In Situ Yüzey Geliştirilmiş Raman Spektroskopisi Karakterizasyonları için Plazmonik Nanopartiküllerin Optik Yakalanması
23 Haziran 2022
Mevcut protokol, hassas moleküler algılama için plazmonik nanopartikülleri manipüle etmek üzere optik yakalama ve yüzey ile geliştirilmiş Raman spektroskopisini (SERS) entegre etmek için uygun bir yaklaşımı açıklamaktadır. Ajanları toplamadan, yakalama lazeri, in situ spektroskopik ölçümler için hedef analitlerin SERS sinyallerini geliştirmek üzere plazmonik nanopartikülleri bir araya getirir.
Bu protokol, hedef analitlerin hassas tespitini sağlamak için agregasyon ajanlarının yokluğunda SERS-aktif nanopartikül montajı için mekansal ve zamansal kontrol sağlar. Yöntemimizin temel avantajı, SERS-aktif nanopartikül tertibatını oluşturmak için agregasyon ajanlarının kullanılmamasıdır, bu nedenle fizyolojik koşullar altında hassas biyomolekülleri analiz etmek için uygun olarak kullanılır. Mikroakışkan bir sistemde çözeltilerde ve fizyolojik koşullar altında hastalık biyobelirteci gibi analit moleküllerini tespit etmek için umut verici bir platformdur.
Bu yöntemi ilk kez kullanırken, bir araştırmacının en iyi performansı elde etmek için yakalama lazer gücünü, ışınlama süresini ve gümüş nanopartikül konsantrasyonunu ince ayarlaması gerekebilir. Başlamak için, 532 nanometrelik bir lazer ışınını optik cımbız mikroskobunun esnek portuna yönlendirin. 532 nanometre lazer ışınını, numune odasına odaklanmak için orijinal yakalama lazer ışınlarıyla birleştirmek için 750 nanometre uzun geçişli dikroik ayna ile optik cımbız mikroskobun stereo çift katmanlı yollarına hizalayın.
750 nanometre uzun geçişli dikroik ayna kullanarak numune odasından geriye saçılan ışığı toplayın ve sıvı-azot soğutmalı yük bağlantılı cihaz kamerası içeren bir spektrometreye yönlendirin. Spektral kazanımdan önce spektrometrenin giriş yarığının önüne 532 nanometrelik bir çentik filtresi yerleştirin. Cam sürgüyü temizleyin ve kaymayı su ve etanol ile örtün.
Bir bölme oluşturmak için çerçeve bandını cam slayda takın. Çerçeveye birkaç damla gümüş nanopartikül DSNB çözeltisi ekleyin. Kapak kaymasını çerçeve bandına yerleştirin ve kapatın.
Sıcaklık eksi 120 santigrat dereceye ulaşana kadar sıvı-azot soğutmalı şarj bağlantılı cihaz kamerasının kabına sıvı azot ekleyin. Manyetik lazer güvenlik ekranı kullanarak Raman probu ışın yolunu engelleyin, ardından 532 nanometre Raman uyarma kaynağı lazerini açın. Numune haznesini, hazne tutucusundaki gümüş nanopartikül DSNB çözeltisi ile sabitleyin.
Suya batırılmış hedefe su ekleyin, ardından hazne tutucuyu hemen hedefin üzerindeki mikro aşamaya yerleştirin. Daldırma yağını kapak kaymasının üzerine bırakın ve mikroskop kamerasındaki parçacıkları görselleştirmek için yağa batırılmış kondenseri konumlandırın. 532 nanometre Raman prob ışını odanın alt cam yüzeyine odaklanana ve mikroskop kamerasında beyaz bir nokta gösterene kadar mikroskop topuzunu çevirerek hedefin Z konumunu ayarlayın.
Odayı hareket ettirmek için mikro aşamanın X ve Y konumlarını ayarlayın ve odanın merkezi bölgesini beyaz noktaya yerleştirin. Optik cımbız kontrol yazılımını açın ve 1.064 nanometre yakalama lazerini beyaz nokta ile üst üste binecek şekilde hareket ettirmek için donanımlı joystick kontrolünü kullanın. Ardından, hedefin Z konumunu yukarı taşımak için mikroskopun düğmesini ayarlayın.
Örnek odasındaki gümüş nanopartikülleri çekmek ve plazmonik gümüş nanopartikül tertibatı oluşturmak için 1.064 nanometre yakalama lazerini açın. Gerektiğinde aşırı ısınmayı veya kabarcık oluşumunu önlemek için tutucu lazer ışınını aşağı çevirin. Plazmonik gümüş nanopartikül düzeneğinin karanlık noktasını spektroskopik ölçümler için 532 nanometre Raman prob ışınının odağının altına yerleştirmek için numune mikro aşamasının konumunu ayarlayın.
