Fetal Doku Kaynaklı Enteroidlerde Epitel Geçirgenliğinin Test Edilmesi
16 Haziran 2022
Bu protokol, fetal bağırsak dokusundan üç boyutlu bir bağırsak modeli olan enteroidlerin kurulmasını detaylandırır. Model karakterizasyonunda epitel biyobelirteçlerinin immünofloresan görüntülemesi kullanıldı. Bakteriyel bir endotoksin olan lipopolisakkaritlerin apikal maruziyeti, mikroenjeksiyon tekniği kullanılarak, floresan dekstranın sızıntısı ile ölçülen doza bağımlı bir şekilde epitel geçirgenliğine neden olmuştur.
Bu protokolün önemi, prematüre epitelin in vitro modelinde enteroidlerin brüt olasılığını test etmektir. Bu tekniğin temel avantajı, bağırsak luminal ortamını taklit eden kapalı bir lümenden geçirgenliği ölçmektir. Bu protokol, sızdıran bağırsak hastalığını indükleyen veya zayıflatan faktörleri incelemek için kullanılabilir.
Vasküler sızıntıyı indükleyebilecek koşulları incelemek için endotel veya vasküler sistemlere de uygulanabilir. Bu protokol biraz pratik gerektirir. Tüm prosedürü bir araya getirmeden önce her bölümü ayrı ayrı uygulamanızı öneririz.
Başlamak için, bağırsak segmentlerini buz gibi soğuk Dulbecco'nun amfoterasinli PBS'si ile 60 x 15 milimetre karelik bir Petri kabına aktarın ve buz üzerinde 20 dakika bekletin. Bir çift makaslı bir neşter kullanarak, bağırsak segmentlerini üç ila beş milimetre parçaya bölün ve buz üzerinde 0,5 ila bir mililitre organoid büyüme ortamı içeren 35 x 15 milimetrelik bir Petri kabına bir ila iki parça yerleştirin. Diseksiyon mikro makas ve forseps kullanarak bağırsak tüpünü uzunlamasına kesin.
Daha sonra epitel hücrelerini fasyadan kazımak için forsepsleri kullanın. Fasyayı çıkarın ve hücre kümelerini kırmak için çanağı döndürün. Daha sonra, 20 mikrolitrelik bir pipet kesme ucu kullanarak, hücreleri ve ortamı beş ila 10 mikrolitrelik bir artışla, 285 mikrolitrelik bir çözelti oluşturmak için bir bazal membran matris karışımına aktarın.
200 mikrolitrelik bir kesme ucu kullanarak buz üzerindeki bir bazal membran matrisinde pipetleme yaparak hücreleri karıştırın. Karıştırdıktan sonra, hücre bazal membran matris karışımının beş adet 50 mikrolitrelik şeridini, ılık bir köpük tuğla üzerinde tutulan önceden ısıtılmış altı delikli bir plakanın bir kuyucuğuna yerleştirin. Polimerizasyona ve bazal membran matrisinin sertleşmesine izin vermek için plakayı 10 dakika boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.
Matris şeritleri katılaştıktan sonra, plakayı inkübatöre geri koymadan önce kuyuya iki mililitre enteroid büyüme ortamı ekleyin. Enteroidleri altı kuyucuklu veya 12 delikli bir plakanın kuyusuna aktardıktan sonra, her alternatif gün, eski medyayı taze ortamla değiştirin. Enteroidler gelişmeye başladığında, hücreleri her beş ila yedi günde bir geçirin.
İmmünofloresan boyama için, enteroidlerin her bir kuyucuğuna tampon bloke etmek için 500 mikrolitre birincil antikor ekleyin ve gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, antikor çözeltisini çıkarın ve enteroidleri PBS ile üç kez yıkayın. Bir ila 400 seyreltilmiş ikincil antikor çözeltisinde inkübasyondan sonra, ardından DAPI'de inkübasyondan sonra, enteroidleri PBS ile üç kez yıkayın.
Enteroidlerin üç boyutlu yapılarını korumak için, alt cam slayt ile kapak kayması arasında 0,5 ila bir milimetre boşluk oluşturmak için ince silikon kauçuk levha veya cam kapak kaymaları kesikleri kullanın. Montaj için, lekeli enteroidleri% 70 gliserol ile yıkayın. Daha sonra, bir mikrolitrelik bir aşılama döngüsü veya kesilmiş 200 mikrolitrelik bir uç kullanarak, enteroidleri plakadan çıkarın ve gliserol ile bir cam mikroskop slaydına monte edin.
