Name: Eski Vivo Kemirgenlerde Trigeminovasküler Sistemden Kalsitonin Geni ile İlgili Peptitin Salınımı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Öğrenin, eski vivo kemirgen modelinde trigeminovasküler sistemden CGRP salınımını nasıl ölçebilirsiniz. Bu yöntem, migren ve ağrı mekanizmalarının farmakolojik modülasyonunu anlamak için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Candys Vakfı tarafından finanse edildi.

Tüm hayvan bakımı ve deneysel prosedürleri, Avrupa Topluluğu'nun hayvanların bakımı ve kullanımı kılavuzuna (2010/63/UE) uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bu protokolü göstermek için 10 haftalık erkek C57BL / 6JBomTac fareleri ve 10 haftalık erkek Sprague Dawley fareleri kullanıldı.
1. Sentetik interstisyel sıvının hazırlanması
<ol><li>Aşağıdaki tarife göre sentetik geçiş sıvısı (SIF) hazırlayın: 108 mM NaCl, 3.48 mM KCl, 3.50 mM MgSO 4, 26 mM NaHCO3, 11.70 mM NaH 2 PO4, 1.50 mM CaCl2, 9.60 mM Na-glukonat, 5.50 mM glikoz ve 7.60 mM sakkaroz (bkz. NOT: SIF, stimülasyon hedefine bağlı olarak değişebilir, örneğin, kalsiyum kanallarını incelerken kalsiyum içermeyen bir çözelti kullanılabilir.</li>
	<li>PH'ı 7,4'e ayarlayın ve karbojen gazıyla pH'ı stabilize edin (%5 CO 2 ve %95 O2)46.</li>
</ol>2. Ötenazi
<ol><li>Yetişkin fareleri ve sıçanları% 70 CO 2 ve% 30O2 karışımı ile anestezialtına alın. Bir çift makas kullanarak farelerin ve bir giyotin kullanarak sıçanların kafasını kesin (bkz. NOT: Araştırmanın amacına uygun bir gerilme ve yaş kullanın. Bu modelde hem erkekler hem de dişiler kullanılabilir.</li>
	<li>Başını, omuriliğin C3-C4 seviyesinde vücuttan ayırın. NOT: Ötenazi, intraperitoneal pentobarbital enjeksiyonu (100-150 mg / kg) ile de yapılabilir.</li>
</ol>3. Diseksiyon
<ol><li>Aşağıdaki adımları izleyerek sıçan dokusunu hazırlayın.<ol><li>Baş ve boyun çevresindeki deri ve kası bir çift makas kullanarak çıkarın (Şekil 1A).</li>
		<li>Alt çeneleri kafadan ayırmak için bir kemik düzeltici ve makas kullanın (Şekil 1B-C).</li>
		<li>Omurların dorsal kısmına kaudal olarak bir kemik düzeltici yerleştirerek omuriliği açın ve omuriliği ve beyin sapını ortaya çıkarmak için omurların dorsal kısmını çıkarın (Şekil 1D).</li>
		<li>Beyinciği açığa çıkaran bu kemik yapılarını çıkarmak için kafatasının kaudal kısmını oksipital ve interparietal kemiklerin sınırlarından kesin (Şekil 1E). NOT: Omurları keserken ve çıkarırken beyin sapına ve omuriliğe zarar vermemek önemlidir.</li>
		<li>Beyin sapının dorsolateral kısmını yaylı makasla keserek her iki taraftaki bregmadan yaklaşık 13-16 mm kaudal olarak çalışan TNC'yi (Sp5C) izole edin. Sol ve sağ taraftaki TNC'yi SIF'ye daldırın (Şekil 1E-I). NOT: Açıklama yetişkin sıçanlara karşılık gelir.</li>
		<li>Bir testere kullanarak kafatasını ikiye bölmek için kafayı orta sagital olarak kesin (Şekil 1J-L).</li>
		<li>Bir spatula kullanarak kafatasına bağlı dura materine dokunmadan ve trigeminal siniri beyin sapına girdiği yerde kesmeden beyni dikkatlice çıkarın (Şekil 1M-P).</li>
		<li>TG'yi izole etmek için, görsel sınırların etrafındaki dalları da dahil olmak üzere kesin. Foramen ovale girdiği mandibuler dalı kesin. Kafatasına giren oftalmik ve maksiller dalları makroskopik olarak bölünmedikleri için kesin. TG'yi parçalara ayırırken, TG'yi kaplayan dura materini çıkarın (Şekil 1Q-T).</li>
		<li>Kafatası yarılarını ve TG'leri SIF'ye batırın.</li>
	</ol></li>
	<li>Aşağıdaki adımları izleyerek fare dokusunu hazırlayın.<ol><li>Küçük makas kullanarak baş ve boyun çevresindeki deri ve kasları çıkarın (Şekil 2A-B).</li>
		<li>Omurların dorsal kısmına kaudal olarak bir çift küçük makas sokarak omuriliği açın ve omuriliği ve beyin sapını ortaya çıkarmak için omurların dorsal kısmını çıkarın (Şekil 2C). NOT: Omurları keserken ve çıkarırken omuriliğe zarar vermemek önemlidir.</li>
		<li>Beyinciği açığa çıkaran bu kemik yapılarını çıkarmak için kafatasını oksipital ve interparietal kemiklerin sınırlarından kesin (Şekil 2D-F).</li>
		<li>Daha sonra, parietal kemiği orta sagital olarak kesin ve serebrum açığa çıkarmak için kemiği çıkarın (Şekil 2G-I).</li>
		<li>Beyin sapını ortaya çıkarmak için beyinciği bir spatula ile dikkatlice çıkarın (Şekil 2J).</li>
		<li>Beyin sapının TNC içeren kısmını yaylı makas kullanarak izole edin (Şekil 2K-N). Beyin sapını TNC ile SIF'ye batırın (Şekil 2O).</li>
		<li>Beyni çıkarın ve trigeminal siniri beyin sapına girdiği yerde kesin (Şekil 2P-Q).</li>
		<li>TG'yi izole etmek için, görsel sınırların etrafındaki dalları da dahil olmak üzere kesin. Foramen ovale girdiği mandibuler dalı kesin. Kafatasına giren oftalmik ve maksiller dalları makroskopik olarak bölünmedikleri için kesin. TG'yi diseke ederken, TG'yi kaplayan dura materini çıkarın (Şekil 2R-S).</li>
		<li>TG'leri SIF'ye daldırın (Şekil 2T).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Yıkama
<ol><li>Kafatası yarılarını, TNC'leri ve TG'leri SIF'de 30 dakika boyunca yıkayın ve SIF'yi oda sıcaklığında her 5 dakikada bir değiştirin. NOT: Yıkama adımları, kolay SIF değişimi sağlamak için doku tül kapaklı plastik kaplarda tutulurken gerçekleştirilebilir (Şekil 3A-B).</li>
	<li>Aşağıdaki adımları izleyerek sıçan dokusunu hazırlayın.<ol><li>TNC yarılarını, 350 μL SIF ile mikrosantrifüj tüp kapaklarını ayırmak için aktarın (Şekil 3C).</li>
		<li>TG'leri mikrosantrifüj tüp kapaklarına aktarın - 350 μL SIF ile mikrosantrifüj tüp kapağı başına bir TG (Şekil 3C).</li>
		<li>Kafatası yarısını kilden veya 6 kuyucuklu bir kültür plakasından yapılmış platformlara yerleştirin ve kafatasını 400 μL SIF ile doldurun (Şekil 3C).</li>
	</ol></li>
	<li>Aşağıdaki adımları izleyerek fare dokusunu hazırlayın.<ol><li>TNC ile beyin sapını 250 μL SIF içeren bir mikrosantrifüj tüp kapağına aktarın (Şekil 3D).</li>
		<li>İki TG'yi 250 μL SIF içeren bir mikrosantrifüj tüp kapağına aktarın (Şekil 3D). NOT: Farelerden doku kullanırken mikrosantrifüj tüp kapağı başına iki TG yerleştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Sıçan kafataslarını ve sıçan ve fare dokusuna sahip mikrosantrifüj tüp kapaklarını 37 ° C'de nemlendirilmiş bir inkübatöre yerleştirin. SIF'i 20 dakika boyunca her 5 dakikada bir pipet kullanarak değiştirin. NOT: SIF eklenirken ve çıkarılırken dokuya dokunmamak önemlidir.</li>
</ol>5. Uyuşturucu testi
<ol><li>Bazal CGRP salınım seviyelerini belirleyin.<ol><li>Son yıkamayı takiben, fare TG ve TNC'ye 250 μL SIF ekleyin. Sıçan TG ve TNC'ye 350 μL ve her sıçan kafatasına 400 μL ekleyin.</li>
		<li>10 dakikalık inkübasyondan sonra, bir mikrosantrifüj tüpünde numunenin 200 μL'sini toplayın ve bazal CGRP salınımının ölçülmesine izin vermek için 50 μL 10x EIA tamponu ekleyin (CGRP enzim immünoassay kiti ile birlikte verilir, Malzeme Tablosuna bakınız) (adım 6). Kalan sıvıyı atın. NOT: Kuluçka süresi tüm numuneler için aynı olmalıdır.</li>
		<li>Hemen numuneleri -20 °C'de saklayın.</li>
		<li>Bazal CGRP salınım seviyelerinin örneklenmesinden sonra, üç yöntemden birini izleyin: (A) Tek stimülasyon (adım 5.2); (B) Konsantrasyon-yanıt stimülasyonu (adım 5.3); ve (C) Stimülasyonun inhibisyonu (adım 5.4) (Şekil 4). NOT: Kullanılan test bileşiği ve konsantrasyonları çalışmanın amacına bağlıdır.</li>
	</ol></li>
	<li>Aşağıdaki adımları izleyerek tek stimülasyon gerçekleştirin.<ol><li>Dokuya test bileşiği veya aracı ekleyin ve 10 dakika bekletin (hacim: fare TG ve TNC için 250 μL, sıçan TG ve TNC için 350 μL ve her sıçan kafatası için 400 μL).</li>
		<li>10 dakikalık inkübasyondan sonra, numunenin 200 μL'sini 50 μL 10x EIA tamponuna sahip bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın. Kalan sıvıyı atın ve numuneleri hemen -20 ° C'de saklayın. NOT: Kuluçka süresi tüm numuneler için aynı olmalıdır.</li>
	</ol></li>
	<li>Aşağıdaki adımları izleyerek konsantrasyon-yanıt stimülasyonu gerçekleştirin.<ol><li>Test bileşiğini veya aracı istenen konsantrasyonlarda seyreltin. Test bileşiğini, en düşük konsantrasyondan başlayarak artan konsantrasyonlarda ekleyin. NOT: Kullanılan test bileşiği ve konsantrasyonları çalışmanın amacına bağlıdır. Örneğin, bu çalışma için 1 μM, 10 μM ve 100 μM süpersinnamaldehit kullanılmıştır.</li>
		<li>Test bileşiğinin en düşük konsantrasyonunu (bu çalışma için 1 μM) ve karşılık gelen aracı iki özdeş doku preparatına ekleyin ve 10 dakika boyunca inkübe edin (hacim: fare dokusu için 250 μL, sıçan TG ve TNC için 350 μL ve her sıçan kafatası için 400 μL).</li>
		<li>10 dakikalık inkübasyondan sonra, numunenin 200 μL'sini 50 μL 10x EIA tamponuna sahip bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın.</li>
		<li>Kalan sıvıyı atın ve dokuya ikinci en düşük konsantrasyonu (bu çalışma için 10 μM) ekleyin.</li>
		<li>Hemen numuneleri -20 °C'de saklayın.</li>
		<li>Bu prosedürü kalan konsantrasyonlarla tekrarlayın (bu çalışma için 100 μM).</li>
