Name: Primer Rhesus Macaque B Hücrelerinin Gen Düzenlemesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T12:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Keşfedin, primer rhesus makak B hücrelerinde CRISPR/Cas9 ve rAAV6 kullanarak gen düzenleme yöntemini. Bu teknik, B hücre terapileri için preklinik araştırmalarda yüksek verimlilik sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

RC1 antijenini sağladıkları için Harry B. Gristick ve Pamela Bjorkman'a ve eleştirel tartışmalar için tüm Nussenzweig ve Martin laboratuvarlarına teşekkür ederiz. Bu çalışma, Bill ve Melinda Gates Vakfı hibesi INV-002777 (M.C.N.'ye) ve Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri Intramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir. (R.G. ve M.A.M). M.C.N. bir HHMI Araştırmacısıdır.

<ol><li>Victora, G. D., Nussenzweig, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germinal+centers%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Germinal centers.</a> Annual Review of Immunology. 40, 413-442 (2022).</li>
<li>Plotkin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlates+of+protection+induced+by+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Vaccine+Immunology%22%5BJournal%5D)">Correlates of protection induced by vaccination.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 17 (7), 1055-1065 (2010).</li>
<li>Brinkmann, V., Heusser, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell-dependent+differentiation+of+human+B+cells+into+IgM%2C+IgG%2C+IgA%2C+or+IgE+plasma+cells%3A+High+rate+of+antibody+production+by+IgE+plasma+cells%2C+but+limited+clonal+expansion+of+IgE+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Immunology%22%5BJournal%5D)">T cell-dependent differentiation of human B cells into IgM, IgG, IgA, or IgE plasma cells: High rate of antibody production by IgE plasma cells, but limited clonal expansion of IgE precursors.</a> Cellular Immunology. 152 (2), 323-332 (1993).</li>
<li>Chernecky, C. C., Berger, B. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChernecky%2C+CC+%22Protein+Electrophoresis+-+Serum.%2C+6th+edition%22">Protein Electrophoresis - Serum., 6th edition</a>. , Elsevier Saunders. St Louis, MO. 917-920 (2013).</li>
<li>Balazs, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-based+protection+against+HIV+infection+by+vectored+immunoprophylaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Antibody-based protection against HIV infection by vectored immunoprophylaxis.</a> Nature. 481 (7379), 81-84 (2011).</li>
<li>Greiner, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-mediated+editing+of+the+B+cell+receptor+in+primary+human+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">CRISPR-mediated editing of the B cell receptor in primary human B cells.</a> iScience. 12, 369-378 (2019).</li>
<li>Hartweger, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-specific+humoral+immune+responses+by+CRISPR%2FCas9-edited+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">HIV-specific humoral immune responses by CRISPR/Cas9-edited B cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 216 (6), 1301-1310 (2019).</li>
<li>Huang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccine+elicitation+of+HIV+broadly+neutralizing+antibodies+from+engineered+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Vaccine elicitation of HIV broadly neutralizing antibodies from engineered B cells.</a> Nature Communications. 11, 5850(2020).</li>
<li>Jeske, A. M., Boucher, P., Curiel, D. T., Voss, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector+strategies+to+actualize+B+cell-based+gene+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Vector strategies to actualize B cell-based gene therapies.</a> Journal of Immunology. 207 (3), 755-764 (2021).</li>
<li>Nahmad, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+engineered+B+cells+secrete+high+titers+of+broadly+neutralizing+anti-HIV+antibodies+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">In vivo engineered B cells secrete high titers of broadly neutralizing anti-HIV antibodies in mice.</a> Nature Biotechnology. 40 (8), 1241-1249 (2022).</li>
<li>Nahmad, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+B+cells+expressing+an+anti-HIV+antibody+enable+memory+retention%2C+isotype+switching+and+clonal+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Engineered B cells expressing an anti-HIV antibody enable memory retention, isotype switching and clonal expansion.</a> Nature Communications. 11, 5851(2020).</li>
<li>Voss, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+the+antigen+specificity+of+B+cells+using+genome-editing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Reprogramming the antigen specificity of B cells using genome-editing technologies.</a> eLife. 8, 42995(2019).</li>
<li>Pesch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+design%2C+optimization%2C+and+genomic+integration+of+chimeric+B+cell+receptors+in+murine+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Molecular design, optimization, and genomic integration of chimeric B cell receptors in murine B cells.</a> Frontiers in Immunology. 10, 2630(2019).</li>