Şeffaf bir film kapağı ile kaplı bir Petri kabı hazırlayın ve filme iki ila dört adet bir mikrolitrelik Dextran-FITC damlası ekleyin. Mikro manipülatörü kullanarak, mikro pipet ucunu sıvının içine ve filmin üzerine stereo mikroskop altında sürün, ardından Dextran-FITC'yi mikro pipete çekmek için şırıngayı yavaşça çekin. Mikro pipeti iki ila dört mikrolitre Dextran-FITC ile doldurduktan sonra, pipet ucundaki havayı gidermek için şırıngayı itin.
Ayrıca, hava cebinin olmadığından emin olmak için mikro pipetteki enjekte edilen malzeme sütununu kontrol edin ve mikro pipetin içindeki Dextran-FITC hacmini kaydedin. Ardından, pompayı açmadan ve pompa süresini 10 ila 15 milisaniyeye ayarlamadan önce pnömatik pompaya bağlı hava kaynağını açın. Ardından, pompadan mikro pipete giden hattı açmak için şırıngadaki musluğu çevirin.
Enteroidleri inkübatörden çıkarın ve mikro enjeksiyondan sonra ışığa maruz kalmayı en aza indirmek için tabağı kapalı bir kapta ılık bir köpük tuğla üzerine yerleştirin. Petri kabını enteroidlerle stereo mikroskobun altına yerleştirin ve mikro pipet ucunu yatay yüzeye 35 ila 45 derecelik bir açıyla yerleştirmek için mikro manipülatör düğmelerini hareket ettirin. Küresel enteroidleri, çanak başına üç ila beş enteroid enjekte etme hedefiyle görselleştirin ve tanımlayın.
Ardından, mikroskop göz parçalarına bakarak ucu bir hedef enteroide ilerletin. Ardından, Z ekseni düğmesini hassas bir yavaş hareketle ilerleterek, enteroidi mikro pipet ucuyla delin. Uç, enteroid yüzeyden geçtikten sonra ilerleme durmalıdır, bu da bastırır ve geri patlar.
Bir ayağınızla pompa pedalına dokunun ve enteroidi genişleyene kadar yeşilimsi Dextran-FITC çözeltisiyle doldurun. Pompalanan hacmi ve Dextran konsantrasyonunu hesaplamak için pompa sayısını kaydedin. Bu protokol, intestinal epitele özgü çeşitli biyobelirteçlerin immünofloresan antikorlarla boyanarak ince bağırsak epitel orijinallerini doğrulayarak fetal doku kaynaklı enteroidlerin karakterizasyonunu göstermiştir.
Farklı aşamalardaki enteroidler burada gösterilmiştir. Yedi ila 10 günlük bir enteroid küçük ve kalındır. Oysa mikroenjeksiyona hazır bir enteroid, lümen ve ince bir duvarla büyüktü.
Mikroenjeksiyondan iki gün sonra enteroid hala önemli miktarda Dextran-FITC içerir. Mikroenjeksiyon sonrası enteroidlerin geçirgenliği, ortamdaki Dextran konsantrasyonu ölçülerek değerlendirildi. Dar kavşaklarda membran geçirgenliğini arttırdığı bilinen EGTA, pozitif kontrol olarak kullanılmıştır.
Dextran ölçüm testi ayrıca LPS'nin artan geçirgenliği indüklediğini ve daha yüksek LPS konsantrasyonunun daha yüksek geçirgenliğe neden olduğunu göstermektedir. Sabitleme ve boyama ile ilgili en önemli şey, enteroidlerin şeklini bozmamak veya işlem sırasında onları kaybetmemektir. Mikro-enjeksiyonu takiben, sitokin testi için ortam toplanabilir ve RNA dizilimi için enteroidler toplanabilir.
Genel Bakış
Bu protokol, fetal bağırsak dokusundan enteroidlerin kurulmasını ve bağırsak geçirgenliğini incelemek için üç boyutlu bir model sağlamayı özetlemektedir. Yöntem, modeli karakterize etmek ve lipopolisakkaritlere tepki olarak epitelyal geçirgenliği değerlendirmek için immünofloresan görüntülemeyi içerir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Hücre Biyolojisi
- Gastroenteroloji
Arka Plan
- Enteroidler, bağırsak epitelyal fonksiyonunu incelemek için bir model olarak hizmet eder.
- Bu model, bağırsak lümen ortamını taklit eder ve geçirgenlik çalışmalarına olanak tanır.
- Sızıntılı bağırsak hastalığının anlaşılması, gastrointestinal sağlık için kritik öneme sahiptir.