	</ol></li>
	<li>Aşağıdaki adımları izleyerek stimülasyonun inhibisyonunu gerçekleştirin.<ol><li>Blokeri veya aracı dokuya ekleyin ve 10 dakika boyunca inkübe edin (hacim: fare dokusu için 250 μL, sıçan TG ve TNC için 350 μL ve her sıçan kafatası için 400 μL). NOT: Kullanılan bloker ve konsantrasyon çalışmanın amacına bağlıdır. Örneğin, Şekil 5'teki temsili sonuç için 3 μM glibenklamid kullanılmıştır.</li>
		<li>10 dakikalık inkübasyondan sonra, 50 μL 10x EIA tamponuna sahip bir mikrosantrifüj tüpünde 200 μL'lik bir numune toplayın. Kalan sıvıyı atın ve numuneleri hemen -20 ° C'de saklayın.</li>
		<li>Agonisti veya agonist + blokeri dokuya ekleyin (bakınız Malzeme Tablosu) ve 10 dakika boyunca inkübe edin. NOT: Kullanılan agonist, bloker ve konsantrasyonlar çalışmanın amacına bağlıdır. Bu çalışmada 3 μM glibenklamid ve 1 μM kapsaisin kullanılmıştır, Şekil 5.</li>
		<li>10 dakikalık inkübasyondan sonra, 50 μL 10x EIA tamponuna sahip bir mikrosantrifüj tüpünde 200 μL'lik bir numune toplayın. Kalan sıvıyı atın ve numuneleri hemen -20 ° C'de saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Deneme için pozitif bir kontrol gerçekleştirin.<ol><li>Uygun olduğunda, protokolün sonundaki dokuya pozitif bir kontrol (örneğin, 1-10 μM kapsaisin, bakınız Malzeme Tablosu) ekleyin ve 10 dakikalık bir inkübasyon süresinden sonra 50 μL 10x EIA tamponu olan bir mikrosantrifüj tüpünde 200 μL'lik bir örnek toplayın. NOT: Kurulumun ve dokuların çalıştığından emin olmak için pozitif bir kontrol eklemek avantajlıdır. Kapsaisin 48,49,50 veya depolarizan potasyum uyaranı (40-60 mM KCl)46,47,49, CGRP'nin trigeminovasküler sistemden salınmasına neden olmak için rutin olarak kullanılır. 40-60 mM KCl SIF, SIF olarak hazırlanır, ancak NaCl, eşmolar bazda KCl ile değiştirilir.</li>
	</ol></li>
</ol>6. CGRP konsantrasyonlarının analizi
<ol><li>Üreticinin protokolünü takip eden bir enzim immünoassay (EIA) kiti kullanarak salınan CGRP miktarını ölçün (bkz.</li>
	<li>Bir plaka fotometresi kullanarak optik yoğunluğu 410 nm'de ölçün. Farklı bir CGRP EIA kiti kullanılıyorsa, optik yoğunluğu üreticinin protokolünde sağlanan dalga boyunda ölçün. NOT: Numuneler standart eğriye uyacak şekilde seyreltilmelidir.</li>
	<li>Veri analizi gerçekleştirin.<ol><li>Verileri mutlak konsantrasyonlar olarak sunun veya spesifik dokudan bazal CGRP salınımına normalleştirin.</li>
	</ol></li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Tarif edilen yöntem migren patofizyolojisinde CGRP'nin önemini gösteren çalışmalar sonrasında geliştirilmiştir. CGRP'nin trigeminovasküler sistemden salınmasında rol oynayan mekanizmaları araştırmak için çok uygundur, bu da baş bölgesinde ağrı sinyalizasyonu için çok önemlidir. Bu modelde elde edilen CGRP miktarı, dura mater, TG ve TNC'yi innerve eden trigeminal sinirlerden CGRP salınımını doğrudan ölçer. CGRP salınım miktarı, insanlarda termokoagülasyondan sonra, kedi39,55,56'da trigeminal stimülasyondan sonra plazmada ölçülen salınımdan 45,54 ve migren atakları sırasında 23'ten kantitatif olarak daha büyüktür. Bir açıklama, CGRP'nin kanda seyreltildiği ve parçalandığıolabilir 54. Bununla birlikte, kimyasallarla doğrudan stimülasyonun patofizyolojik aktivasyondan daha üstün olabileceği unutulmamalıdır. Diğer avantajları, salınımın trigeminovasküler sistem içindeki üç farklı bölgeden bulunmasının mümkün olması ve farmakolojik manipülasyonla birlikte ve genetiği değiştirilmiş kemirgenlerden gelen dokularda kullanılabilmesidir.
Son zamanlarda, birçok klinik öncesi kemirgen modeli, maddelerin sistemik olarak uygulanmasına ve ardından von Frey testi57,58, grimacing 59,60,61 veya hafif isteksizlik 62,63,64 kullanılarak ağrı veya migrenle ilgili okumalara odaklanmaktadır. Bu yöntemler, farklı maddelerin ağrıya neden olan ve ağrı giderici özelliklerini anlamada yararlıdır. Bununla birlikte, bu yaklaşımlar ilgili spesifik hedef dokular hakkında bilgi vermez. Mevcut yöntemde, trigeminovasküler sistem üç yapıya ayrılmıştır: dura mater, TG ve TNC. Bu, her yapının yerel olarak maruz kalmasını ve belirli bir maddenin etki yerinin değerlendirilmesini sağlar. Bu, sıçanlarda voltaj kapılı kalsiyum kanallarının rolünün araştırıldığı 2011 tarihli bir çalışmada kullanılmış ve bu kanalların inhibisyonunun trigeminovasküler yol47'nin üç yapısında farklı olduğu bulunmuştur. Sinir sisteminin yapılarını parçalara ayırırken, aksotomi kaçınılmazdır. Aksotominin çeşitli genlerin transkripsiyonunu değiştirdiği gösterilmiştir65. Bu transkripsiyonel değişiklikler bu yöntemden elde edilen sonuçları etkilemek için çok yavaştır, ancak fosforilasyondaki değişiklikler in vivo durumlarla karşılaştırıldığında dışlanamaz46. CGRP gibi nöropeptitler hücre somasında oluşmasına rağmen, nöropeptitlerin salınımı ve etkisi genellikle merkezi veya periferik sinir terminallerindedir. Bu nedenle, terminaller de dahil olmak üzere sağlam nöronların çalışmaları, nöropeptit salınımını incelerken ilginçtir. Bu nedenle, izole ganglionlardan nöron kültürlerini inceleme yöntemleri, terminallerin bir modeli olarak hizmet etmek üzere kurulmuştur. Bununla birlikte, nöronal hücre kültürleri, mekanik ayrışma bir kültürdeki nöronları yok edebileceğinden çeşitli sorunlara maruz kalmaktadır46. Hücrelerin kültürlenmesi ile ilişkili daha uzun zaman dilimi, bu yöntemi aksotomi ve kültür koşulları nedeniyle transkriptomik değişikliklere duyarlı hale getirir65. Ayrıca, büyüme faktörlerinin eklenmesi ve yüzey kaplamalarında kültürleme, transmitter ve reseptör ekspresyonu66,67,68,69 olarak nöronal özellikleri değiştirmiştir. Bu problemler, nöronal hücre kültürleri yerine taze izole edilmiş sağlam ganglionlar üzerinde çalışırken önlenir.
Exvivo CGRP salınım yöntemiyle ilgili bir zorluk, tekrarlanabilir sonuçlar için gerekli olan dokunun hassas diseksiyonudur. TNC'nin özellikle doğru diseksiyonu zordur, çünkü bu, beyin sapı içinde görünür sınırları olmayan bir yapıdır. Ayrıca, dura mater kırılgandır ve sağlam bir yapı sağlamak için beynin çıkarılmasının dikkatli bir şekilde yapılması gerekir. Bu engeller değişen doku boyutlarına ve dolayısıyla değişen bazal ve stimülasyona bağlı CGRP seviyelerine neden olabilir. Bununla birlikte, bu varyasyon bazal CGRP salınımına normalleştirme ile açıklanabilir. TNC'yi farelerden izole ederken, beyin sapının tüm alt kısmının izole edildiği ve sıçanlarda yapıldığı gibi daha spesifik TNC içeren kısmın izole edilmediği de belirtilmelidir. Genel olarak, sıçan dokusunu kullanmak bir avantaj olabilir, çünkü bu, dura mater'den CGRP salınımının ölçülmesine ve TNC'nin daha hassas diseksiyonuna izin verir. Ayrıca, dokunun büyüklüğü aynı zamanda bir sıçanın araç kontrolü olarak kullanılmasını sağlar, çünkü bir sıçan iki kafatası yarısı, iki TG ve iki TNC ile sonuçlanır, burada dokunun bir parçası madde stimülasyonu için ve diğeri araç için kullanılır. Fareleri kullanırken, her iki TG de bir örnekte toplandığı ve TNC'ler tek bir beyin sapı olarak diseke edildiği için bir deney için iki hayvana ihtiyaç vardır. Bu nedenle, madde stimülasyonu için iki TG ve bir beyin sapı kullanılır ve araç kontrolü için iki TG ve başka bir fareden bir beyin sapı kullanılır. Bu, aynı sayıda replikasyon elde etmek için sıçanlara kıyasla iki kat daha fazla fare kullanılmasına neden olur. Kullanılan fare sayısını azaltmak için, beyin sapı dilimlerinden CGRP salınımını ölçmek için bir yöntem önerilmiştir49. Yöntemin farelerin kullanımını sağlamak için değiştirilmiş olması bir avantajdır. Bu, halihazırda mevcut olan birçok transgenik fare suşunun kullanılmasına izin verir, örneğin sinyal yollarını incelemek için yararlı bir araçtır. Deneyde kullanılan dokunun CGRP'yi serbest bırakabilmesini sağlamak için bir deneyin sonunda pozitif bir kontrol dahil edilmelidir. Pozitif kontrol, hem farelerde hem de sıçanlarda 46,47,48,49,50 numaralı trigeminovasküler sistemden CGRP'yi serbest bıraktığı tespit edilen TRPV1 agonisti kapsaisin veya depolarizan uyaran potasyum (KCl) olabilir. Ayrıca, yöntem aynı zamanda migren araştırmasında büyük ilgi gören bir başka peptid olan hipofiz adenilat siklaz aktive edici peptid (PACAP) olarak diğer ilgili peptitlerin salınımını ölçmek için uyarlanmıştır70.
Yöntem, sıçanlarda ve farelerde belirli hedef dokulardan CGRP salınımını araştırmak için yararlı bir araç sağlar. Nöronların kültürlenmesiyle ilgili sorunları önleyen nispeten hızlı bir yöntemdir. Yöntem protokolü, konsantrasyon-yanıt ilişkisini incelemek veya çeşitli farmakolojik bileşikler tarafından bir yanıtın inhibisyonunu incelemek için kolayca değiştirilebilir. Exvivo CGRP salınım yöntemi, migren patofizyolojisinde CGRP'nin ve CGRP salınımı ile ilgili diğer mekanizmaların rolünü incelemek için yararlı olan birkaç klinik öncesi yöntemden biridir.

