Name: Eksiz katı tümör homojenatlarının Mitokondriyal fonksiyonunun analitik tayini (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: Keşfedin, taze tümör homojenatlarında mitokondriyal oksidatif fosforilasyon ve elektron transfer kapasitesini değerlendirmek için hızlı bir yöntem. Bu protokol, kanser biyolojisinde mitokondrial fonksiyonların tanısal yorumlanmasını geliştirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pennington Biyomedikal Araştırma Merkezi Karşılaştırmalı Biyoloji Çekirdeği personeline hayvan bakımı için teşekkür ederiz. Bu araştırma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüsü tarafından U54GM104940 (JPK) ve KL2TR003097 (LAG) hibeleri tarafından desteklendi. Hayvanları içeren tüm deneyler ve prosedürler Pennington Biyomedikal Araştırma Merkezi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı.

<ol><li>DeBerardinis, R. J., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+of+cancer+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Fundamentals of cancer metabolism.</a> Science Advances. 2 (5), 1600200(2016).</li>
<li>Bajzikova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactivation+of+dihydroorotate+dehydrogenase-driven+pyrimidine+biosynthesis+restores+tumor+growth+of+respiration-deficient+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Reactivation of dihydroorotate dehydrogenase-driven pyrimidine biosynthesis restores tumor growth of respiration-deficient cancer cells.</a> Cell Metabolism. 29 (2), 399-416 (2019).</li>
<li>Martínez-Reyes, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+ubiquinol+oxidation+is+necessary+for+tumour+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial ubiquinol oxidation is necessary for tumour growth.</a> Nature. 585 (7824), 288-292 (2020).</li>
<li>Picard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+structure+and+function+are+disrupted+by+standard+isolation+methods%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods.</a> PloS One. 6 (3), 18317(2011).</li>
<li>Saks, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSaks%2C+VA+%22Bioenergetics+of+the+Cell%3A+Quantitative+Aspects%22">Bioenergetics of the Cell: Quantitative Aspects</a>. Saks, V. A., et al. , Springer US. 81-100 (1998).</li>
<li>Kaambre, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+control+analysis+of+cellular+respiration+in+situ+in+intraoperational+samples+of+human+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioenergetics+and+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Metabolic control analysis of cellular respiration in situ in intraoperational samples of human breast cancer.</a> Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 44 (5), 539-558 (2012).</li>
<li>Koit, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiration+in+human+colorectal+and+breast+cancer+clinical+material+is+regulated+differently%5BTitle%5D)+AND+%22Oxidative+Medicine+and+Cellular+Longevity%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiration in human colorectal and breast cancer clinical material is regulated differently.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2017, 1372640(2017).</li>
<li>Holland, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+mitochondrial+respiration+in+the+human+placenta+over+gestation%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Changes in mitochondrial respiration in the human placenta over gestation.</a> Placenta. 57, 102-112 (2017).</li>
<li>Pesta, D., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+respirometry%3A+OXPHOS+protocols+for+human+cells+and+permeabilized+fibers+from+small+biopsies+of+human+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle.</a> Methods in Molecular Biology. 810, 25-58 (2012).</li>
<li>Makrecka-Kuka, M., Krumschnabel, G., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+respirometry+for+simultaneous+measurement+of+oxygen+and+hydrogen+peroxide+fluxes+in+permeabilized+cells%2C+tissue+homogenate+and+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">High-resolution respirometry for simultaneous measurement of oxygen and hydrogen peroxide fluxes in permeabilized cells, tissue homogenate and isolated mitochondria.</a> Biomolecules. 5 (3), 1319-1338 (2015).</li>
<li>Kondrashova, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+native+properties+of+mitochondria+in+rat+liver+homogenate%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Preservation of native properties of mitochondria in rat liver homogenate.</a> Mitochondrion. 1 (3), 249-267 (2001).</li>
<li>Pecinová, A., Drahota, Z., Nůsková, H., Pecina, P., Houštěk, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+basic+mitochondrial+functions+using+rat+tissue+homogenates%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Evaluation of basic mitochondrial functions using rat tissue homogenates.</a> Mitochondrion. 11 (5), 722-728 (2011).</li>
<li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292 (1), 125-136 (2007).</li>
<li>Hlozková, K., Starková, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+metabolic+profile+of+primary+leukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Assessment of the metabolic profile of primary leukemia cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (141), e58426(2018).</li>
<li>Zhang, J., Zhang, Q. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZhang%2C+J+%22Cancer+Metabolism%3A+Methods+and+Protocols%22">Cancer Metabolism: Methods and Protocols</a>. Haznadar, M. , Springer. New York. 353-363 (2019).</li>
<li>Wigner, P., Zielinski, K., Labieniec-Watala, M., Marczak, A., Szwed, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doxorubicin-transferrin+conjugate+alters+mitochondrial+homeostasis+and+energy+metabolism+in+human+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Doxorubicin-transferrin conjugate alters mitochondrial homeostasis and energy metabolism in human breast cancer cells.</a> Scientific Reports. 11 (1), 4544(2021).</li>
<li>Schöpf, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+phosphorylation+and+mitochondrial+function+differ+between+human+prostate+tissue+and+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Oxidative phosphorylation and mitochondrial function differ between human prostate tissue and cultured cells.</a> The FEBS Journal. 283 (11), 2181-2196 (2016).</li>
<li>Ye, F., Hoppel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+oxidative+phosphorylation+in+human+skin+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Measuring oxidative phosphorylation in human skin fibroblasts.</a> Analytical Biochemistry. 437 (1), 52-58 (2013).</li>
<li>Le Naour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EO771%2C+the+first+luminal+B+mammary+cancer+cell+line+from+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+International%22%5BJournal%5D)">EO771, the first luminal B mammary cancer cell line from C57BL/6 mice.</a> Cancer Cell International. 20, 328(2020).</li>
<li>Gnaiger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Bioenergetics+Communications%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial physiology.</a> Bioenergetics Communications. 1, 44(2020).</li>
<li>Hughey, C. C., Hittel, D. S., Johnsen, V. L., Shearer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respirometric+oxidative+phosphorylation+assessment+in+saponin-permeabilized+cardiac+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Respirometric oxidative phosphorylation assessment in saponin-permeabilized cardiac fibers.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (48), e2431(2011).</li>
<li>Dranka, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+bioenergetic+function+in+response+to+oxidative+stress+by+metabolic+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Assessing bioenergetic function in response to oxidative stress by metabolic profiling.</a> Free Radical Biology and Medicine. 51 (9), 1621-1635 (2011).</li>
<li>Munday, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+superoxide+radical%2C+hydrogen+peroxide+and+hydroxyl+radical+during+the+autoxidation+of+N%2CN%2CN%27%2CN%27-tetramethyl-p-phenylenediamine%5BTitle%5D)+AND+%22Chemico-Biological+Interactions%22%5BJournal%5D)">Generation of superoxide radical, hydrogen peroxide and hydroxyl radical during the autoxidation of N,N,N',N'-tetramethyl-p-phenylenediamine.</a> Chemico-Biological Interactions. 65 (2), 133-143 (1988).</li>
<li>Moser, M. D., Matsuzaki, S., Humphries, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+succinate-linked+respiration+and+complex+II+activity+by+hydrogen+peroxide%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Inhibition of succinate-linked respiration and complex II activity by hydrogen peroxide.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 488 (1), 69-75 (2009).</li>
<li>Veksler, V. I., Kuznetsov, A. V., Sharov, V. G., Kapelko, V. I., Saks, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+parameters+in+cardiac+tissue%3A+a+novel+method+of+assessment+by+using+saponin-skinned+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory parameters in cardiac tissue: a novel method of assessment by using saponin-skinned fibers.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 892 (2), 191-196 (1987).</li>
<li>Gnaiger, E., et al. Mitochondria in the Cold. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGnaiger%2C+E+%22Life+in+the+Cold%22">Life in the Cold</a>. Heldmaier, G., Klingenspor, M. , Springer. Berlin, Heidelberg. 431-442 (2000).</li>
<li>Doerrier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+fluorespirometry+and+OXPHOS+protocols+for+human+cells%2C+permeabilized+fibers+from+small+biopsies+of+muscle%2C+and+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">High-resolution fluorespirometry and OXPHOS protocols for human cells, permeabilized fibers from small biopsies of muscle, and isolated mitochondria.</a> Methods in Molecular Biology. 1782, 31-70 (2018).</li>
<li>Rohlenova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+disruption+of+respiratory+supercomplexes+as+a+new+strategy+to+suppress+Her2%28high%29+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Selective disruption of respiratory supercomplexes as a new strategy to suppress Her2(high) breast cancer.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 26 (2), 84-103 (2017).</li>
<li>Gnaiger, E. Mitochondrial pathways and respiratory control. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGnaiger%2C+E+%22Bioenergetics+Communications.+5th+ed%22">Bioenergetics Communications. 5th ed</a>. , (2020).</li>
<li>Barksdale, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+viability+in+mouse+and+human+postmortem+brain%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial viability in mouse and human postmortem brain.</a> FASEB Journal. 24 (9), 3590-3599 (2010).</li>
<li>Underwood, E., Redell, J. B., Zhao, J., Moore, A. N., Dash, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+assessing+tissue+respiration+in+anatomically+defined+brain+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reportys%22%5BJournal%5D)">A method for assessing tissue respiration in anatomically defined brain regions.</a> Scientific Reportys. 10 (1), 13179(2020).</li>
<li>Jorgensen, L. B., Overgaard, J., Hunter-Manseau, F., Pichaud, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dramatic+changes+in+mitochondrial+substrate+use+at+critically+high+temperatures%3A+a+comparative+study+using+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Dramatic changes in mitochondrial substrate use at critically high temperatures: a comparative study using Drosophila.</a> Journal of Experimental Biology. 224, Pt 6 (2021).</li>
<li>Salin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+measurement+of+mitochondrial+respiration+and+ATP+production+in+tissue+homogenates+and+calculation+of+effective+P%2FO+ratios%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">Simultaneous measurement of mitochondrial respiration and ATP production in tissue homogenates and calculation of effective P/O ratios.</a> Physiological Reports. 4 (20), 13007(2016).</li>
</ol>