<li>Cheong, T. C., Compagno, M., Chiarle, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Editing+of+mouse+and+human+immunoglobulin+genes+by+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Editing of mouse and human immunoglobulin genes by CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Communications. 7, 10934(2016).</li>
<li>Rogers, G. L., Cannon, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+edited+B+cells%3A+A+new+frontier+in+immune+cell+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Genome edited B cells: A new frontier in immune cell therapies.</a> Molecular Therapy. 29 (11), 3192-3204 (2021).</li>
<li>Hung, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+protein-secreting+plasma+cells+by+homology-directed+repair+in+primary+human+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Engineering protein-secreting plasma cells by homology-directed repair in primary human B cells.</a> Molecular Therapy. 26 (2), 456-467 (2018).</li>
<li>Johnson, M. J., Laoharawee, K., Lahr, W. S., Webber, B. R., Moriarity, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+primary+human+B+cells+with+CRISPR%2FCas9+targeted+nuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Engineering of primary human B cells with CRISPR/Cas9 targeted nuclease.</a> Scientific Reports. 8, 12144(2018).</li>
<li>Wu, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+in+primary+human+B+cells+with+CRISPR-Cas9+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering in primary human B cells with CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins.</a> Journal of Immunological Methods. 457, 33-40 (2018).</li>
<li>Luo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+alpha-PD-1+antibody-expressing+long-lived+plasma+cells+by+CRISPR%2FCas9-mediated+targeted+gene+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Engineering of alpha-PD-1 antibody-expressing long-lived plasma cells by CRISPR/Cas9-mediated targeted gene integration.</a> Cell Death and Disease. 11 (11), 973(2020).</li>
<li>Laoharawee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+of+primary+human+B+cells+using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Genome engineering of primary human B cells using CRISPR/Cas9.</a> Journal of Visualized Experiments. (165), e61855(2020).</li>
<li>Laoharawee, K., Johnson, M. J., Moriarity, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+genome+engineering+of+primary+human+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated genome engineering of primary human B cells.</a> Methods in Molecular Biology. 2115, 435-444 (2020).</li>
<li>Moffett, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cells+engineered+to+express+pathogen-specific+antibodies+protect+against+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Immunology%22%5BJournal%5D)">B cells engineered to express pathogen-specific antibodies protect against infection.</a> Science Immunology. 4 (35), (2019).</li>
<li>Hartweger, H., Nussenzweig, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+comes+a-knock-in+to+reprogram+antibodies+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">CRISPR comes a-knock-in to reprogram antibodies in vivo.</a> Nature Biotechnology. 40 (8), 1183-1184 (2022).</li>
<li>Nishimura, Y., Martin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+mice%2C+macaques%2C+and+men%3A+Broadly+neutralizing+antibody+immunotherapy+for+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Of mice, macaques, and men: Broadly neutralizing antibody immunotherapy for HIV-1.</a> Cell Host & Microbe. 22 (2), 207-216 (2017).</li>
<li>Shedlock, D. J., Silvestri, G., Weiner, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monkeying+around+with+HIV+vaccines%3A+Using+rhesus+macaques+to+define+%27gatekeepers%27+for+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Monkeying around with HIV vaccines: Using rhesus macaques to define 'gatekeepers' for clinical trials.</a> Nature Reviews Immunology. 9 (10), 717-728 (2009).</li>
<li>Kreuser, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+methods+for+generation+and+expansion+of%2C+and+gene+delivery+to+rhesus+macaque+plasma+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Efficient methods for generation and expansion of, and gene delivery to rhesus macaque plasma B cells.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Gujer, C., Sundling, C., Seder, R. A., Karlsson Hedestam, G. B., Lore, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+and+rhesus+plasmacytoid+dendritic+cell+and+B-cell+responses+to+Toll-like+receptor+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Human and rhesus plasmacytoid dendritic cell and B-cell responses to Toll-like receptor stimulation.</a> Immunology. 134 (3), 257-269 (2011).</li>