Migren, DSÖ'ye göre, 1 milyardan fazla insanı etkilediği tahmin edilen ve dünya çapında engelliliğin önde gelen nedenlerinden biri olan nörolojik bir hastalıktır1. Bu nedenle migrenin hem hastalar hem de toplum üzerinde önemli bir etkisi vardır. CGRP antagonize edici ilaçların son klinik başarısına rağmen, hastaların büyük bir kısmı gelişmiş tedavi seçeneklerine ihtiyaç duymaktadır 2,3,4,5. Yeni etkili tedavilere yol açan migren patofizyolojisinin aydınlatılması gerekmektedir. Meninksler, trigeminal ganglionlar (TG) ve trigeminal nucleus caudalis (TNC)'den oluşan trigeminovasküler sistem içinde sinyalizasyon migren patofizyolojisi için santraldir 6,7.
37 amino asit nöropeptit kalsitonin geni ile ilişkili peptid (CGRP) ilk olarak 1980'lerin başında, Amara ve meslektaşlarının kalsitonin 8,9'a ek olarak CGRP için mRNA kodlaması vermek üzere kalsitonin geninin birincil RNA-transkriptinin işlenebileceğini gösterdiğinde keşfedildi. Sonraki araştırmalar migren patofizyolojisi10 ile bir bağlantı olduğunu öne sürdü. CGRP, güçlü vazodilatasyon özelliklerine sahip bir nörotransmitterdir 11,12,13,14,15,16,1 7 ve merkezi ve periferik sinir sisteminde yaygın olarak dağılır 13,14,18,19,20,21,22 . CGRP'nin migrene katılımı, insanlarda migren atakları sırasında ekstraserebral dolaşımda artmış CGRP seviyelerinin keşfi ile vurgulanmıştır23 ve CGRP infüzyonunun hastalarda migren benzeri ağrıya neden olduğu24. İki yıl sonra, CGRP antagonisti olcegepant'ın migren tedavisinde etkililiğine dair ilk kavram kanıtı çalışması yayınlandı25.
CGRP, TG 21,26'da gösterildiği gibi trigeminovasküler sistemde, dura mater27,28,29 ve TNC 30'u innerve eden duyusal sinir liflerinde bol miktarda bulunur. Trigeminovasküler sistemde, CGRP, TG'nin küçük-orta büyüklükteki nöronlarında, miyelinlenmemiş C-liflerinde bulunur ve TG'nin nöronal popülasyonunun yaklaşık% 50'sinde eksprese edilir. CGRP reseptörü esas olarak daha büyük nöronlarda eksprese edilir ve miyelinli Aδ-liflerindebulunur 31,32. CGRP, kimyasal veya elektriksel stimülasyon üzerine nöronlardan salınır33,34. CGRP salınımına yol açan yolakların incelenmesi ve bu aktivasyonun yeri migren patofizyolojisini anlamak için çok önemlidir. Son 5 on yıl boyunca, klinik öncesi çalışmalar migrenle ilişkili sinyalizasyon hakkında kapsamlı bilgi edinilmesine katkıda bulunmuş ve yeni tedavilerin geliştirilmesine katkıda bulunmuştur35. Migren araştırmalarında vasküler ve nörojenik tutulumu göz önünde bulunduran birçok yöntem modifiye edilmiş ve uygulanmıştır. Biyolojik bileşiklere veya farmakolojik tedavilere arteriyel yanıtların in vivo ve in vitro modellerinden17,36,37 ve elektriksel sinir stimülasyonu 38,39'dan bahsedilebilir. Ayrıca, TNC'deki aktive nöronlar c-Fos ekspresyonu40,41,42 ve bu bölgedeki elektrofizyolojik kayıtlar 43,44 ile tespit edilebilir. Her iki yöntem de beyine kafadan iletilen nosiseptif sinyalleri ölçer, örneğin dura mater. Sadece bir preklinik modelin kullanılması, migren patofizyolojisinin tam resmini sunmamaktadır. Bu nedenle, migren patofizyolojisinin mümkün olduğunca çok yönünü kapsayan farklı modelleri birleştirmek önemlidir. Yeni modellerin sürekli geliştirilmesi, migren mekanizmalarının çeşitli yönlerini kapsayacak ve zamanla migren patofizyolojisinin gizemi ortaya çıkacaktır.
Burada, kimyasal stimülasyondan sonra farelerden izole TG ve TNC'de ex vivo olarak gerçekleştirilen CGRP salınım yönteminin ayrıntılı bir protokolü sunulmaktadır. CGRP salınımı ayrıca sıçanlardan dura materde de incelenebilir. Böylece, sıçanlar için deneysel protokolde, dura mater TG ve TNC ile birlikte tanımlanmıştır. CGRP salınım yönteminin temeli ilk olarak 1999 yılında, Ebersberger ve meslektaşlarının öncü araştırmalar yürüttüğü ve CGRP'nin sıçanlarda dural afferentlerin kimyasal ve elektriksel uyarılmasından sonra dura materden salındığını bulduğu45 yılında tanımlanmıştır. Daha sonra, bu yaklaşım TG46 ve TNC47'den CGRP sürümüne genişletildi. Daha sonra, yöntem farelerde TG ve TNC'ye uygulanacak şekilde değiştirildi. Şimdiye kadar, dura mater'den CGRP salınımı farelerde zor olmuştur.