Yazarların bu eserle ilgili herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Kanserde mitokondriyal solunumu değerlendirme yaklaşımları büyük ölçüde in vitro modeller13 , 14,15,16ile sınırlıdır. Kimyasal permeabilizasyon6, 7,17kullanılarak tümörlerde mitokondriyal solunumun ölçülmesinde bazı başarılar elde edilmiştir, ancak tümör tipleri arasında evrensel olarak uygulanabilecek ve karşılaştırılabilecek tekdüze, altın standartlı bir yaklaşım yoktur. Ayrıca, tutarlı veri analizi ve raporlama eksikliği, sınırlı veri genelleştirilebilirliğine ve tekrarlanabilirliğine sahiptir. Burada özetlenen yöntem, mitokondriyal solunum18'i mitokondriyal preparatlarda taze eklenmiş katı tümör örneklerinden ölçmek için basit, nispeten hızlı bir yaklaşım sağlar. Tümörler ortopedik olarak implante edilmiş murine Luminal B, ERα-negatif EO771 meme kanseri hücrelerinden yetiştirildi19.
Doku kullanımı ile ilgili titizlik ve özen, oksijen tüketim oranlarının doğruluğunu ve normalleşmesini büyük ölçüde artıracaktır. Örnek soğuk tutulmazsa, sürekli olarak koruma ortamına batırılmazsa veya aşırı ele alınırsa doku ve mitokondri kolayca zarar verebilir, bu da yetersiz rutin ve OKSFOS oranlarına neden olur. Ayrıca homojenize dokunun doğru ıslak ağırlığı birincil normalleştirme yöntemi olduğu için kritik öneme sahiptir. Sitrat synthase aktivitesi20gibi toplam protein veya mitokondriyal spesifik belirteçler gibi diğer normalleştirme yöntemleri düşünülebilir. Ek olarak, doku heterojenliğinin ele alınması gerekecektir, tümör bölgeleri hakkındaki kararlar bir priori yapılan deneylere dahil edilecektir. Nekrotik, fibrotik ve bağ dokusu homojenleşmeyebilir ve/veya iyi bir şekilde solunum yapamayabilir ve bu tümör bölgeleri kasıtlı olarak test edilmediği sürece kaçınılmalıdır. Özellikle, tümör tipine ve eksizyon bölgesine bağlı olarak çok yapışkan olabilir, bu da doğru tartım ve transferi daha zor hale getirir. Homojenizasyonlar için kullanılan inme sayısı, dış mitokondriyal zarlardaki hasarı azaltırken mitokondrilerin tam olarak hazırlanmasını sağlamak için optimize edilmelidir.
Daha iyi doğruluk ve tekrarlanabilirlik için homojen hazırlık, doku konsantrasyonu ve substrat, uncoupler, inhibitör konsantrasyonları için inme sayısı için optimizasyon deneyleri yapılmasınızı öneririz. Çalışmalar, farklı inme sayısını ve çalışma içindeki sitokrom c'nin eklenmesine ve maksimum mitokondriyal solunum kapasitesine yanıtla nasıl karşılık geldiklerini karşılaştırabilir 21. Daha az sitokrom c yanıtının daha iyi olduğuna dair genel bir kabul olmasına rağmen, sitokrom c ilavesi sonrası oksijen tüketimindeki artış dış mitokondriyal zarın zarar gördüğünü gösterebileceğinden, bu eşiğin her doku için ne olduğu konusunda altın standart yoktur ve dokunun fazla çalışmaması veya hazırlıksız olmaması için deneysel olarak araştırılmalıdır. Bu tümör dokusunda ~ % 30'un altındaki sitokrom c yanıtının solunum fonksiyonlarını bozmadığı bulunmuştur. Sitokrom c kullanımı, test pozitifse solunum kapasitesinin doğru ölçülmesi için kritik hale gelir. Bu durumda, ilave, tükenirse solunum oranlarının hafife almasına neden olacak endojen sitokrom c'yi yeniler.
Doku konsantrasyonu titrasyon deneyleri bir dizi uygulanabilir konsantrasyonda yapılabilir ve ideal olarak çalışma sırasında araştırılacak SUIT'lerle yapılır. Solunum kapasitesi tümör tipine ve bileşimine göre değişecektir. Bu nedenle, mitokondri veya yüksek solunum kapasitesine sahip yoğun tümörler daha düşük konsantrasyonlar gerektirecektir (0.5-5 mg/mL). Az sayıda mitokondri veya düşük solunum kapasitesine sahip tümörler daha yüksek konsantrasyonlar gerektirecektir (7-12 mg/mL). Ek olarak, uzun veya yüksek oranda tüketilen substratlara sahip SUIT'ler, odanın reoksijenasyonunu veya ADP sınırlamasını önlemek için daha az dokuya ihtiyaç duyabilir. Bazı dokular oksijen tüketiminde doğrusal bir ilişkiye sahip olurken, diğerleri belirli konsantrasyon aralıklarında gelişmiş hassasiyet ve maksimum oksidasyon gösterecektir. Seçilen doku konsantrasyonu, reoksijenasyon olaylarının sayısını sınırlarken oksijen akısını en üst düzeye çıkarmak için optimize edilmelidir. Ek olarak, konsantrasyon aralığının daha yüksek ucunun ihtiyacını abartmak veya hedeflemek genellikle daha iyidir. Solunum akılarının niceliği için gerekli olan inhibitörler, daha büyük mitokondri havuzlarında kullanıldığında daha hassastır.
Bir diğer önemli husus, protokoller sırasında kullanılan ilaçların konsantrasyonudur. Homojen konsantrasyondaki değişiklikler, maksimum yanıt için gerekli olan substratların, uncoupler'ların ve inhibitörlerin konsantrasyonlarını değiştirebilir. Bu nedenle, en uygun konsantrasyon aralığı seçildikten sonra, SUIT protokolü için gerekli dozları test eden bir deney yapılmalıdır. Adenilit konsantrasyonlarının solunum akılarıyla sınırlı olmadığından emin olmak için ek ADP eklenebilir. FCCP veya CCCP gibi kimyasal uncouplers daha yüksek konsantrasyonlarda solunumu inhibe edecektir22. Bu nedenle, elde edilen maksimum oranı ortaya çıkarmak için küçük miktarlarda titrat yapmak önemlidir. Rotenon ve antimycin A gibi inhibitörler, ilk enjeksiyonda doyurulduğu zaman en iyi şekilde kullanılır. Ön deneylerde optimal konsantrasyonlar belirlenirken, inhibitörlere yanıt olarak tedaviye bağlı farklılıklar gözlemledik ve sonuç oranları nicelemenin temeli olarak maksimum inhibisyon göstermek için genellikle bir ek inhibitör enjeksiyonu ekledik. TMPD otooksidasyon23'etabi olduğu için Doğru analitik azaltma için Askorbat/TPMD'nin kimyasal inhibisyonu gereklidir. Yerleşik bir CIV inhibitörü olan sodyum azit ilavesi ile askorbat/TMPD/sitokrom c'nin otomatik oksidasyonunu kontrol ettik. Km çalışmaları için, tek başına süksinit varlığında rotenon eklenmesi, düşük konsantrasyonlarda süksinit dehidrogenaz aktivitesini inhibe edebilecek oksaloasetat birikimini önler24. ADP'nin hacmi ve konsantrasyonu, mitokondrilerin hakim substrat kombinasyonuna duyarlılığına oldukça bağlıdır. ADP'ye karşı oldukça hassas olan mitokondriyal preparatlar daha düşük başlangıç konsantrasyonları gerektirecektir. Ayrıca, onaylanmış kimyasallar ve pH'a dikkat ederek uygun ilaç hazırlama, varsa ışığa duyarlılık ve depolama sıcaklığı başarılı deneyler için gereklidir.
Cihaz kurulumu ve rutin bakım, bu deneylerin başarısı için kritik öneme sahiptir. Odaların yeterli ve uygun şekilde temizlenmesi, biyolojik, protein, inhibitör veya uncoupler kontaminasyonunun tekrarlanabilirliği ve önlenmesi için gereklidir. Clark tipi elektrotlar ve O2k sistemleri, sarf malzemelerine dayanan plaka bazlı sistemler için önemli bir maliyet avantajı olan cam reaksiyon odalarını kullanır. Bununla birlikte, cam odalar güçlü bir şekilde temizlenmelidir ve sonraki çalışmalarda inhibitör kontaminasyon kaynağı olabilir. Yıkama işlemi sırasında mitokondri bakımından zengin örneklerle inkübasyon (örneğin izole kalp veya karaciğer mitokondrileri) deneysel kontaminasyon riskini azaltabilir ve seyreltme ve alkol bazlı yıkama prosedürlerine ek olarak önerilir. Ardışık çalışmalar yürütülürse, etanol ve mitokondri ile temizlik inhibitör kontaminasyon olasılığını en aza indirir. Oksijen sensörünün kalibrasyonu, her deneyden önce oksijenin hakim kısmi basıncına göre doğru solunum ölçümleri elde etmek için önerilir. Birden fazla kalibrasyon mümkün değilse, yıkama işleminden sonra oksijen konsantrasyonu sabit ve tutarlı kalırsa günde bir kalibrasyon yeterli olabilir.
Yukarıda özetlenen prosedürler, daha önce tasarlanmış ve optimize edilmiş koruma çözeltisi ve solunum ortamı 25,26,27kullanarak tümör eksizyonundan sonraki 4 saat içinde tümör dokusundaki oksijen tüketimini ölçmek için OroborosO2kcihazından yararlanır. Bu iletişim kuralındaki birden çok parametre sonraki uygulamalar için değiştirilebilir. Cihaz kurulumu ve kalibrasyonu, doku hazırlama için kullanılan homojenizatörler ve optimal homojenat ve oda oksijen konsantrasyonu, oksijen izleme potansiyeline sahip diğer aletlerde kullanılmak üzere uyarlanabilir. Örneğin, odalar homojenlik eklerken biraz fazla dolduruldu ve böylece oda tamamen kapatıldığında, oda kılcal damarları dolu kalır. Bu, odada biraz oksijen tüketecektir, ancak numune konsantrasyonunun optimizasyonu ile, hangi oksijen seviyesinin başlayacağını belirlemede bu tüketimi hesaba katabiliriz. Alternatif olarak, numunenin oda kapanmadan önce ortam oksijeninde aşındırmasına izin verilebilir, ancak bu genellikle deney başlamadan önceki süreyi artıracak ve substratların eklenmesini geciktirecektir. Bu protokolde kullanılan homojenizatörlere yaygın olarak erişilebilir olsa da, doku öğütücü veya otomatik homojenizatör28gibi diğer ticari homojenizasyon teknikleri kullanılabilir.
Ek olarak, doku hazırlama ve enstrüman prosedürleri, çeşitli kavrama ve yol kontrol durumları ile solunum kontrolünü incelemek için bir dizi farklı SUV ile kullanılabilir29. Bu SUIT protokolleri fonksiyonel kapasiteyi ölçmek için geliştirilmiştir ve bu nedenle potansiyel endojen substratların katkısının kapasite ölçümü üzerinde hiçbir etkisi yoktur. Antimisin A-rotenon veya sodyum azide duyarsız oranlarının çıkarılması yoluyla mitokondriyal olmayan oksijen tüketimini ve/veya homojenatın artık tüketimini analitik olarak hesaba katıyoruz. Mitokondri, doku tipine ve sağlamlığına bağlı olarak biops veya benzer şekilde inşa edilmiş koruma çözümlerinde uzun süre (>24 saat) canlı kalabilir30,31. Belirli substratların OXPHOS'unun farklı sınırlamaları olabileceğinden, zamansal depolama sınırlarını belirlemek için çalışmalar önceden yapılabilir. Deney doku eksizyon/biyopsiden sonraki birkaç saat içinde yapılamıyorsa bu esastır. 37°C, çoğu memeli sisteminde solunum fonksiyonlarının değerlendirilmesi için en uygun ve fizyolojik bir sıcaklıktır. Bununla birlikte, test sıcaklığı değerlendirme32'yemüdahale ediyor gibi görünüyorsa, yeterli yanıt hızını sağlamak için geniş bir sıcaklık aralığında (25-40 °C) karşılaştırmalı çalışmalar yapılabilir. Enstrümantal kısıtlamalar bu tür çalışmaların yürütülmesi yeteneğini sınırlayabilir.
Yukarıda açıklanan yöntemin başlıca sınırlamaları şunlardır: 1) Mekanik homojenizasyon yoluyla mitokondrilere zarar verme potansiyeli, 2) ATP'nin veya diğer ilgi değişkenlerinin eşzamanlı olarak belirlenmesini engelleyebilecek homojen preparatlarda ATPases veya diğer hücresel altı biyokimyasalların varlığı ve ek düzeltme yöntemleri veya inhibitör kullanımı gerektirebilir33 ve 3) örnek başına birçok numunenin ve/veya birden fazla SUIT'nin değerlendirilmesi zaman alıcıdır, çünkü bir cihaz aynı anda iki deneye ev sahipliği yapabilir ve ardışık deneyler arasında temizlik ve kurulum gerektirir. Optimizasyon deneyleri ve numunelerin tutarlı bir şekilde hazırlanması, tutarsız verilere katkıda bulunacak önemli mitokondriyal hasarı en aza indirebilir.
Yöntemin mevcut/alternatif yöntemlere göre önemi, başlangıç malzemesi miktarı, mitokondri izole etme zorluğu veya permeabilizasyon dokusunda teknik zorluk ile karşılaştırıldığında gelişmiş fizibilitedir. Homojenatların hazırlanması daha hızlıdır, oksijen neredeyse sınırlayıcı değildir ve permeabilize dokuya kıyasla personel arasındaki değişkenliğe daha az duyarlıdır. Daha da önemlisi, neredeyse tüm numune tipleri dokular arasında karşılaştırmalı analize izin veren homojen preparat için uygundur. Yüksek çözünürlüklü respirometri, mitokondriyal OKSFOS ve ET'nin altın standart ölçümüdür. Bu yöntemin klinik öncesi ve klinik kanser araştırmalarında uygulanması, mevcut in vitro araştırmaları ex vivo çalışmalara genişletme kapasitesine sahiptir. Ayrıca, klinik ve tanısal ortamlarda potansiyel uygulamalar sunar.