<li>Kim, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+enrichment-free+massive+ex-vivo+expansion+of+peripheral+CD20%28%2B%29+B+cells+via+CD40-CD40L+signals+in+non-human+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Cell enrichment-free massive ex-vivo expansion of peripheral CD20(+) B cells via CD40-CD40L signals in non-human primates.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 473 (1), 92-98 (2016).</li>
<li>Su, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-attenuating+adenovirus+enables+production+of+recombinant+adeno-associated+virus+for+high+manufacturing+yield+without+contamination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Self-attenuating adenovirus enables production of recombinant adeno-associated virus for high manufacturing yield without contamination.</a> Nature Communications. 13, 1182(2022).</li>
<li>Endo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-+and+long-term+clinical+outcomes+in+rhesus+monkeys+inoculated+with+a+highly+pathogenic+chimeric+simian%2Fhuman+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Short- and long-term clinical outcomes in rhesus monkeys inoculated with a highly pathogenic chimeric simian/human immunodeficiency virus.</a> Journal of Virology. 74 (15), 6935-6945 (2000).</li>
<li>Balaphas, A., Buchs, N. C., Meyer, J., Hagen, M. E., Morel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+splenectomy+in+the+era+of+minimally+invasive+surgery%3A+The+current+laparoscopic+and+robotic+experiences%5BTitle%5D)+AND+%22Surgical+Endoscopy%22%5BJournal%5D)">Partial splenectomy in the era of minimally invasive surgery: The current laparoscopic and robotic experiences.</a> Surgical Endoscopy. 29 (12), 3618-3627 (2015).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Labun, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CHOPCHOP+v3%3A+Expanding+the+CRISPR+web+toolbox+beyond+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">CHOPCHOP v3: Expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing.</a> Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).</li>
<li>Strobel, B., Miller, F. D., Rist, W., Lamla, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+cesium+chloride-+and+iodixanol-based+purification+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors+for+preclinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of cesium chloride- and iodixanol-based purification of recombinant adeno-associated viral vectors for preclinical applications.</a> Human Gene Therapy Methods. 26 (4), 147-157 (2015).</li>
<li>Guo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+simplified+purification+of+recombinant+adeno-associated+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid and simplified purification of recombinant adeno-associated virus.</a> Journal of Virological Methods. 183 (2), 139-146 (2012).</li>
<li>Vandenberghe, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+serotype-dependent+release+of+functional+vector+into+the+culture+medium+during+adeno-associated+virus+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing.</a> Human Gene Therapy. 21 (10), 1251-1257 (2010).</li>
<li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42 (22), 168(2014).</li>
<li>Conant, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inference+of+CRISPR+edits+from+Sanger+trace+data%5BTitle%5D)+AND+%22The+CRISPR+Journal%22%5BJournal%5D)">Inference of CRISPR edits from Sanger trace data.</a> The CRISPR Journal. 5 (1), 123-130 (2022).</li>
<li>Wilkinson, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9-AAV6+gene+correction+of+beta-globin+in+autologous+HSCs+improves+sickle+cell+disease+erythropoiesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice.</a> Nature Communications. 12, 686(2021).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+broadly+neutralizing+macaque+monoclonal+antibody+against+the+HIV-1+V3-Glycan+patch%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A broadly neutralizing macaque monoclonal antibody against the HIV-1 V3-Glycan patch.</a> eLife. 9, 61991(2020).</li>
<li>Escolano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunization+expands+B+cells+specific+to+HIV-1+V3+glycan+in+mice+and+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Immunization expands B cells specific to HIV-1 V3 glycan in mice and macaques.</a> Nature. 570 (7762), 468-473 (2019).</li>
<li>Pathiraja, V., Matar, A. J., Gusha, A., Huang, C. A., Duran-Struuck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukapheresis+protocol+for+nonhuman+primates+weighing+less+than+10+kg%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Leukapheresis protocol for nonhuman primates weighing less than 10 kg.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 52 (1), 70-77 (2013).</li>
<li>Stratigopoulos, G., De Rosa, M. C., LeDuc, C. A., Leibel, R. L., Doege, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DMSO+increases+efficiency+of+genome+editing+at+two+non-coding+loci%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">DMSO increases efficiency of genome editing at two non-coding loci.</a> PLoS One. 13 (6), 0198637(2018).</li>
</ol>

Hiçbir rakip çıkar beyan edilmez.