<table><tbody><tr><td>6 oyuklu kültür plakası</td><td>NUNC</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür dihidrat</td><td>Merck</td><td>1.02382.1000</td><td>SIF tampon</td></tr><tr><td>için Plastik kaplar için kapaklar</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>536617</td><td></td></tr><tr><td>Kapsaisin</td><td>Merck</td><td>M2028</td><td></td></tr><tr><td>CGRP kitleri</td><td>AH Teşhis</td><td>A05482.96</td><td></td></tr><tr><td>CO2</td><td>Strandm&oslash; llen</td><td>4.6</td><td>SIF Hassas Kemik Düzelticinin karbojen gazlaması için</td></tr><tr><td></td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>16109-14</td><td></td></tr> SIF tamponu için <tr><td>Glibenklamid</td><td>Tocris</td><td>911</td><td></td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Merck</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Sıçanlar için</td><td>giyotin Skandidakt</td><td>NS-802</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum sülfat heptahidrat</td><td>Merck</td><td>M5921</td><td>SIF tamponu için</td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpleri + kapaklar / kapaklar</td><td>VWR</td><td>700-5239</td><td></td></tr><tr><td>Mini Demir Testeresi</td><td>BAHCO</td><td>208</td><td></td></tr><tr><td>O2</td><td>Strandm&oslash; llen</td><td>4.5</td><td>SIF'in karbojen gazlaması için,</td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>Glostrup eczanesi</td>, <td>NA</td>, <td>Majistral formül</td></tr>, <tr><td>Plastik kaplar, ThermoFisher</td><td>Scientific</td><td>536455</td><td></td></tr>, <tr><td>Plaka fotometresi - Infinite M200</td>, <td>Tecan</td><td>NA</td><td>, Infinite M200'ün üretimi durduruldu. Tecan. adresinde bir Infinite 200 PRO mevcuttur. Yazılım: SW Magellan v.6.3</td></tr><tr><td>SIF tamponu için</td>potasyum<td>klorür</td><td>Merck</td><td>P9333</td></tr><tr><td>Makas</td><td>Allgaier Aletleri</td><td>307-156-170</td><td></td></tr><tr><td>Küçük makas</td><td>Allgaier Aletleri</td><td>04-520-115</td><td></td></tr><tr><td>SIF tamponu</td>Sodyum klorür<td></td><td></td><td></td> için Sodyum bikarbonat Merck S6014</tr><tr><td></td><td>SIF</td><td>tamponu için</td>Merck <td>S9888</td></tr><tr><td>Sodyum dihidrojen fosfat monohidrat</td><td>SIF tamponu için</td><td>Merck</td><td>1.06346.1000</td> SIF</tr><tr><td>tamponu için</td><td>Sodyum glukonat</td><td>Merck</td><td>S2054</td></tr><tr><td>Spatula</td><td>Bochem Lab Kaynağı</td><td>3018</td><td></td></tr><tr><td>Yaylı makas</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>15024-10</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Merck</td><td>84097</td><td>için SIF tamponu</td></tr><tr><td>Supercinnamaldehit</td><td>Merck</td><td>S3322</td><td></td></tr><tr><td>Tül (kumaşlar)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Yerel kumaş mağazasından satın alındı</td></tr></tbody></table>