Gücü 10 megawatt'a ayarlamak için nötr yoğunluk filtrelerini 532 nanometre Raman lazer prizinin önüne yerleştirin. Spektrum yazılımındaki ayar paneline alma süresini girin ve spektral alımı başlatmak için Al düğmesine tıklayın. Yakalama lazeri olmadan, numune odasındaki dağınık gümüş nanopartiküller siyah bir spektrum oluşturdu.
Gücü arttırmak ve yakalama lazerinin ışınlama süresini uzatmak, daha fazla gümüş nanopartikül çekebilir ve karanlık bir nokta oluşturabilir. Dağılmış gümüş nanopartiküller Brownian hareketi altında olduğundan, parçacıklar arası bağlantılar büyük ve kararsızdı. Plazmonik gümüş nanopartikül düzeneğindeki DSNB'nin genel yoğunluğu, dağılmış gümüş nanopartikülünkinden daha yüksekti.
1.444 santimetre tersteki karakteristik zirvenin yoğunluğu göz önüne alındığında, plazmonik gümüş nanopartikül düzeneği, DSNB'nin yüzeyle güçlendirilmiş Raman spektroskopi sinyalinin dağınık gümüş nanopartiküllerinkine kıyasla yaklaşık 50 kat daha fazla iyileştirilmesini sağlayabilir. DSNB'nin karakteristik zirvelerinin bu 20 yüzey ile güçlendirilmiş Raman spektrumu boyunca 1, 152, 1, 444 ve 1.579 santimetre tersteki yoğunlukları, sırasıyla 6.88, 6.59 ve% 5.48'lik göreceli standart sapmalara sahip histogramlar olarak çizildi. Bu prosedürdeki en önemli şey, 532 nanometre Raman probu lazerinin konumunu bulmak ve 1.064 nanometre yakalama lazeri ile üst üste bindirmektir.
Bu teknik, araştırmacıların gelecekteki in vivo analizler için fizyolojik koşullar altında mekansal ve zamansal kontrol ile analit moleküllerini tespit etmelerinin yolunu açmaktadır.
Genel Bakış
Bu protokol, hassas moleküler tespit için plazmonik nanoparçacıkları manipüle etmek amacıyla optik tuzaklamanın yüzeyde güçlendirilmiş Raman spektroskopisi (SERS) ile entegre edilmesine yönelik bir yöntemi tanımlamaktadır. Bu yaklaşım, çöktürücü ajanlar kullanmadan in situ spektroskopik ölçümlere olanak tanıyarak hedef analitlerin SERS sinyallerini güçlendirir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Biyofizik
- Analitik Kimya
Arkaplan
- Optik tutma ve SERS, moleküler tespit için güçlü tekniklerdir.
- Geleneksel yöntemler genellikle, hassas biyomolekül analizlerini etkileyebilecek agregasyon ajanları gerektirir.
- Bu çalışma, bu tür ajanlara olan ihtiyacı ortadan kaldıran yeni bir yaklaşım sunmaktadır.
- Yöntem, fizyolojik koşullar için uygundur ve bu sayede biyobelirteç tespitinde uygulanabilir hale gelir.
Çalışmanın Amacı
- Agregasyon ajanları kullanmadan SERS-aktif nanoparçacıklar sentezlemek için bir protokol geliştirmek.
- Fizyolojik ortamlarda moleküler tespit hassasiyetini artırmak.
- Biyomoleküllerin gelecekteki in vivo analizleri için bir platform sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Nanoparçacık manipülasyonu için optik tuzaklamanın SERS ile entegrasyonu.
- Uyarılma için 532-nanometre bir lazerin ve tuzaklama için 1,064-nanometre bir lazerin kullanımı.
- Optimal nanoparçacık toplama için lazer gücü ve ışınlama süresinin ayarlanması.
- Sıvı azotla soğutulmuş bir CCD kamera kullanılarak spektral veri toplama.
Temel Sonuçlar
- Plazmonik gümüş nanoparçacık düzeneği, dağılmış nanoparçacıklara kıyasla SERS sinyalinde 50 kat artış göstermiştir.
- Analitlerin karakteristik pikleri tutarlı bir şekilde yüksek yoğunlukta tespit edilmiştir.
- Piklerin göreceli standart sapmaları düşük çıkmış olup, bu durum ölçümlerin güvenilir olduğunu göstermektedir.
- Bu yöntem, nanoparçacık düzeneğinin mekansal ve zamansal yönlerinin hassas bir şekilde kontrol edilmesine olanak tanır.
Sonuçlar
- Bu teknik, biyomoleküllerin fizyolojik koşullar altında tespit edilmesinde önemli bir ilerleme sağlamaktadır.