Burada sunulan protokoller, HDRT'ler olarak rAAV6'ların yüksek verimini ve titrelerini üretmek için hızlı ve verimli bir yöntem ve in vitro olarak primer rhesus makak B hücrelerini verimli bir şekilde gen düzenlemek için yeni yöntemler sağlar.
rAAV6 üretim protokolü nispeten basit ve hızlıdır ve aşırı emek harcamadan aynı anda birçok farklı yapının üretilmesine ve test edilmesine olanak tanır. İstenirse, rAAV6, tampon değişimi ve konsantrasyonundan önce iyodiksanol gradyanı ultrasantrifüjleme34 veya sulu iki fazlı bölümleme35 gibi yerleşik protokoller kullanılarak daha da saflaştırılabilir.
Genel verimi azaltmasına rağmen, rAAV6'nın çoğunluğu ortam 36'ya salındığından ve hücre peletinden saflaştırma daha fazla maliyet ve işçilik eklediğinden, rAAV6 saflaştırması için sadece serumla indirgenmiş hücre kültürü ortamını kullanmayı tercih ettik. Kendiliğinden inaktive olan adenoviral yardımcının kullanımı, verimi ortalama 30-40 kat artırdı ve AAV6'ya paketlenmiş yapıların tek bir 15 cm'lik tabakta test edilmesine izin verdi. Saflaştırma yöntemimiz temel olmasına rağmen, bu yöntemi kullanarak, çeşitli hücre hatları veya diğer birincil hücreler kullanılarak transdüksiyondan sonra gen düzenleme verimliliğinde veya hücre canlılığında nispeten az partiden partiye varyasyon elde ediyoruz (veriler gösterilmemiştir).
İstenmeyen popülasyonların negatif tükenmesini kullanarak el değmemiş birincil B hücrelerini elde etmek için bir rhesus makak B hücre saflaştırma protokolü geliştirdik. Bu hücrelerin gen düzenlemesi için gerekli olmasa da, diğer hücre tiplerinin deneysel hedeflere müdahale etmesi durumunda, bu veya diğer uygulamalar için nispeten saf bir primer rhesus makak B hücresi popülasyonu elde etmenin bir yolunu sağlar. Bununla birlikte, saflık, genel B hücresi veriminin azalması pahasına gelir. Özellikle, hem zenginleştirilmiş hem de zenginleştirilmemiş B hücre kültürleri için, ilk PBMC veya splenosit preparatlarındaki B hücrelerinin fraksiyonu çok önemlidir. Özellikle PBMC'ler için, deneyler için yüksek sayıda B hücresi elde etmek için periferik kanda yüksek oranda B hücresi bulunan bireyler için farklı makakların taranmasını öneririz, çünkü bu değer bireyler arasında önemli ölçüde farklılık gösterebilir27. PBMC'ler düzenli kanama veya lökoferez42 ile elde edilebilir.