eski vivo kemirgenlerde trigeminovasküler sistemden kalsitonin geni ile İlgili peptitin salınımı

Ex Vivo Release of Calcitonin Gene-Related Peptide from the Trigeminovascular System in Rodents

Kalsitonin geni ile ilişkili peptid (CGRP) ilk olarak 1980'lerde kalsitonin geninden bir ek varyant olarak keşfedilmiştir. Keşfinden bu yana, migren patofizyolojisindeki rolü, önce güçlü vazodilatör özellikleri ve daha sonra duyusal trigeminovasküler sistemde bir nörotransmitter olarak varlığı ve işlevi ile iyi bir şekilde kurulmuştur. CGRP'nin migrene neden olma yeteneği, ilaç endüstrisine CGRP'nin etkisini inhibe eden monoklonal antikorlar ve antagonistler geliştirmeleri için destek sağlamıştır. Yeni bir tedavi paradigmasının migrenin profilaktik tedavisinde etkili olduğu kanıtlanmıştır. Migren mekanizmalarını daha iyi anlamak için yararlı araçlardan biri, trigeminovasküler sistemden CGRP salınımının ex vivo modelidir. Yeni etkili migren tedavilerini daha da geliştirmek için know-how elde etmek için çeşitli farmakolojik araçlarla kullanılabilecek nispeten basit bir yöntemdir. Bu protokol, bir CGRP salınım modelini ve farmakolojik ajanların kemirgenlerde trigeminovasküler sistemden salınan CGRP miktarı üzerindeki etkisini ölçme tekniğini açıklamaktadır. Ötanaziden protein düzeylerinin ölçümüne deneysel yaklaşımı açıklayan bir prosedür sunulmaktadır. Trigeminal ganglionun ve trigeminal nucleus caudalis'in hem farelerden hem de sıçanlardan temel izolasyonu ve sıçan dura materinin hazırlanması ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. Ayrıca, her iki türden (sıçanlar ve fareler) temsili sonuçlar sunulmaktadır. Bu teknik, migren patofizyolojisinde rol oynayan moleküler mekanizmaları çeşitli farmakolojik bileşikler ve genetiği değiştirilmiş hayvanlar kullanarak araştırmak için anahtar bir araçtır.