Tüm hücreler, moleküler enerji para birimi olan adenozin trifosfat (ATP) üretme ve tüketme ihtiyaçları ile yakından bağlantılıdır. Hücresel mutasyonlar tümör oluşumuna yol açtıkça, mitokondriler genellikle kanserli olmayan dokudan fenotipik olarak ayırt edilebilen enerji üretiminin çeşitlendirilmesi yoluyla sağkalım sağlar1,2,3. Bu nedenle, tümör tipinin sınıflandırılmasını, kanser başlangıç, ilerleme ve tedavi yanıtını kolaylaştırmak için mitokondriyal solunum fonksiyonunun hızlı ve derin profillemesine kritik bir ihtiyaç vardır.
OXPHOS için birincil substratlar hücre geçirgen olmadığı için ekscislenmiş doku örneklerinin solunum fonksiyonları bozulmadan değerlendirilemez. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için mitokondri izolasyon, kimyasal permeabilizasyon veya mekanik homojenizasyon ile hazırlanabilir. Mitokondriyal izolasyon uzun zamandır solunum fonksiyonlarının değerlendirilmesi için altın bir standart olarak kabul edilir. Bununla birlikte, büyük miktarda doku gerektirir, zaman alıcıdır ve mitokondri4'ünbelirli fraksiyonları için olası seçim önyargısı ile düşük verimlidir. Permeabilizasyon, doku bölümlerinin veya lif demetlerinin plazma zarını seçici olarak bozan hafif bir deterjana mekanik olarak ayrılması ve maruz kalmasından oluşur5. Permeabilizasyon, iskelet ve kalp kası gibi çizgili dokularda sıklıkla kullanılır, çünkü bireysel lif demetleri birbirinden alay edilebilir. İzolasyon ile karşılaştırıldığında, permeabilizasyon kendi yerel hücresel ortamlarında ve fiziksel formlarında daha fazla mitokondri verir5. Permeabilizasyon tümör6,7 ve plasnta8gibi diğer dokularda başarıyla uygulanmıştır; bununla birlikte, difüzyon sınırlamalarının üstesinden gelmek için diseksiyon ve oksijen gereksinimlerinin tutarlılığı nedeniyle permeabilize lif preparatlarının tekrarlanabilirliği zor olabilir9. Ayrıca, permeabilize lifler yoğun hücresel ve yüksek fibrotik olan bazı tümör tiplerinde uygun olmayabilir. Doku homojenatları plazma zarının mekanik bozulması yoluyla üretilir ve mitokondriyal verim ve bütünlük açısından permeabilize liflere benzer10. Doku homojenatları ayrıca oksijen difüzyonunun sınırlamalarını en aza indirir ve mekanik kuvvet11 , 12optimizasyonu yoluyla doku tipleri arasında kolayca kullanılabilir.
Burada, taze eksize katı tümör homojenatlarında oksidatif fosforilasyon (OKSPHOS) ve elektron transferi (ET) kapasitesini ölçmek için basit ve hızlı bir yöntem özetliyoruz. Protokol, enstrümantal kurulum ve kalibrasyon hakkında önceden bilgi gerektiren ancak herhangi bir Clark tipi elektrot, Denizatı analizörü veya plaka okuyucu kullanılarak benzer şekilde uyarlanabilebilen Oxygraph-2k (O2k) yüksek çözünürlüklü respirometre kullanılarak taze dokuyu değerlendirmek için en uygun şekilde tasarlanmıştır. Protokol, türler ve tümör tipleri arasında tekrarlanabilir ve mitokondriyal ET yollarının çeşitliliğini değerlendirmek için uyarlanabilir.