Gen düzenleme protokolü, tipik olarak nakavtın %60-80'i ve nakavt B hücrelerinin %5-20'si arasında etkili gen düzenlemesine yol açar, ancak %90'a kadar BCR nakavt ve %40 BCR knock-in B hücrelerine ulaştık (Şekil 5 ve Şekil 6).
Rhesus makak B hücrelerinin verimli bir şekilde düzenlenmesi için ana parametreler, sgRNA'nın kesme verimliliği, elektroporasyon parametreleri, MOI ve rAAV6 preparatının kalitesidir. Aday sgRNA'ların kesme verimlilikleri, HDRT'nin optimum düzenlenmesine ve tasarımına izin vermek için ampirik olarak belirlenmelidir. Burada sunulan elektroporasyon parametreleri, düzenlenmiş B hücrelerinin en yüksek yüzdesi yerine maksimum toplam düzenlenmiş B hücresi sayısını elde etmek için verimliliği uygulanabilirlikle dengeler. Düzenlenmiş hücrelerin daha yüksek bir yüzdesi gerekiyorsa, daha fazla hücre ölümü gözlenebilse de, artan voltajlar (1.750 V'a kadar) veya değiştirilmiş darbe uzunlukları (10-30 ms) önerilir. Ayrıca, aynı bireyden PBMC'lerden gelen B hücrelerine kıyasla dalak B hücrelerinde biraz daha yüksek düzenleme verimlilikleri kaydettik (Şekil 5); Ancak, bunun altında yatan neden şu anda bilinmemektedir.
Elektroporasyondan sonra% 1 DMSO ilavesinin, diğer hücrelerdeki raporlara paralel olarak, hücre canlılığını etkilemeden rhesus makak B hücrelerinde gen düzenleme verimliliğini ~% 40 oranında önemli ölçüde artırdığını bulduk (Şekil 6A-C)43. Bununla birlikte,% 1 DMSO'da genişletilmiş kültürden kaçınılmalıdır ve hücre canlılığını etkileyebilir. İstenirse DMSO tamamen çıkarılabilir.
Hücrelerin rAAV6 ile birlikte birkaç saat elektroporasyondan sonra küçük bir hacimde kültürlenmesi, muhtemelen HDRT'nin rAAV6 tarafından daha iyi transdüksiyonu ve dolayısıyla Cas9'un aktif olduğu ilgili zamanda daha yüksek hücre içi HDRT konsantrasyonu nedeniyle daha yüksek düzenleme verimliliğine yol açar. Hücrelerin 8 saate kadar bu şekilde kültürlenmesinin hücre canlılığını etkilemediğini, ancak düzenleme verimliliklerinin 5 saatin ötesinde önemli ölçüde artmadığını bulduk (Şekil 6). Knock-in yerine yalnızca knock-out gerekiyorsa, bu adım atlanabilir.
Sonuç olarak, rhesus makak B hücrelerinin in vitro gen düzenlemesi ve istenen yapıların verimli bir şekilde knock-in edilmesi için gerekli olan rAAV6 HDRT üretimi için kapsamlı protokoller sunuyoruz. Bu protokoller, rAAV6 olarak paketlenmiş birçok yapının hızlı, uygun maliyetli bir şekilde test edilmesini sağlar ve B hücresi terapilerinin fizibilitesinin ve ölçeklenebilirliğinin daha alakalı bir insan dışı primat modelinde klinik öncesi testini sağlar.

B hücreleri humoral bağışıklığın temelidir. Konyak antijeni ve ikincil sinyaller tarafından aktivasyon üzerine, naif B hücreleri germinal merkez B hücrelerine, hafıza B hücrelerine ve plazma hücrelerine yol açar1. İkincisi, şu anda mevcut olan aşıların çoğunun koruyucu işlevlerine aracılık eden salgılanan antikorların kaynağıdır2. Plazma hücreleri, seruma çok miktarda antikor salgıladıkları için antikor fabrikaları olarak tanımlanmıştır - yaklaşık 2 ng / gün / hücre3, 7-16 g / L serum tutarındadır ve antikorları serum4'teki en bol üç proteinden biri haline getirir. B hücreleri kanda bol miktarda bulunur ve bu nedenle kolayca elde edilebilir ve bir bireye geri enjekte edilebilir.