Bu teknik, migrende rol oynayan CGRP ile ilişkili moleküler mekanizmaları araştırmak için kullanılan bir araçtır. Trigeminovasküler sistemin farklı seviyelerinden CGRP salınımını değerlendirme avantajına sahiptir ve çeşitli farmakolojik bileşiklerle kombinasyon halinde hem vahşi tip hem de transgenik farelere ve sıçanlara uygulanabilir. Burada, sıçanlardan konsantrasyon-yanıt ve blokaj deneyleri ve vahşi tip ve transgenik farelerden konsantrasyon-yanıt sonuçları sunulmaktadır.
CGRP salınım yöntemi, dişi spontan trigeminal allodinik (STA) sıçanlarda KATP kanal inhibitörü glibenklamidin TG ve dura mater'den CGRP salınımı üzerindeki etkisini incelemek için kullanıldı. İlk olarak, optimum kapsaisin konsantrasyonu, bir konsantrasyon-yanıt çalışması tasarımı kullanılarak bulundu. Kapsaisin maruziyeti, dura mater ve TG'den araca kıyasla önemli bir CGRP salınımına neden oldu (Şekil 5). Dura materinde, CGRP'nin maksimum salınımı 1 μM kapsaisin'de bulundu ve TG'de maksimum CGRP salınımı 10 μM kapsaisin'de bulundu (Şekil 5A-B). Konsantrasyon-yanıt deneylerine dayanarak, deneyleri bloke etmek için 1 μM kapsaisin ve 3 μM glibenklamid kullanılmıştır. Glibenklamid, tek yönlü ANOVA51 ile analiz edildiğinde dura mater (P = 0.441) ve TG'den (P = 0.881) bazal CGRP salınımı üzerinde hiçbir etki göstermedi. Glibenklamid, tek yönlü ANOVA ile analiz edildiğinde araçla kapsaisin ile karşılaştırıldığında, dura mater'de kapsaisin kaynaklı CGRP salınımını% 40 (P = 0.031) ve TG'de% 39 (P = 0.003) oranında önemli ölçüde azaltmıştır (Şekil 5C-D)51.
Farelerde, protokol, GTN'nin neden olduğu aşırı duyarlılığın TRPA1 kanallarına tamamen bağımlı olduğu bir GTN fare migren modelinde geçici reseptör potansiyel ankirin 1 (TRPA1) iyon kanalının katılımını incelemek için kullanıldı. TRPA1 agonisti süpersinnamaldehitin (SCA), CGRP'yi TG'den 1 μM, 10 μM ve 100 μM SCA ile doza bağımlı bir şekilde serbest bıraktığı ve iki yönlü ANOVA ile analiz edildiğinde sırasıyla% 9 (P = 0.23),% 51 (P = 0.011) ve% 69 (P = 0.0097) artmış CGRP salınımına neden olduğu bulunmuştur. Bu salınım, 1 μM, 10 μM ve 100 μM SCA'ya maruz kalmanın, iki yönlü ANOVA ile analiz edildiğinde, CGRP salınımında sırasıyla% 11 (P &gt; 0.99), -% 13 (P &gt; 0.99) ve% 9 (P = 0.97) yüzde değişime neden olduğu Trpa1 null farelerden TG'de yoktu. 10 μM kapsaisin (pozitif kontrol) ile sonraki stimülasyon, tüm doku örneklerinin CGRP'yi serbest bırakabileceğini göstermektedir (Şekil 6)50.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63723/63723fig01.jpg"> Şekil 1: Sıçanlardan doku diseksiyonu adım adım yapılır. (A-T) ayrıntıları protokol bölümünde verilmiştir (adım 3.1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63723/63723fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63723/63723fig02.jpg"> Şekil 2: Farelerden doku adım adım diseksiyonu. (A-T) ayrıntıları protokol bölümünde verilmiştir (adım 3.2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63723/63723fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63723/63723fig03.jpg"> Şekil 3: Kemirgen dokusunun yıkanması ve kuluçkalanması. (A-B) SIF ile plastik kaplarda taze izole edilmiş doku. Kaplar, SIF'in kolayca değiştirilmesini sağlamak için tül ile kaplanmıştır. (C) Sıçan dokusu - 6 kuyucuklu bir kültür plakasına yerleştirilmiş kafatasının iç astarlarını kaplayan dura mater ile iki kafatası yarısı. Sağ ve sol trigeminal çekirdek kaudalis ayrı mikrosantrifüj tüp kapaklarında (kapakların üst sırası). Bireysel mikrosantrifüj tüp kapaklarındaki iki trigeminal gangliyon (kapakların alt sırası). (D) Fare dokusu - Ayrı bir mikrosantrifüj tüp kapağında (üstte) beyin sapının trigeminal çekirdek kaudalis içeren kısmı. İki fare trigeminal gangliyonu bir mikrosantrifüj tüp kapağında (altta) bulunur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63723/63723fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63723/63723fig04.jpg"> Şekil 4: CGRP sürümü için tasarımları inceleyin. CGRP sürüm deneylerini gerçekleştirmek için üç farklı protokol. İlaçlar sentetik interstisyel sıvı (SIF) içinde seyreltilmelidir. (A) Tek stimülasyon. (B) Konsantrasyon-yanıt stimülasyonu. (C) Bir stimülasyonun inhibisyonu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63723/63723fig04large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63723/63723fig05.jpg"> Şekil 5: Glibenklamid, sıçan dura mater ve trigeminal gangliondan kapsaisin kaynaklı CGRP salınımını inhibe eder. Aslen Thomas Jefferson Üniversitesi52'den elde edilen dişi spontan trigeminal allodinik (STA) sıçanlardan (215-318 g) izole edilen trigeminal ganglion ve dura mater'den CGRP seviyeleri, ticari insan CGRP EIA kitleri ile ölçülmüştür. (A-B) Kapsaisin konsantrasyonlarını (10 nM, 100 nM, 1 μM ve 10 μM) arttırdıktan sonra (A) dura mater ve (B) trigeminal gangliondan CGRP salınımı (n = 4). Veriler tek tek noktalar halinde sunulmuş ve iki yönlü ANOVA ile analiz edilmiştir. p &lt; 0.0001 (C-D) Araç, 3 μM glibenklamid (glib), 1 μM kapsaisin ve 1 μM kapsaisin + 3 μM glib (n = 6-11) maruz kaldıktan sonra (C) dura mater ve (D) trigeminal gangliondan salınan CGRP seviyeleri. Veriler tek tek noktalar ve ortalama değerler olarak sunulmuş ve tek yönlü ANOVA ile analiz edilmiştir. *araçla karşılaştırıldığında. #capsaicin ile karşılaştırıldığında capsaicin + glib. #P 0,05, ** ve ##P 0,01 &lt;, ****P 0,0001 &lt; &lt;. Analizler Bonferroni'nin çoklu karşılaştırma testi ile takip edildi. Tüm testler için anlamlı düzeyde α = 0.05 kullanılmıştır. Bu rakam Christensen ve ark. 51. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63723/63723fig05large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63723/63723fig06.jpg"> Şekil 6: SCA'ya maruz kalma, fare trigeminal ganglionundan TRPA1'e bağımlı CGRP salınımına neden olur. WT ve Trpa1 null (Trpa1tm1/Dpc)53 erkek fareden (8-10 hafta) izole edilen trigeminal gangliondan salınan CGRP düzeyleri, pozitif kontrol olarak 1 μM, 10 μM ve 100 μM'de süpersinnamaldehit (SCA) ve 10 μM'de kapsaisin maruziyetinden sonra sıçan CGRP EIA kitleri ile ölçüldü (n = 6). Her fareden gelen veriler ayrı noktalar olarak sunulur ve çubuklar ortalama değerleri gösterir. İstatistikler: Her konsantrasyonda SCA ve araç ile bazal ve pozitif kontrol arasında karşılaştırma iki yönlü tekrarlanan ANOVA ile yapıldı. Önemli bir α seviyesi = 0.05. *P &lt; 0,05, **P 0,01'&lt;. Bu rakam Christensen ve ark. 50. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63723/63723fig06large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Bu protokol, ex vivo kalsitonin genine bağlı peptid (CGRP) salınım modelini ve farmakolojik ajanların kemirgenlerde trigeminovasküler sistemden salınan CGRP miktarı üzerindeki etkisini ölçme stratejisini açıklamaktadır.

Eski Vivo Kemirgenlerde Trigeminovasküler Sistemden Kalsitonin Geni ile İlgili Peptitin Salınımı

Calcitonin gene-related peptide (CGRP) was first discovered in the 1980s as a splice variant from the calcitonin gene. Since its discovery, its role in ...

