benzeri bir şekilde büyüdüğünü göstermiştir. Heterotipik küreseller başlangıçta dördüncü günden yedinci güne kadar hızlı bir büyüme evresi ve ardından sekizinci günde daha yavaş bir evre gösterdi. Küresel hacim daha sonra dokuz ve 10 gün içinde azaldı, muhtemelen besinlerin tükenmesini veya hipoksik bir çekirdek ve hücre ölümünü yansıttı.Buna karşılık, homotipik küreseller beşinci güne kadar nispeten statik bir büyüme eğrisi sergilediler ve ardından altıncı günden itibaren büyüme eğrilerinde kademeli bir artış oldu. Heterotipik sferoidlerin daha yüksek büyüme hızı, tümör ve fibroblastlar arasındaki doğrudan temasın tümör sferoidlerinin boyutunu artırdığını göstermektedir. Taze medyada üç günlük homotipik Hep3B sferoidler yetiştirildiğinde, hücreler üç gün sonra mükemmel yuvarlatılmış küreseller oluşturdu ve yedinci güne kadar çoğalma devam etti.LX2 şartlandırılmış medyada sferoidler korunduğunda büyüme hızı artmış, bu da tümör sferoidlerinin fibroblast güdümlü çoğalmasını düşündürmektedir. Küresel oluşum için uygun nemli durumu korumak için steril BBS'nin bulaşıkların dibine ekli olduğundan emin olmak çok önemlidir. Ayrıca, sferoidlerin ve damlacıkların bozulmaması için kapağı ters çevirirken dikkatli olun.3D tümör sferoidleri sabitlenebilir veya dondurulabilir ve immünokimya veya immünofluoresans gibi gelecekteki uygulamalar için saklanabilir ve transkriptomik analiz için RNA ekstraksiyonu yapılabilir. Önceden etiketlenmiş hücrelere sahip heterotipik küreseller, tümör mikroçevresi içindeki hücre-hücre etkileşimleri hakkında fikir vermek için görüntülenebilir ve izlenebilir.

a-three-dimensional-spheroid-model-to-investigate-tumor-stromal

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Burada, kanser hücresi davranışının çok hücreli etkileşimlerini ve hücre dışı matrise bağlı modülasyonunu araştırmak için yararlı olan üç boyutlu ko-kültür için bir protokol sunuyoruz. Bu deneysel modelde, kanser hücreleri, insan kanseriyle ilişkili fibroblastlarla gömülü kollajen jelleri üzerinde kültürlenir.

Tümör-stromal Etkileşim için üç boyutlu Co-kültür Modeli

Çevredeki normal dokuların invazyonu, malign tümörlerin tanımlayıcı bir özelliğidir. Burada, bir dizi ileri insan kanseri modeliyle örneklenmiş doğal bir 3D biyomatrise basit, yarı otomatik bir mikro plaka istila testi sunuyoruz.

Üç boyutlu (3D) Tümör Sfero Yayılması deneyindeki

Optik koherens tomografi (OCT), üç boyutlu görüntüleme teknolojisi, izlemek ve çok hücreli tümör pulcuklarının büyüme kinetik karakterize etmek için kullanıldı. Tümör pulcuklarının yaklaşım ve içsel optik zayıflama Karşıtlık'dayalı pulcuklarının etiket içermeyen ölü dokuyu algılama sayma Voksel kullanarak hassas hacimsel miktar gösterdi.

Boyuna morfolojik ve fizyolojik izleme optik koherens tomografi kullanarak üç boyutlu tümör pulcuklarının

Bu protokolün amacı, immünofluorescence, transkripsiyon gibi farklı analiz sistemlerinde ele alınabilir bir tümör toplu benzeri ortamda, kanserle ilişkili fibroblastların (CAFs) farklılaşmasını incelemek için bir 3D in vitro modeli kurmaktır analiz ve yaşam hücresi görüntüleme.

Kanser Ilişkili fibroblastlar farklılaşma ve Invazyon In vitro etütler için daha fizyolojik bir sistem olarak bir 3D Küroid modeli

Tümör hücreleri ve stromal fibroblastların heterotipik etkileşimine dayanan üç boyutlu yeni bir küresel model oluşturulmuştur. Burada, spheroidlerin oluşumunu görselleştirmek için tümör hücreleri ve stromal fibroblastlar, hızlandırılmış görüntüleme ve konfokal mikroskopi ortak kültürünü satıyoruz. Bu üç boyutlu model tümör-stroma etkileşimleri ve test kanser terapötik çalışma için ilgili bir platform sunuyor.