Bu özellikler, B hücrelerini, B hücresi reseptörünü (BCR) gen düzenleme ve insan immün yetmezlik virüsüne (HIV) karşı geniş ölçüde nötralize edici antikorları (bNAbs) ifade etme çabalarının bir hedefi haline getirmiştir 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ve diğer proteinler 16, 17,18,19,20,21. Bu tür yaklaşımlar, in vivo 7,8,10,11,16,22 numaralı fare çalışmalarında potansiyel göstermiştir. Bununla birlikte, klinik çeviri 9,15,23 için, aralarında terapötik etkinliğin güvenliği, süresi ve büyüklüğünün yanı sıra insan olmayan primatlar (NHP'ler) gibi daha büyük hayvanlara ölçeklendirme gibi çeşitli engellerin üstesinden gelinmelidir. Gerçekten de, NHP'ler ve özellikle antikor ve HIV araştırmalarında uzun bir geçmişe sahip olan rhesus makakları24,25, bu parametreleri test etmek için en uygun modeldir.
Burada, bu sorunların ele alınmasını sağlayan protokoller geliştirdik. Bugüne kadar, az sayıda çalışma rhesus makak B hücrelerini ex vivo olarak kültürlemeye çalışmıştır ve rhesus makak B hücrelerinin saflaştırılması için sadece CD20 kullanılarak pozitif seleksiyon bildirilmiştir26,27,28. El değmemiş rhesus makak B hücrelerinin diğer hücre tiplerinin negatif tükenmesi ile izolasyonu için bir protokol oluşturduk. Ayrıca, rhesus makak B hücrelerinin hedeflenen gen düzenlemesi için kültürleme koşulları tanımlanmıştır. Bu protokol, kültürlenmiş rhesus makak B hücrelerini gen düzenlemek için homolojiye yönelik onarım şablonu (HDRT) olarak CRISPR / Cas9 ribonükleoproteinlerin (RNP'ler) ve rekombinant adeno ilişkili virüs serotip 6'nın (rAAV6) kullanımını özetlemektedir. Bu protokol kullanılarak, büyük (~1,5 kb) kesici uçlarla %40'a varan düzenleme verimlilikleri elde edildi. Ayrıca, HDRT'lerin bu formatta hızlı bir şekilde test edilmesini sağlamak için tetrasiklin etkin, kendi kendini susturan bir adenoviral yardımcı29 kullanarak rAAV6 üretmek için hızlı ve uygun maliyetli bir yöntem sunuyoruz. Kombine olarak, bu protokoller rhesus makak B hücrelerinin gen düzenlemesi için etkili bir iş akışını tanımlar (Şekil 1), B hücresi terapilerinin bir NHP modelinde değerlendirilmesini sağlar.
Deneylere başlamak için, donör materyali ticari kaynaklardan sipariş edilebilir veya flebotomiler veya splenektomi ile elde edilebilir. Bu çalışmada, flebotomiler ve kan toplanması daha önce tarif edildiği gibi30 antikoagülan EDTA kullanılarak gerçekleştirildi. Dallak, primer rhesus makak B hücrelerini elde etmek için, parsiyel (%25-%50) veya total splenektomiler daha önce bildirilen teknikler kullanılarak gerçekleştirildi31. Hayvanlar ameliyattan önce bir gecede oruç tutuldu. Kısaca, ameliyat sırasında, karın kırpıldı ve üç kez alternatif klorheksidin ve% 70 izopropil alkol ovma ile hazırlandı. Dalağı tanımlamak ve izole etmek için karın içinde bir kesi (5-10 cm) yapıldı. Dalağın vaskülatürü dikişlerle veya vasküler kelepçelerle bağlandı. Kesi 4-0 PDS polidioksanon sütürlerle iki kat halinde kapatıldı. Splenektomi bireysel bir hayvan için tek bir kez yapıldı. Tek hücreli süspansiyonlar makak dalaklarından hücre süzgeçleri vasıtasıyla maserasyon yoluyla hazırlandı. Kan ve dalak hücre süspansiyonlarından elde edilen mononükleer hücreler, yoğunluk gradyanı santrifüjleme kullanılarak hazırlandı ve sıvı azotta depolandı.