<table><tbody><tr><td>2- (N-Morfolino) etansülfonik asit hidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>Adenozin 5 asal; -difosfat sodyum tuzu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2754</td><td></td></tr><tr><td>Adenozin 5'-trifosfat disodyum tuzu hidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterisin B</td><td>Gibco</td><td>15290018</td><td></td></tr><tr><td>Antimisin A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>Askorbat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini, fraksiyon V, ısı şoku, yağ asidi içermez</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3117057001</td><td>Roche</td></tr><tr><td>BD 50 mL Luer-Lok Şırınga</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-689-8</td><td></td></tr><tr><td>BD&nbsp; Vacutainer Genel Kullanım Şırınga İğneleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-021-020</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum karbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4830</td><td></td></tr><tr><td>Karbonil siyanür 4- (triflorometoksi) fenilhidrazon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>At kalbinden sitokrom c</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2506</td><td></td></tr><tr><td>Datlab 7.4 yazılımı</td><td>Oroboros Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsülfoksit</td><td>Amresco</td><td>N182</td><td></td></tr><tr><td>Ditiyotreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>D-Sükroz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Dumont # 5 Forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11251-30</td><td>Dumoxel, otoklavlanabilir</td></tr><tr><td>Dumont # 7 Forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11271-30</td><td>Dumoxel, otoklavlanabilir</td></tr><tr><td>Dijital Kaliperler 150 mm/6 in</td><td>World Precision Instruments</td><td>501601</td><td></td></tr><tr><td>EO771 hücreleri</td><td>CH3 BioSystems</td><td>SKU:&nbsp; 94APV1-flakon-prem</td><td>Patojen Test</td></tr><tr><td>Edildi Etilen glikol-bis (2-aminoetileter) -N, N, N&prime;, N&prime; -tetraasetik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Dişi C57BL/6J fareler</td><td>&nbsp; Jackson Laboratuvar</td><td>Stoku #000664</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>İmidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56750</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>L-(&eksi;)-Malik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1626</td><td></td></tr><tr><td>Laktobiyonik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2398</td><td></td></tr><tr><td>Malat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6413</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matris</td><td>Corning</td><td>354248</td><td></td></tr><tr><td>MgCl ve orta nokta; 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Mikroşırıngalar</td><td>Hamilton</td><td>87919, 80383, 80521, 80665, 80765, 80865, 87943</td><td></td></tr><tr><td>N, N, N & prime;, N & prime;-Tetrametil-p-fenilendiamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7394</td><td></td></tr><tr><td>Oksigraf-2k</td><td>Oroboros Aletleri</td><td>10023-03</td><td></td></tr><tr><td>Oksigraf-2k FluoRespirometre</td><td>Oroboros Aletler</td><td>10003-01</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Fosfokreatin disodyum tuzu hidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7936</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum hidroksit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1767</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum fosfat monobazik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>21875034</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum azid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum piruvat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>Süksinat (disodyum)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>W327700</td><td></td></tr><tr><td>Taurin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Filtre Kağıdı, sınıf 5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1005-090</td><td></td></tr><tr><td>Wheaton Tenbroeck Doku Öğütücü, 7 mL</td><td>Duran Wheaton Kimble</td><td>357424</td><td></td></tr><tr><td>Düz Uçlu Mikro Diseksiyon Makası</td><td>Roboz</td><td>RS-5914SC</td><td></td></tr><tr><td>Güvenliksiz Neşter No. 11</td><td>McKesson</td><td>1029065</td><td></td></tr><tr><td>BD Hassas Kayar İğne 27 G x 1/2</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td></td><td></td>305109</tr><tr><td>BD Hassas Kayma İğnesi 18 G x 1</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>BD 1 mL Kayma Uçlu Şırınga</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex Yeniden Kullanılabilir Petri Kabı, 60 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>316060</td><td></td></tr><tr><td>Kemirgen Çok Yüksek Yağ Diyeti, yağdan %60 kcal, proteinden %20 kcal ve karbonhidrattan %20 kcal</td><td>Araştırma Diyeti</td><td>D12492</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex Saat Camı, 100 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S34819</td><td></td></tr></tbody></table>