Bu yöntem, CGRP'nin trigeminal vasküler sistemden salınmasında rol oynayan mekanizmaları araştırmak için kullanılan bir araçtır. Bu yöntemin temel avantajı, trigeminal vasküler sistemi üç farklı bölgeye bölme ve CGRP'nin her bir ayrı bölgede salınımını değerlendirme yeteneğidir. Prosedürü gösterecek olan ben ve grubumuzdan kıdemli bir bilim adamı olan Inger Jansen-Olesen olacak.Başlamak için, makas kullanarak baş ve boyun çevresindeki cildi ve kası çıkararak sıçan dokusunu hazırlayın. Daha sonra, alt çeneleri kafadan ayırmak için bir kemik düzeltici ve bir çift makas kullanın. Şimdi omuriliği ve beyin sapını, omurların dorsal kısmına kaudal olarak bir kemik düzeltici yerleştirerek ve çıkararak ortaya çıkarın.Daha sonra kafatasının kaudal kısmını, bu kemik yapılarını çıkarmak için oksipital ve interparietal kemiklerin sınırlarından kesin ve beyinciği açığa çıkarın. TNC'yi her iki taraftaki bregmadan yaklaşık 13 ila 16 milimetre kaudal olarak izole etmek için, beyin sapının dorsolateral kısmını yaylı makasla kesin. Bunu sol ve sağ taraftaki TNC'yi SIF'ye batırmak izler.Ardından, kafatasını testere kullanarak ikiye bölmek için kafayı orta saggitally olarak kesin. Şimdi bir spatula kullanarak kafatasına bağlı dura materine dokunmadan beyni dikkatlice çıkarın. TG'yi izole etmek için, foramen ovale giren mandibuler dal ve kafatasına giren oftalmik ve maksiller dallar ile görsel sınırların etrafındaki dallarını da dahil ederek kesin.Ardından kafatası yarılarını ve TG'leri SIF'ye batırın. Fare dokusunu hazırlamak için, makas kullanarak baş ve boyun çevresindeki cildi ve kası çıkarın. Şimdi omuriliği ve beyin sapını, omurların sırt kısmına kaudal olarak bir çift makas sokarak ve çıkararak ortaya çıkarın.Daha sonra, beyinciği açığa çıkaran bu kemik yapılarını çıkarmak için kafatasının kaudal kısmını oksipital ve interparietal kemiklerin sınırlarından kesin. Parietal kemiği orta saggital olarak kesin ve serebrum açığa çıkarmak için kemiği çıkarın. Bir spatula kullanarak beyin sapını ortaya çıkarmak için beyinciği dikkatlice çıkarın.Beyin sapının bir kısmını içeren TNC'yi yaylı makasla izole edin, ardından beyin sapını SIF'ye batırın. Şimdi bir spatula kullanarak beyni dikkatlice çıkarın ve trigeminal siniri beyin sapına girdiği yerde kesin. TG'yi izole etmek için, foramen ovale girdiği mandibuler dal ve kafatasına giren oftalmik ve maksiller dallar ile görsel sınırların etrafındaki dallarını da dahil ederek kesin.Ardından, TG'leri SIF'ye bırakın. SIF'in kolay değişimi için, plastik kaplara bir ücretli kapak ekleyin ve SIF'yi her beş dakikada bir değiştirerek sıçan ve fare dokusunu SIF'de 30 dakika boyunca yıkamaya başlayın. Oda sıcaklığında 30 dakikalık yıkamanın ardından, 350 mikrolitre SIF ile mikrosantrifüj tüp kapaklarını ayırmak için sıçan TNC yarısını ve sıçan TG'lerini aktarın.TNC'li fare beyin sapını 250 mikrolitre SIF içeren bir mikrosantrifüj tüp kapağına aktarın. Son olarak, iki fare TG'sini 250 mikrolitre SIF içeren bir mikrosantrifüj tüp kapağına aktarın. Sıçan kafatası yarısını altı kuyucuklu bir kültür plakasına yerleştirin ve kafatasını 400 mikrolitre SIF ile doldurun.Sıçan kafataslarını, 37 santigrat derecede nemlendirilmiş bir inkübatörde sıçan ve fare dokusu ile mikrosantrifüj tüp kapaklarına yerleştirin. SIF'i dokuya dokunmadan 20 dakika boyunca her beş dakikada bir pipet kullanarak değiştirin. Uygun etiketleme ile numune toplama için mikrosantrifüj tüpleri hazırlayın.Daha sonra her bir mikrosantrifüj tüpüne 50 mikrolitre 10 mukavemetli EIA tamponu ekleyin. Daha sonra, tüm konsantrasyonlar için SIF'de seyrelterek test bileşiği çözeltisini ve araç çözeltisini hazırlayın. Son yıkamayı takiben, fare TG ve TNC'ye 250 mikrolitre SIF, TG ve TNC'yi sıçanlamak için 350 mikrolitre SIF ve her sıçan kafatasına 400 mikrolitre SIF ekleyin.10 dakikalık inkübasyondan sonra, bazal CGRP salınımının ölçülmesini sağlamak için numunenin 200 mikrolitresini 50 mikrolitre 10 mukavemetli EIA tamponu ile önceden etiketlenmiş bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın. Kalan sıvıyı atın ve numuneleri hemen eksi 20 santigrat derecede saklayın. Test bileşiğini ilgili araca artan konsantrasyonlarda, en düşük konsantrasyondan başlayarak ekleyin ve 10 dakika boyunca inkübe edin.10 dakikalık inkübasyondan sonra, numunenin 200 mikrolitresini, 50 mikrolitre 10 mukavemetli EIA tamponu ile önceden etiketlenmiş bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın. Kalan sıvıyı atın ve dokuya ikinci en düşük konsantrasyonu ekleyin. Numuneleri hemen eksi 20 santigrat derecede saklayın ve bu prosedürü kalan konsantrasyonla tekrarlayın.Deney için pozitif bir kontrol gerçekleştirmek için, protokolün sonunda dokuya pozitif kontrolü ekleyin. 10 dakikalık bir kuluçka süresinden sonra, 50 mikrolitre 10 mukavemetli EIA tamponu içeren bir mikrosantrifüj tüpünde 200 mikrolitrelik bir numune toplayın. Toplanan numunelerde salınan CGRP konsantrasyonları, üreticinin ÇED kiti ile birlikte verilen talimatlarına uyarak bir ÇED kiti kullanılarak ölçülür.Sıçanda, kapsaisin maruziyeti, araca kıyasla dura mater ve TG'den önemli bir CGRP salınımına neden oldu. Dura materinde, CGRP'nin maksimum salınımı bir mikromolar kapsaisinde bulundu. TG'de, maksimum CGRP salınımı 10 mikromolar kapsaisin'de bulundu.Tek yönlü ANOVA ile analiz edildiğinde, glibenklamid, dura mater ve TG'den bazal CGRP salınımı üzerinde hiçbir etki göstermez. Glibenklamid, tek yönlü bir ANOVA ile analiz edildiğinde, dura mater'de kapsaisin kaynaklı CGRP salınımını% 40 ve TG'de% 39 oranında önemli ölçüde azaltmıştır. Geçici reseptör potansiyeli Ankirin-1 agonisti süper sinnamaldehitin, iki yönlü ANOVA ile analiz edildiğinde araca kıyasla sırasıyla% 9% 52 ve% 69 artmış CGRP salınımı ile sonuçlanan 1, 10 ve 100 mikromolar süper sinnamaldehit ile TG'den konsantrasyona bağımlı bir şekilde CGRP salınımı yaptığı bulunmuştur. CGRP'nin artmış salınımı TG'de, geçici reseptör potansiyeli Ankyrin-1 nakavt farelerinde yoktu, burada 1, 10 ve 100 mikromolar süper sinnamaldehitin maruz kalması, iki yönlü ANOVA ile analiz edildiğinde araca kıyasla CGRP salınımında sırasıyla% 11 eksi% 13 ve% 9 değişikliğe neden oldu.Numune toplama sırasında dokuya dokunmamaya dikkat etmek ve tüm numuneler için kuluçka süresini zamanlarken hassas olmak önemlidir. Yeterli ELISA kitleri mevcutsa, trigeminal vasküler sistemde bulunan diğer peptitlerin salınımını ölçmek için bu prosedürü uygulamak mümkündür.