<table><tbody><tr><td>1,5 mL tüp steril, Dnase, Rnaze ve purogen içermez</td><td>Stellar Scientific</td><td>T17-125</td><td>veya benzeri</td></tr><tr><td>10 mL serolojik pipet, polistiren, steril, pirojenik olmayan, DNaz-/RNaz içermeyen ve İnsan DNA'sı içermez</td><td>Corning</td><td>4488</td><td>veya benzeri</td></tr><tr><td>15 cm doku kültürü kabı</td><td>Falcon</td><td>353025</td><td>veya benzeri</td></tr><tr><td>15 mL polipropilen konik tybe</td><td>Falcon</td><td>352097</td><td>veya benzeri</td></tr><tr><td>25 mL serolojik pipet, polistiren, steril, pirojenik olmayan, DNaz-/RNaz içermeyen ve İnsan DNA'sı içermez</td><td>Corning</td><td>4489</td><td>veya benzeri</td></tr><tr><td>250 mL polipropilen konik tybe</td><td>Corning</td><td>430776</td><td>veya benzeri</td></tr><tr><td>293AAV hücre hattı</td><td>Cell Biolabs</td><td>AAV-100</td><td></td></tr><tr><td>2-B-merkapto-etanol, 55mM (1000x)</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>48 oyuklu doku kültürü plaka</td><td>Corning</td><td>3548</td><td>veya benzeri</td></tr><tr><td>5 mL serolojik pipet, polistiren, steril, pirojenik olmayan, DNaz-/RNaz içermeyen ve İnsan DNA'sı içermeyen</td><td>Corning</td><td>4487</td><td>veya benzeri</td></tr><tr>Luer-Lok Tip <td>BD</td><td>309646</td><td>veya benzeri</td><td>5 mL şırınga</td></tr><tr><td>50 mL polipropilen konik tybe</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td>veya benzeri</td></tr><tr><td>50 mL serolojik pipet, polistiren, steril, pirojenik olmayan, DNaz-/RNaz içermeyen ve İnsan DNA'sı içermez</td><td>Corning</td><td>4490</td><td>veya benzeri</td></tr><tr><td>6 oyuklu doku kültürü plakası</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td>veya benzeri</td></tr><tr><td>AAV-6 Paketleme Sistemi (plazmitler)</td><td>Cell Biolabs</td><td>VPK-406</td><td></td></tr><tr><td>AAV6 Referans Malzemeleri (tam kapsidler)</td><td>Charles River</td><td>RS-AAV6-FL</td><td></td></tr><tr><td>Accu-jet S Pipet Kontrol Cihazı</td><td>Marka</td><td>26350</td><td>veya benzeri pipet kontrol cihazı</td></tr><tr><td>Antibiyotik/Antimikotik 100x</td><td>Gibco</td><td>15260-062</td><td></td></tr><tr><td>anti-insan CD14 AlexaFluor647</td><td>Biolegend</td><td>301812</td><td></td></tr><tr><td>anti-insan CD14 biotin</td><td>BioLegend</td><td>301826</td><td></td></tr><tr><td>anti-insan CD16 AlexaFluor700</td><td>BD Biosciences</td><td>557920</td><td></td></tr><tr><td>anti-insan CD16</td><td>biyotin BioLegend</td><td>302004</td><td></td></tr><tr><td>anti-insan CD20 PECy7</td><td>Biolegend</td><td>302312</td><td></td></tr><tr><td>anti-insan CD3 biotin</td><td>Thermo Fisher</td><td>APS0309</td><td></td></tr><tr><td>anti-insan CD3 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>552127</td><td></td></tr><tr><td>anti-insan CD33 biotin</td><td>Miltenyi</td><td>130-113-347</td><td></td></tr><tr><td>anti-insan CD64</td><td>biotin BioLegend</td><td></td><td></td>305004</tr><tr><td>anti-insan CD66 biyotin</td><td>Miltenyi</td><td>130-100-143</td><td></td></tr><tr><td>anti-insan CD89 biyotin</td><td>BioLegend</td><td>354112</td><td></td></tr><tr><td>anti-insan CD8a