eksiz katı tümör homojenatlarının mitokondriyal fonksiyonunun analitik tayini

Analytical Determination of Mitochondrial Function of Excised Solid Tumor Homogenates

Mitokondri, enerji üretimi, reaktif oksijen türleri düzenlemesi ve makromolekül sentezi yoluyla kanserin başlaması ve ilerlemesi için gereklidir. Mitokondrilerin tümör ortamına genetik ve fonksiyonel adaptasyonları proliferatif ve metastatik potansiyeli yönlendirmektedir. DNA ve RNA diziliminin ortaya çıkması, tümöregenez genetik arabulucularının değerlendirilmesine yönelik kritik engelleri ortadan kaldırdı. Bununla birlikte, bugüne kadar, tümör mitokondriyal fonksiyonunu değerlendirmek için metodolojik yaklaşımlar zor olmaya devam etmektedir ve fizibiliteyi sınırlayan teknik yeterlilik gerektirmektedir, sonuçta hem deneysel hem de klinik ortamlarda tanısal ve prognostik değeri azaltmaktadır. Burada, yüksek çözünürlüklü respirometri kullanarak yeni eksilen katı tümör homojenatlarında oksidatif fosforilasyon (OKSFOS) ve elektron transferi (ET) kapasitesini ölçmek için basit ve hızlı bir yöntem özetliyoruz. Protokol, türler ve tümör tipleri arasında tekrarlanabilir ve mitokondriyal ET yollarının çeşitliliğini değerlendirmek için uyarlanabilir. Bu protokolü kullanarak, armatürel B meme kanseri taşıyan farelerin kusurlu nikotinamid adenin dinükleotid bağlantılı solunum ve OXPHOS aracılığıyla adenozin trifosfat üretmek için süksinite güvendiğini gösteriyoruz.