- Protokol ayrıca vasküler çalışmalar için de uyarlanabilir.
Çalışmanın Amacı
- Bağırsak epiteliyumunun güvenilir bir in vitro modelini kurmak.
- Epitelyal geçirgenliği etkileyen faktörleri araştırmak.
- Vasküler sızıntıya yol açan koşullar hakkında bilgiler sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Fetal bağırsak dokusunun hazırlanması ve enteroid kültürü.
- Epitelyal biyobelirteçler için immünofloresan boyama.
- Geçirgenliği değerlendirmek için Deksan-FITC'nin mikroenjeksiyonu.
- Geçirgenlik değişikliklerini değerlendirmek için Deksan konsantrasyonunun ölçülmesi.
Ana Sonuçlar
- Enteroidlerin karakterizasyonu, epitelyal kökenlerini doğruladı.
- Mikroenjeksiyon, geçirgenlik değişikliklerini başarılı bir şekilde indükled.
- LPS maruziyeti, doza bağlı bir şekilde geçirgenliği artırdı.
- EGTA, geçirgenlik değerlendirmesi için pozitif kontrol olarak kullanıldı.
Sonuçlar
- Enteroid modeli, bağırsak geçirgenliğini incelemek için etkilidir.
- Bu protokol, sızıntılı bağırsak mekanizmalarını anlamaya yardımcı olabilir.
- Gelecekteki uygulamalar, vasküler geçirgenlik çalışmalarına kadar genişletilebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Human fetal tissue-derived enteroids provide a physiologically relevant in vitro system for interrogating epithelial barrier function and permeability mechanisms in preterm intestinal injury. This model enables quantitative assessment of tight junction integrity and response to pathogenic stimuli, supporting predictive confidence in early-stage target validation and mechanistic de-risking. The approach addresses a critical gap where direct human studies are not feasible, informing risk-adjusted portfolio decisions in gastrointestinal and neonatal research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables mechanistic interrogation of epithelial barrier disruption by quantifying permeability changes in response to defined stimuli.
- Supports functional validation of tight junction protein targets implicated in leaky gut and mucosal injury.
- Facilitates biological de-risking by modeling disease-relevant epithelial responses to bacterial endotoxins.
- Provides a platform for hypothesis-driven evaluation of candidate modulators of barrier integrity.
Screening & Assay Development
- Establishes a reproducible, three-dimensional enteroid system for standardized permeability assays.
- Delivers quantitative, scalable readouts via dextran leakage measurements for compound screening.
- Enables assay standardization and cross-study comparability through immunofluorescent characterization of tight junctions.
- Prepares validated biological systems for downstream screening of permeability modulators.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant mechanisms by modeling preterm intestinal injury and dysbiosis-driven barrier dysfunction.
- Supports translational continuity by enabling cytokine profiling and RNA sequencing from the same enteroid samples.
- Informs preclinical risk assessment by quantifying dose-dependent effects of pathogenic exposures.
- Provides predictive de-risking for therapeutic strategies targeting epithelial integrity.
Pipeline & Workflow Integration
This enteroid-based permeability assay integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging early mechanistic studies with translational biomarker development in gastrointestinal research.
- Discovery Biology: Quantifies tight junction function and barrier disruption in response to defined bacterial and chemical stimuli.
- Screening: Provides a robust, quantitative platform for evaluating permeability-modulating compounds.
- Analytics: Enables serial measurement of dextran leakage and supports downstream cytokine and transcriptomic analyses.
- Translational Research: Models disease-relevant epithelial responses, supporting biomarker alignment and preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, adaptable system for diverse barrier function studies across R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and mechanistic understanding of epithelial barrier dysfunction.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable permeability assays for cross-functional teams.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in gastrointestinal portfolios.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of barrier-targeted therapeutics and translational research investments.
Implementation Considerations
- Requires expertise in enteroid culture, microinjection, and immunofluorescent imaging.
- Demands access to specialized instrumentation for microinjection and quantitative fluorescence measurement.
- Necessitates cross-team standardization of assay protocols and data analysis workflows.
- Adaptation to other epithelial or vascular systems may require protocol optimization.
- Careful handling is essential to preserve enteroid structure and ensure assay fidelity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:53
Intestinal Epithelial Cell Plating in Basement Membrane Matrix from Whole Specimens
2:54
Immunofluorescent Staining of the Enteroids
3:57
Preparation for Microinjection of Enteroids
6:13
Results: Visualization of Stained Enteroids
7:19
Conclusion