- Agregasyon ajanlarının bulunmaması, sonuçların güvenilirliğini artırmaktadır.
- Gelecekteki uygulamalar, hastalık biyobelirteçlerinin in vivo analizlerini içerebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Endüstriyel Uygulama ve Alaka
Optik tuzaklama entegreli SERS platformları, kimyasal agregasyon ajanları olmadan fizyolojik olarak ilgili ortamlarda tekrarlanabilir ve ultra hassas moleküler tespit için kritik bir ihtiyacı karşılamaktadır. Bu yetenek, erken evre biyobelirteç keşfinde öngörü güvenini artırır ve hastalıkla ilgili sistem sorgulamaları için sağlam analitik iş akışlarını destekler. Yöntemin nanoparçacık düzenlemesi üzerindekile mekansal ve zamansal kontrolü, translasyonel araştırma süreçleri için temel olan güvenilir ve düşük perturbasyonlu analizlere olanak tanır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Biyomoleküler hedeflerin fizyolojik koşullar altında çözelti içerisinde doğrudan sorgulanmasını sağlar.
- Moleküler tespitte agregasyon ajanı girişimini ortadan kaldırarak mekanistik belirsizliği azaltır.
- Tekrarlanabilir, kantitatif SERS sinyal artışı aracılığıyla fonksiyonel hedef doğrulamasını destekler.
- Erken biyobelirteç tanımlama ve triyajda öngörü güvenilirliğini kolaylaştırır.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Mikroakışkan veya sulu sistemlerde SERS-aktif düzeneklerin hazırlanması için standardize edilmiş, agregasyon içermeyen bir platform sağlar.
- Ölçümler genelinde düşük bağıl standart sapma ile yüksek tekrarlanabilirlik ve kantitatif sonuçlar sunar.
- Hassas bileşik veya biyobelirteç taraması için ölçeklenebilir assay geliştirilmesine olanak tanır.
- Sub-nanomolar konsantrasyonlardaki analit moleküllerinin güvenilir şekilde değerlendirilmesini destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Fizyolojik ortamlarda in situ saptamaya olanak tanıyarak hastalıkla ilgili sistem analizleriyle uyum sağlar.
- Örnek pertürbasyonunu minimize ederek keşif aşamasından preklinik doğrulamaya kadar translasyonel sürekliliği korur.
- Güçlü ve tekrarlanabilir moleküler karakterizasyon verileri sağlayarak ilerleme kararlarındaki riskleri azaltır.
- Gelecekteki in vivo biyobelirteç analiz iş akışlarını destekler.
Hatt ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu optik hapsetme-SERS yöntemi; hipotez testlerini, hedef doğrulamayı ve translasyonel biyobelirteç iş akışlarını destekleyerek, keşiften preklinik aşamaya kadar olan sürece entegre olur.
- Keşif Biyolojisi: Doğal benzeri ortamlarda, hipotez odaklı analit tespitini ve yolak aydınlatmasını kolaylaştırır.
- Tarama: Analiz hazırlığı ve bileşik değerlendirmesi için tekrarlanabilir, kantitatif SERS çıktıları sunar.
- Analitik: Koşullar arası karşılaştırmalar için sağlam spektral ölçümler ve istatistiksel çıktılar sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Minimum perturbasyon ile preklinik modellere biyobelirteç uyumunu ve sürekliliğini sağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Çeşitli moleküler tespit ihtiyaçları için yeniden kullanılabilir, agregasyon içermeyen analitik bir yetenek sunar.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Agregasyon artefaktları olmaksızın hassas ve tekrarlanabilir deteksiyona olanak sağlayarak öngörü güvenini ve hedef doğrulamasını artırır.
- Operasyonel Değer: Ölçeklenebilir ve tekrarlanabilir iş akışları için SERS-aktif düzenek oluşumunu ve ölçümünü standardize eder.
- Stratejik Değer: Geç aşama analitik risklerini azaltarak karar verme kalitesini ve sermaye verimliliğini artırır.
- Portföy Etkisi: Biyobelirteç ve hedef programlarının riske göre ayarlanmış önceliklendirmesini ve ilerletilmesini destekler.
Uygulama Hususları
- Optik tuzaklama, SERS enstrümantasyonu ve spektral analiz konularında uzmanlık gerektirir.
- Çift lazerli optik cımbız mikroskoplarına ve sıvı azot soğutmalı CCD spektrometrelerine erişim gereklidir.
- Lazer hizalaması, gücü ve veri toplama parametrelerinin ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Çeşitli analit kaplı nanoparçacık sistemlerine ve mikroakışkan platformlara uyarlanabilir.
- Performans, protokol tarafından desteklenen hassas uzamsal örtüşmeye ve çevresel kontrole bağlı olabilir.