İlk çalışmalar, EO771 tümörlerinin düşük oksidatif olduğunu ve bu nedenle yeterli O2 akı değerlendirmesi için yüksek homojen konsantrasyonlara ihtiyaç olduğunu ortaya koydu. Çalışma için optimal doku homojenatı konsantrasyon aralığını belirlemek için optimizasyon deneyleri yapıldı. Tümör homojenatları başlangıçta 40 mg/mL'de hazırlandı ve daha sonra doğrusal olarak seyreltildi. Doku kütlesine normalleştirilen O2 akı konsantrasyonları arasında tutarlıydı (Şekil 1A-D). 40 mg/mL'nin hızlı oksijen tükenmesi ile sonuçlendiği ve deney için uygun olmadığı gözlenmiştir(Şekil 1A). Oksijen tüketimi 30 mg/mL ve 20 mg/mL ile önemli ölçüde yavaşladı, ancak substratların veya ADP'nin yokluğunda kısa sürede hızla azaldı (Şekil 1B,C). 10 mg/mL konsantrasyonu, daha uzun, 90 dakikalık SUIT protokolünü destekleyecek optimum oksijen tüketim oranı (Şekil 1D) ile sonuçlandı.
NADH ve succinate bağlantılı OXPHOS ve ET'nin yanı sıra CIV aktivitesini değerlendirmek için bir SUIT protokolü kullanılmıştır (Şekil 2A). NADH yoluyla sızıntıyı (L) yönlendirmek için ADP yokluğunda doku homojenatına piruvat ve malat eklendi. Doygunluk ADP daha sonra maksimum NADH bağlantılı OKSFO (P) tahrikine ve ardından glutamat eklenmesine eklendi. Sitokrom c daha sonra dış zar bütünlüğünü sağlamak için eklendi; solunum oranındaki artış tüm örneklerde 'nin altındaydı (Şekil 2B). NADH bağlantılı substratlara verilen çok düşük yanıt göz önüne alındığında, sitokrom c salınımı da süksinit ve rotenon varlığında değerlendirildi ve minimal sitokrom c stimülasyonu gözlendi (Şekil 2B). İlginçtir ki, NADH bağlantılı OKSFOS EO771 tümörlerinde ihmal edilebilirdi (Şekil 2C). Daha sonra süksinit dehidrogenaz yoluyla elektron akışını teşvik etmek için piruvat, malat ve glutamat varlığında süksit eklendi. FCCP daha sonra maksimal elektron akışını (E) sağlamak için titratlandı, bu da EO771 tümörlerinde oksidasyon yerine fosforilasyonun solunumla sınırlandığını ortaya koydu (Şekil 2C). Rotenon ve antimisidan A daha sonra sırasıyla karmaşık I ve kompleks III'ü inhibe etmek için titratlandı. Askorbat ve TMPD daha sonra sodyum azit tarafından inhibe edilen CIV aracılığıyla maksimum elektron akışını sağlamak için eklendi. Tablo 1, Şekil2C'deçizilen solunum parametrelerini nicel olarak kalibre etmek için ham verilerin analitik azaltma denklemlerini göstermektedir ( Tablo 2). Genel olarak, tümör homojen solunum profilleri (Şekil 2C) implante edilmemiş digitonin permeabilize EO771 hücrelerininkine benzer (Şekil 2D) tümördeki N ve S bağlantılı substratlar tarafından desteklenen azalmış maksimal elektron transferi hariç.
NADH bağlantılı solunum ihmal edilebilir olduğundan, süksinit solunum kinetiği, maksimum hıza (VMAX)ulaşılana kadar alt doygunluk ADP'nin adım adım titrasyonları ile daha da değerlendirildi (Şekil 3A,3B). Succinate + rotenon varlığında ADP'nin yarı maksimal konsantrasyonu (KM)37,5 μM, VMAX ise ~10,5 pmol/s/mg idi (Şekil 3C). Bu nedenle, nispeten zayıf oksidasyon oranlarına rağmen, EO771 tümörleri ADP'ye karşı oldukça hassastı ve nispeten düşük ADP konsantrasyonlarında SÜREKLI ATP senteziydi.
Çıkarma için ham verilerin uygun bölgelerini seçmek, deneylerin tekrarlanabilirliği ve doğru niceleme için kritik öneme sahiptir. Sitokrom ciçin, enjeksiyondan hemen önce sabit durumda bir işaretin seçilmesi gerekir(Şekil 4A, işaret 1). Genellikle O2 akısının sabit olmadığı bir süre (yaklaşık 5-10 dk) takip edilebilen bir ilk enjeksiyon yapıtı vardır. Sitokrom c verimliliğinin değerlendirilmesi, O2 akı stabilize edildikten sonra ek bir seçim yapılarak yapılır(Şekil 4A, işaret 2). Substratların, ADP'nin veya çoğu inhibitörün eklenmesinden sonraki seçimler de enjeksiyon yapıtından sonra ve O2 akı stabilize edildikten sonra yapılır (Şekil 4B). Maksimum ayrılmamış solunumu belirlemek için kullanılan seçim, fccp titrasyon sırasında elde edilen en yüksek artışta yapılır, bu genellikle yapılan son enjeksiyon değildir (Şekil 4C). TMPD seçimi hem askorbat hem de TMPD eklendikten sonra ve solunumda en yüksek artışta yapılır(Şekil 4D, işaret 1). Bu zirveden hemen sonra, respirasyonunu hızla azaltan ancak aynı zamanda inhibe edilen solunum oranından daha düşük bir enjeksiyon yapıtına sahip olan inhibe edici sodyum azit eklenir (Şekil 4D). inhibitör işareti enjeksiyon yapıtından hemen sonra yapılır(Şekil 4D, işaret 2). O2 akı genellikle stabilize olmaz ve azalmaya devam etmez.
Tablo 1: Solunum çezasyonu ve analitik türetme. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/TABLE%201.docx" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Tablo 2: Luminal B meme tümörü homojenatlarının örnek ve solunum özellikleri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/TABLE%202.docx" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62875/62875fig01.jpg"> Şekil 1: Tümör homojenaz konsantrasyonunun optimizasyonu. (A)40 mg/mL, (B) 30 mg/mL, (C)20 mg/mL ve (D) 10 mg/mL'de hazırlanan meme tümörü homojenatlarında O 2 Akı (kırmızı) ve O 2 Konsantrasyonu (mavi). Doku homojen solunumu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/62875fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62875/62875fig02.jpg"> Şekil 2: Yeni eksilen tümör homojenatlarında OKSFOS ve ET kapasitesinin yüksek çözünürlüklü respirometri ile değerlendirilmesi. (A)Bir substrat, inhibitör, uncoupler protokolü boyunca oksijen tüketiminin (kırmızı) ve konsantrasyonların (mavi) temsili arsası. PM: Pyruvate + Malat, D: ADP, G: Glutamat, c: Sitokrom c, S: S: Succinate, F: FCCP, Rot: Rotenone, Ama: Antimycin A, Asc/TMPD: Askorbat/Tetrametil-p-fenilenediamin. (B) Sitokrom cilavesi üzerine O2 akısında yüzde artış . (C-D) ADP, FCCP ve askorbat/TMPD'nin(C)EO771 türevli tümör homojenatları ve(D)implante edilmemiş EO771 digitonin permeabilize hücrelerde malat, piruvat, glutamat ve süksinit ile desteklenen solunum. Thom: Doku homojen solunumu; PM: Pyruvate + Malat; PMG: Pyruvate + Malat + Glutamat; PMGS: Pyruvate + Malat + Glutamat + Succinate; CIV: Kompleks IV; -L: Sızıntı durumu; -P: Oksidatif fosforilasyon durumu, -E: Elektron transfer durumu; N bağlantılı: Tanımlanmış NADH üreten substrat kombinasyonları tarafından desteklenen O2 akı; NS bağlantılı: Tanımlanan NADH-generate substrat kombinasyonlarının ve süksinitlerinin yakınsaması ile desteklenen O2 akı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/62875fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62875/62875fig03.jpg"> Şekil 3: EO771 meme tümörlerinde yüksek ADP (adenozin 5′-difosfat) hassasiyeti saptıldı. (A) S bağlantılı bir ADP titrasyon protokolü boyunca oksijen tüketiminin (kırmızı) ve konsantrasyonların (mavi) temsili grafiği. Thom: Doku homojen solunumu; S/Rot: Succinate/Rotenone; D: ADP. (B) Rotenon varlığında süksinit ile desteklenen solunum ve artan ADP konsantrasyonları (0 μM ADP = S/ Rot-L). (C) Süksinit + rotenon varlığında ADP'nin maksimum oranı (VMAX)ve yarı maksimal konsantrasyonu (KM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/62875fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62875/62875fig04.jpg"> Şekil 4: Veri ayıklama için ham O2 akılarının işaret seçimini gösteren temsili izleme. (A) Sitokrom c seçimi: Sitokrom c enjeksiyonundan önce seçim numarası 1 ve O 2 akı stabilize olduğunda enjeksiyondan sonra seçim numarası2. c Sitokrom c. (B) Substrat, ADP ve inhibitör seçimi: O 2 akısının stabilize olduğu enjeksiyondan sonra1 numaralı seçim (bu temsili arsada süksinit). S: Succinate. (C) Uncoupler seçimi: uncoupler titrasyon sırasında solunumda en yüksek artışta 1 numaralı seçim. Bu temsili FCCP titrasyon grafiğinde, üçüncü enjeksiyon solunumu biraz azaltır ve bu nedenle seçim için kullanılmaz. F: ACCP. (D) TMPD seçimi: askorbat ve TMPD enjeksiyonlarından sonra solunumun en yüksek artışında seçim numarası 1. Sodyum azit seçimi: solunum başlangıçta azaldığında akut enjeksiyon yapıtından sonra seçim numarası 2. As/Tm: Ascorbate/TMPD; Azd: Azide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/62875fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Taze tümör homojenatlarında mitokondriyal oksidatif fosforilasyon ve elektron transfer kapasitesini değerlendirmek için pratik bir protokol ve analitik yaklaşım geliştirdik. Bu protokol, kanser başlangıç, ilerleme ve tedavi yanıtına katkıda bulunan çeşitli mitokondriyal işlevleri incelemek için kolayca uyarlanabilir.

Eksiz katı tümör homojenatlarının Mitokondriyal fonksiyonunun analitik tayini

Mitochondria are essential to the onset and progression of cancer through energy production, reactive oxygen species regulation, and macromolecule ...