Tümör-Stroma Etkileşimi ve İlaç Keşfini İncelemek İçin Yeni Bir Stromal Fibroblast-Modüle 3D Tümör Küresel Modeli

Burada glioblastoma için kullanımı kolay bir istila çıktısını tanımlıyoruz. Bu töz glioblastoma kök benzeri hücreler için uygundur. İstilanın, göçün ve çoğalmanın kolay ölçülmesi için bir Fiji makrosu da tanımlanmıştır.

Glioblastoma için 3D Spheroid Model

Bu protokol, eşlik eden fibrotik stromal bölmeli 3D biyomimetik bir model sunar. Hücresel etkileşimlerin, tümör büyümesinin ve metastazın aktif bir arabulucu olan stromal hücre dışı matrisin biyo-fiziksel özelliklerini taklit eden oranlarda fizyolojik olarak ilgili hidrojellerle hazırlanmıştır.

Ayarlanabilir Biyo-Fiziksel Özelliklere Sahip 3D Ortamda Tümör-Stroma Etkileşimlerini İncelemek İçin Karaciğer Kanseri için Biyomimetik Model

Bu protokol, Caco2 kolon adenokarsinom hücrelerinden üç boyutlu küreseller üretmek ve yetiştirmek için yeni, sağlam ve tekrarlanabilir bir kültür sistemi sunar. Sonuçlar, kemoterapiye yanıt da dahil olmak üzere kanser kök hücre biyolojisini incelemek için bu yaklaşımın uygunluğu için ilk kavram kanıtını sağlar.

Kolon Kanseri Kök Hücrelerini İncelemek İçin Üç Boyutlu Bir Küresel Model

Çok hücreli 3D tümör sferoidleri, akciğer adenokarsinom hücreleri, fibroblastlar ve monositler ile hazırlandı ve bunu kanserle ilişkili fibroblastların (CAF'lar) bu sferoidlerden izole edilmesi izledi. İzole CAF'lar, mitokondriyal transmembran potansiyelini, reaktif oksijen türlerini ve enzimatik aktiviteleri inceleyerek mitokondriyal sağlığı değerlendirmek için normal fibroblastlarla karşılaştırıldı.

3D Çok Hücreli Akciğer Tümörü Sferoidlerinden İzole Edilen Kanserle İlişkili Fibroblastlarda Mitokondriyal Sağlığın Değerlendirilmesi

Kanser metastazını incelemek için heteroselüler karışmayı yakalayan 3D kanser modellerine kritik bir ihtiyaç vardır. Çalışmamız, invazyon ve hücresel mekansal dağılımları incelemek için kullanılabilecek iskele ve iskelesiz bir ortamda heteromultisellüler stromal-epitel oluşumunu sunmaktadır.

İstilayı Yönlendirmek İçin Epitelyal Kanser Hücrelerinin İskelesiz 3D Kültürlerinde Heteromultihücreli Stromal Hücreler

Bu protokol, sağlam karaciğer dokusunda karaciğer stellat hücrelerinin morfolojisini görselleştirmek ve modellemek için kapsamlı bir görüntüleme hattı sunar. Bu yaklaşım, fare genetiği kullanılarak fibroblastların floresan etiketlenmesini, yerinde karaciğer perfüzyon tabanlı doku hazırlığını ve modifiye edilmiş iDISCO doku temizleme yöntemini birleştirerek optik şeffaflığı sağlar.

Karaciğer Fibrozisi Fare Modellerinde Hepatik Yıldız Hücre Morfolojisinin Haritalanması

Keşfedin, hepatosellüler karsinomda tümör-stromal etkileşimleri incelemek için asma damla yöntemiyle 3D sferoid modeli oluşturmayı. Bu teknik, ilaç tarama ve kanser biyolojisi araştırmaları için güçlü bir platform sunar.

Hepatosellüler Karsinomdaki Tümör-Stromal Etkileşimi Araştırmak İçin Üç Boyutlu Sferoid Modeli

Daha fazla video keşfet