ex-vivo-release-calcitonin-gene-related-peptide-from

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Kaynak: Shannonhouse, J.,  et al. İn Vivo Sağlam dorsal kök gangliyonlarındaki primer duyusal nöron ağlarındaki nöronal toplulukların kalsiyum görüntülemesi. J. Vis. Uzm. (2023). Video, transgenik bir farenin dorsal kök gangliyonlarındaki (DRG) nöronal aktiviteyi izlemek için in vivo bir kalsiyum görüntüleme tekniğini göstermektedir. DRG nöronları, kalsiyuma bağlandıktan sonra floresan yoğunluğunu artıran bir kalsiyum indikatörünü ifade eder. Bir arka pençeye uygulanan mekanik veya termal...

Bir farenin sağlam dorsal kök gangliyonlarındaki nöronal toplulukların in vivo kalsiyum görüntülemesi

Burada, sırasıyla CGRP ve phalloidin ile immünoforezan ve floresan histokmisi kullanarak kraniyal dura materdeki kalsitonin genle ilişkili peptid (CGRP)-immünoreaktif sinir lifleri ve kan damarlarının mekansal korelasyonunu görselleştirmek için bir protokol sunuyoruz. Ek olarak, bu sinir liflerinin kökeni floresan bir nöral izleyici ile retrograd izlenmiştir.

Sıçan Kraniyal Dura Mater'in Kalsitonin Geni ile İlgili Peptid İmmünoreaktif Innervasyonunun İmmünofluoresans ve Nöral İzleme ile Görselleştirilmesi

Genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (GECI), duyusal nöron sinyalinin sağlam, popülasyon düzeyinde bir analizini sağlar. Burada, sıçan trigeminal gangliyon nöron aktivitesinin in vivo GECI görselleştirmesine izin veren yeni bir yaklaşım geliştirdik.

Canlı Olarak Taşınabilir Sıçan Trigeminal Ganglionundaki Duyusal Nöronların Kalsiyum Görüntülemesi

Bu çalışma, senkron EKG kayıtları ile birlikte in vivo kalsiyum görüntüleme için anestezi uygulanmış farelerde T-DRG'yi ortaya çıkarmak için cerrahi bir manipülasyon sunmaktadır. Bu yöntem, periferik elektriksel sinir stimülasyonu ve torasik viseral organ girdilerinin yanı sıra bunların birincil duyusal düzeydeki etkileşimlerini incelemek için son teknoloji bir araçtır.

Periferik Sinir Stimülasyonunu İncelemek için İn Vivo Torasik Dorsal Kök Gangliyonları (DRG) Kalsiyum Görüntüleme ve EKG Kaydı

Bu protokol, sağlam trigeminal ganglion (TG) nöronlarının in vivo GCaMP kalsiyum görüntülemesini tanımlar. Bu tanım, TG maruziyet cerrahisini, TG nöronlarının in vivo konfokal mikroskopi görüntülemesini, TG nöronlarının mikroskobik görüntülemesi sırasında somatik uyaranların uygulanmasını ve in vivo GCaMP kalsiyum görüntüleme verilerinin analizini içerir.

In vivo (İn canlı) İntakt Trigeminal Gangliyonlarda Primer Duyusal Nöron Ağlarında Nöronal Toplulukların Kalsiyum Görüntülemesi

Bu yöntem, Organotipik serebellar kültürlerin üretimi ve farklı serebellar hücre tiplerinin canlılığı belli apoptotik uyaranların etkisi açıklanmıştır.

Organotipik Serebellar Kültürler: Apoptotik Zorluklar ve Tayin

Biz burada, sıçan ve insan burun boşlukları olfaktör mukoza biyopsi için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu biyopsiler, beyin hastalıkları moleküler anomaliler tespit edilmesi ya da beyin travması / hastalık hayvan modellerinde hücre nakli için kullanılabilir multipotent yetişkin kök hücreleri izole ya için de kullanılabilir.

Kemirgenler ve İnsanlar Burun Koku Kök Hücreler Yalıtımlı

Bu yazıda, aynı anda çoklu bilişsel davranışları test ve kemirgenler için nöronal aktiviteleri kayıt yeteneğine sahip tam otomatik ve çok yönlü bir sistem sunuyoruz.

Multi-bilişsel işlevler Test ve Kemirgenler Nöronal Etkinlikler kayıt için Tam Otomatik ve Çok Yönlü Sistemi

A yöntemi genel mikro-kabarcıkların ve ultrason ile fare kan-beyin bariyerini açılması için tarif edilmiştir. Bu teknik kullanılarak, manganez fare beyin için uygulanabilir. Manganez depolarize nöronlarda birikerek bir MR kontrast madde olduğundan, bu yaklaşım nöronal aktivitenin görüntüleme sağlar.

Ultrasonik Kan-beyin bariyeri bozulması ve Manganez kontrastlı MRG kullanma İşlevsel beyin görüntüleme

Optogenetik, davranışsal sinirbilim deneylerinde kullanım için güçlü bir araç haline geldi. Bu protokol, lazer sistemlerinin tasarımı ve kurulumu için adım adım bir kılavuz sunar ve çoğu kemirgen davranışsal test paradigmasıyla uyumlu çoklu ve eşzamanlı in vivo optogenetik stimülasyonların gerçekleştirilmesi için tam bir protokol sağlar.

Kemirgen Santral Sinir Sistemi vivo optogenetic Stimülasyon içinde

Öğrenin, eski vivo kemirgen modelinde trigeminovasküler sistemden CGRP salınımını nasıl ölçebilirsiniz. Bu yöntem, migren ve ağrı mekanizmalarının farmakolojik modülasyonunu anlamak için değerlidir.

Eski Vivo Kemirgenlerde Trigeminovasküler Sistemden Kalsitonin Geni ile İlgili Peptitin Salınımı

Daha fazla video keşfet