Bu protokolde tümör mitokondriyal fonksiyonunu ölçmek için basit ve hızlı bir yöntem açıklanmaktadır. Protokol klinik çeviri onkolojisi için yaygın olarak geçerlidir ve mitokondrilerin kanserin başlangıcında ve ilerlemesinde rolünün tanısal ve mekanistik yorumunu artırmaya yardımcı olacaktır. Bu tekniğin temel avantajı, difüzyon sınırlamalarını azaltırken hazırlığı basitleştirmek ve mitokondri verimini en üst düzeye çıkarmak için doku homojenizasyonunun uygulanmasıdır.Bu teknik, yeni biyopsilenmiş veya ekscised tümör dokusu kullanılarak tümör mitokondriyal fonksiyonunun nicel bir değerlendirmesi ile klinik ve tanısal ortamlarda potansiyel uygulamalar sunmaktadır. Islak buzun üzerine sıkıca oturan bir cam pestle içine bir mililitre mitokondriyal solunum ortamı veya MiR05 içeren bir cam homojenizatör yerleştirerek başlayın. Dokuyu bir mililitre biyopsi koruma çözeltisine veya BIOPS'a buz gibi bir Petri kabına yerleştirin.Tümörü her biri yaklaşık 5 ila 10 miligramlık küçük parçalar halinde kesin ve kalan tümör parçalarını buzda tutulan 10 mililitre BIOPS'a geri yerleştirin. Doku bölümlerini bir filtre kağıdına dikkatlice şişirdikten sonra, küçük bir plastik katranlı tartı teknesine yerleştirin ve ilk ıslak ağırlığı kaydedin. Kullanılmayan parçaları, sürekli koruma için BIOPS'un 10 mililitrelik konik tüpüne geri yerleştirin.Doku bölümlerini MiR05 içeren buz gibi bir homojenizatöre batırın ve kalan ağırlığı tartım teknesinde kaydedin. 0,09 ila 0,16 milimetre boşluk aralığına sahip bir cam pestle kullanarak, beş ila yedi aşağı ve yukarı vuruşları tamamlayarak tümör dokusunu hafifçe bozun. Her vuruş için, pestle'i aşağı iterken üç kez saat yönünde / saat yönünün tersine hareketle döndürün ve pestleyi geri çekerken üç kez daha döndürün.Dokunun vuruşlar arasında homojenizatörnün dibine yerleşmesine izin verin, ancak köpürmeyi önlemek için pestleyi sıvı hacminin tam üstüne getirmekten kaçının. Homojenatı 15 mililitrelik konik bir tüpe dökün ve buza yerleştirin. Pipet bir ila üç mililitre taze MiR05 pestle üzerinde ve homojenizatör içine kalan doku homojenatı yıkamak için.MiR05 yıkamayı homojenatı içeren konik tüpe dökün. Homojenatın tam aktarımını sağlamak için bu adımı iki ila üç kez tekrarlayın. Doku homojen konsantrasyonu doğru bir şekilde hesaplamak için, homojenizatörü ve homojenatı, bağ dokusunu içeren homojenize olmayan malzeme için dikkatlice inceleyin.Homojenizatörle ulaşılamayan homojenizatörden homojenizatörden çıkarmak için, homojenizatöre MiR05 ekledikten sonra, doku da dahil olmak üzere hacmi bir pipetle aspire edin ve içeriği bir Petri kabına taşıyın. Konik tüpün dibindeki büyük parçalara ayrılmış homojenize olmayan malzemeyi bir pipetle aspire ederek homojenden uzaklaştırın ve konik tüpün kapağına yerleştirin. Dokuyu Petri kabından veya konik tüp kapağından cımbızla çıkarın ve filtre kağıdına damlatın.Konik tüp kapağından kalan homojenatı konik tüpe geri ekleyin. Tüpü kaplayın, sonra karıştırmak için ters çevirin. Homojenizatörleri yeniden dinleyin ve homojenize olmayan herhangi bir ek malzeme için homojenize edin ve gerekirse homojenize olmayan malzemeyi çıkarmak için adımları tekrarlayın.Homojenizatörden elde edilen homojenize olmayan malzemenin kütlesini tartın ve kaydedin. Aktarılan herhangi bir brüt bozulmamış doku için homojen preparatı inceleyin ve homojenize olmayan parçaları çıkarın ve gerektiği gibi tartın. Son numune ağırlığını hesaplamak için tartım teknesinden, homojenizatörden kurtarılan doku ağırlığını çıkarın ve ilk ıslak ağırlıktan homojenatlayın.Son numune ağırlığını kullanarak, homojenatı istenen konsantrasyona getirmek için ek MiR05 ekleyin. Homojenat tartıldıktan ve hazırlandıktan sonra, mümkün olan en kısa sürede teste geçin. Numuneyi cihaza aktarılana kadar ıslak buzda saklayın.Cihaz kalibre edildikten ve numune hazırlandıktan sonra, durdurucuları büküm hareketiyle çıkarın ve MiR05'i haznenin içinde maruz kalan zardan kaçınarak odalardan epire edin. Homojenatı iyice karıştırın ve odaya 2,25 mililitre homojen ekleyin. Birden fazla odaya bir homojenat eklendiğini varsayalım, eşit doku dağılımını sağlamak için homojenatı karıştırırken her odaya bir seferde bir mililitre pipet.Olayı adlandırmak ve zaman damgalamak için F4'e tıklayın ve ardından Tamam'a tıklayın. 50 mililitrelik bir şırıngayı, 18 kalibrelik kör bir iğne kullanarak bir regülatör ve gaz tüpü ile bir oksijen tankından oksijenle doldurun. Oksijeni doğrudan odalara enjekte ederek yaklaşık 500 mikromoler oksijene hiperoksijen hale getirin.Durdurucuları gevşek bir şekilde yerleştirin ve oksijen yaklaşık 480 mikromolar olana kadar kapanmayı bekleyin. Büküm hareketiyle, odayı yavaşça kapatın ve solunumun yaklaşık 15 ila 20 dakika boyunca dengede olmasını bekleyin. Gerekirse stoperin merkezi kılcal damarını MiR05 ile doldurun.Her oda için olayları gerçek zamanlı olarak adlandırmak ve zaman damgalamak için tamamen kapalı odalara substratlar, ayırıcılar ve inhibitörler enjekte etmek için özel mikrosyringes kullanın. Oksijen konsantrasyonu ve oksijen eğimi negatif ölçeklerini gerektiği gibi ayarlamak için F6'yı seçin. Her enjeksiyondan sonra şırınnayı suda çözünür bileşikler için üç kez ve etanol çözünmüş bileşikler için% 70 etanol yıkayın.Beş mikrolitre 0.8-molar malat ekleyin ve hemen bir sonraki enjeksiyona geçin. Enjeksiyon şırıncığını suda üç kez yıkayın. Hemen beş mikrolitre 1-molar piruvat ekleyin ve solunumun stabilize olmasını bekleyin.Şırıngayı yıkadıktan sonra, 0,5 molar ADP'lik 10 mikrolitre ekleyin ve ADP yanıtının stabilize olmasını bekleyin. Şırıngayı yıkayın ve beş mikrolitre 2-molar glutamat ekleyin ve solunumun stabilize olmasını bekleyin. Şırıngayı yıkayın, ardından beş mikrolitre 4 milimoler sitokrom-C ekleyin ve solunumun stabilize olmasını bekleyin.Şırıngayı yıkadıktan sonra, 20 mikrolitre 1-molar succinate ekleyin ve solunumun stabilize olmasını bekleyin. Titrat 0.5-1-mikrolitre artışları 1 milimolar FCCP ve her enjeksiyondan sonra solunum stabilize bekleyin. Solunumda ek bir artış olmayana kadar devam edin.Enjeksiyon şırındını% 70 etanolde üç kez yıkayın. İki mikrolitre 150 mikromoler rotenon ekleyin ve solunumun stabilize olmasını bekleyin. Daha fazla inhibisyon olmadığından emin olmak için bir mikroliter daha rotenon ekleyin.Solunumda bir azalma varsa, solunumda bir azalma olmayana kadar ek enjeksiyonlarla devam edin, ardından enjeksiyon şırındını% 70 etanolde üç kez yıkayın. 125 mikromoler antimisin A'nın iki mikrolitresini ekleyin ve solunumun stabilize olmasını bekleyin. Daha fazla inhibisyon olmadığından emin olmak için bir mikroliter daha antimycin A ekleyin.Solunumda azalma varsa, solunumda bir azalma olmayana kadar ek enjeksiyonlarla devam edin. Şırınnayı% 70 etanol ile üç kez yıkayın. Odanın oksijen konsantrasyonuna bak.Konsantrasyon 125 mikromolarının altındaysa, oda havasına reoksijene veya oksijenin solunum akısını sınırlamamasını sağlamak için hafif hiperoksijenat. Beş mikrolitre 0.8-molar askorbat ekleyin. Şırınnayı% 70 etanolde üç kez yıkayın.Hemen 0,2 molar TMPD'lik 10 mikrolitre ekleyin ve solunumun artmasını bekleyin. Şırıngayı etanol ile yıkadıktan sonra, askorbat TMPD platolarının solunum akısı olduğunda hemen 25 mikrolitre 4-molar sodyum azit ekleyin. Dosya, Kaydet ve bağlantıyı kes'e tıklayarak sonlandırın.Doku homojenatının mililitresinde 40 miligramın hızlı oksijen tükenmesi ile sonuçlendiği gözlendi. Oksijen tüketimi mililitre doku homojenatı başına 30 ve 20 miligram ile önemli ölçüde yavaşladı, ancak substratların veya ADP'nin yokluğunda kısa sürede hızla azaldı. Doku homojenatının mililitre konsantrasyonu başına 10 miligram optimum oksijen tüketim oranı ile sonuçlandı.NADH ve süksinit bağlantılı oksidatif fosforilasyon ve elektron transferinin yanı sıra Kompleks IV aktivitesini değerlendirmek için bir SUIT protokolü kullanılmıştır. Sitokrom C salınımı piruvat ve malat veya süksinit ve rotenon varlığında değerlendirildi, her ikisi de homojen preparatın mitokondrilere zarar vermediğini ortaya koydu. Ayrıca EO771 tümörlerinde NADH bağlantılı oksidatif fosforilasyonun ihmal edilebilir olduğu bulunmuştur.MAKSimal elektron akışını sağlamak için FCCP'nin titrasyonu, EO771 tümörlerinde oksidasyon yerine fosforilasyonun solunumla sınırlı olduğunu ortaya koydu. Tümör homojen solunum profilleri, tümördeki N ve S bağlantılı substratlar tarafından desteklenen azalmış maksimal elektron transferi dışında implante edilmemiş, digitonin permeabilize EO771 hücrelerinin profillerine benzerdi. Süksinit solunum kinetiği, maksimum hıza ulaşana kadar ADP'nin alt doyma titrasyonları ile daha da değerlendirildi.Süksinit ve rotenon varlığında ADP'nin yarı maksimal konsantrasyonu 37,5 mikromolarken, maksimum oran miligram başına saniyede yaklaşık 10,5 piomole idi. Rutin bakımda kurulan aletler ve doku kullanımı, bu deneylerin başarısı için kritik öneme sahiptir. Bu işlemlerin ardından faiz sorununa dayalı olarak oran normalleşmesine yönelik kitle veya işaretleyiciye özgü diğer yaklaşımlar uygulanabilir.Yaygın önlemler, sitrat sintazının toplam protein nicelemesini ve enzimatik aktivitesini içerir, ancak model sistemine, istatistiksel tasarıma ve araştırma sorusuna göre değişir.

analytical-determination-mitochondrial-function-excised-solid-tumor

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Memeli Doku biyopsilerinden mitokondri hızlı izole edilmesi için bir yöntem tarif edilmektedir. Sıçan karaciğer, iskelet kası ya da preparat, ticari ayrıştırıcı doku homojenize edildi ve mitokondri naylon gözenekli filtrelerden geçerek, süzme ile izole edilmiştir. Seçenek yöntemler kullanılarak da 100 dakika - Mitokondriyal izolasyon süresi 60 kıyasla &lt;30 dk.

Doku Ayrışma Ve Diferansiyel süzülerek Nakli İçin Mitokondri Of Rapid İzolasyon ve saflaştırma

Örnekler arasındaki mitokondriyal membran potansiyelinin karşılaştırılması, hücresel durum hakkında değerli bilgiler verir. Mitokondriyi izole etmek ve floresan kullanarak inhibitörlere ve ayrıştırıcılara yanıtı değerlendirmek için ayrıntılı adımlar açıklanmaktadır. Bu protokolün yöntemi ve faydası, bir hücre kültürü ve hücresel stresin hayvan modeli kullanılarak gösterilmiştir.

İzolasyon ve Kültür Hücrelerinin ve Fare Doku gelen Mitokondri Fonksiyonel Analizi

Vastus lateralis biyopsi saflaştırılmış mitokondrinin preparasyonu ve respirometrik profil için yöntemler tarif edilmiştir. Küçük kas hacminin kullanımı klinik araştırma uygulamaları için bu teknik uygundur.

Perkütan İğne Biyopsisi ile Elde Edilen İskelet Kası Doku İzole Mitokondri hazırlanması ve Respirometrik Değerlendirmesi

Amacımız mitokondrial disfonksiyon kanser hastalarında yorgunluk ile ilişkili değerlendirmek için pratik bir protokol geliştirmekti. Bu yenilikçi protokol döneminde klinik kullanımı içeren yalnızca standart flebotomi ve Temel Laboratuvar işlemleri için optimize edilmiştir.

Kanserle ilgili yorgunluk mitokondriyal işlev rolünün değerlendirilmesi

Bu makalede, insan yumurtalık kanseri dokularından mitokondriyi ayırmak ve kantitatif proteomik analiziçin yumurtalık dokularını kontrol etmek için yoğunluk gradyan santrifüj santrifüjü ile birlikte diferansiyel hız santrifüjü protokolü sunmaktadır. bir insan yumurtalık kanseri mitokondriyal proteom yüksek kaliteli mitokondriyal örnek ve yüksek üretim ve yüksek tekrarlanabilirlik kantitatif proteomik analizi ile sonuçlanan.

Yumurtalık Kanseri Dokularından Mitokondri Hazırlanması ve Kantitatif Proteomik Analizi Için Yumurtalık Dokularının Kontrolü

Daha önce dondurulmuş arşivlenmiş katı dokulardan mitokondri ile zenginleştirilmiş örneklerin hazırlanması, araştırmacıların çeşitli deneysel yöntemlerde mitokondrilerin hem fonksiyonel hem de analitik değerlendirmelerini yapmalarına izin verdi. Bu çalışma, donmuş kalp dokusundan mitokondri ile zenginleştirilmiş preparatların nasıl hazırlanacağını ve mitokondrilerin analitik değerlendirmelerinin nasıl yapıldığını göstermektedir.

Daha Önce Dondurulmuş Kardiyak Dokudaki Mitokondriyal Elektron Transfer Komplekslerinin Sow'un Yavrularından Ölçülmesi: Egzersize Bağlı Mitokondriyal Biyoenergetik Değişikliklerini Değerlendirmek için Bir Model

Burada, fare iskelet kasından mitokondri izolasyonu için ayrıntılı bir yöntem ve ardından mikroplaka tabanlı respirometrik testler kullanılarak Oksijen Tüketim Hızı (OCR) ile solunum analizi için ayrıntılı bir yöntem açıklanmaktadır. Bu boru hattı, çoklu çevresel veya genetik müdahalelerin mitokondriyal metabolizma üzerindeki etkilerini incelemek için uygulanabilir.

Respirometrik Testler için Fare İskelet Kasından Mitokondri İzolasyonu

Burada, memeli hücrelerinde moleküler oksijen tüketme yeteneklerinden bağımsız olarak mitokondriyal fonksiyonu doğrudan ölçmek için bir tahlil derlemesi sunuyoruz.

Memelilerde Mitokondriyal Fonksiyonu Ölçmek için Oksijenden Bağımsız Tahliller

Bu protokol, sadece küçük miktarlarda numune mevcut olduğunda solunum süper komplekslerinin analizi için bir tekniği tanımlar.

Küçük Doku ve Hücre Kültürü Örneklerinden Mitokondriyal Süperkompleks Analizi için Mitokondri İzolasyonu 

Bu çalışmada, adım adım bir protokol açıklıyoruz ve canlı hücrelerde mitokondrinin morfolojik özelliklerini belirlemek için numune hazırlama, görüntü elde etme ve veri analizi dahil olmak üzere temel ayrıntıları vurguluyoruz. Bu yöntem, çeşitli koşulları incelemek için mitokondriyal morfolojiyi incelemek için yaygın olarak kullanılır.

Canlı Hücrelerde Mitokondriyal Morfolojinin Konfokal Mikroskopi Kullanılarak Belirlenmesi

Keşfedin, taze tümör homojenatlarında mitokondriyal oksidatif fosforilasyon ve elektron transfer kapasitesini değerlendirmek için hızlı bir yöntem. Bu protokol, kanser biyolojisinde mitokondrial fonksiyonların tanısal yorumlanmasını geliştirir.

Eksiz katı tümör homojenatlarının Mitokondriyal fonksiyonunun analitik tayini

Daha fazla video keşfet