biyotin</td><td>BioLegend</td><td>301004</td><td></td></tr><tr><td>anti-insan HLA-DR BV605</td><td>Biolegend</td><td>307640</td><td></td></tr><tr><td>anti-insan Ig hafif zincir lambda APC</td><td>Biolegend</td><td>316610</td><td></td></tr><tr><td>anti-insan IgM BV421</td><td>Biolegend</td><td>314516</td><td></td></tr><tr><td>anti-İnsan Kappa Hafif Zincir FITC</td><td>Fisher Scientific</td><td>A18854</td><td></td></tr><tr><td>Otoklav</td><td>Steris</td><td>Amsco Lab 250</td><td>veya benzeri</td></tr><tr><td>Hücre kültürü CO2 inkübatörü</td><td>Fisher Scientific</td><td>51026331</td><td>veya benzeri</td></tr><tr><td>Santrifüj Filtre Ünitesi (Amicon Ultra - 4, 100 kDa)</td> <td>Millipore</td><td>UFC810024</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj 5920 R</td><td>Eppendorf</td><td>EP022628188</td><td>veya 96 oyuklu plakalar, 15, 50 ve 250 mL boyutlu tüpler için ek parçalı başka herhangi bir soğutulabilir sallanan kova santrifüjü</td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>C298SK-4</td><td></td></tr><tr><td>Cpg ODN</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-2395</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit (DMSO)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>34869-500ML</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, Yüksek Glikoz</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI (RNaz içermez)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303L</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, kalsiyum yok, magnezyum yok</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporasyon kiti (Neon Transfeksiyon Sistemi 10 ve mikro; L)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>MPK1096</td><td>veya diğer boyutlar veya 100 uL transfeksiyon kiti MPK 10096</td></tr><tr><td>Elektroporasyon sistemi (Neon Transfeksiyon Sistemi)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>MPK5000</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Hyclone</td><td>SH30910.03 *</td><td></td></tr> <tr><td>Ficoll-PM400 (Ficoll-Paque PLUS)</td> <td>Cytiva</td><td>17144002</td><td>veya benzeri</td></tr><tr><td>Çeker</td><td>ocak Fisher Scientific</td><td>FH3943810244</td><td>veya benzeri</td></tr><tr><td>Glutamin 200 mM</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Dereceli Silindir 1L</td><td>Corning</td><td>3022-1L</td><td>veya benzeri</td></tr><tr><td>Hemositometre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z375357-1EA</td><td>veya benzeri</td></tr><tr><td>HEPES 1M</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1M</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Sıcak Plaka Manyetik Karıştırıcı</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP88857200</td><td>veya benzeri</td></tr><tr><td>İnsan</td><td>BAFF Peprotech&nbsp;</td><td>310-13</td><td></td></tr><tr><td>İnsan BD Fc Blok</td><td>BD</td><td>564220</td><td></td></tr><tr><td>İnsan IL-10</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>200-10</td><td></td></tr><tr><td>İnsan IL-2</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>200-02</td><td></td></tr><tr><td>Hidroklorik asit</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144S-500</td><td></td></tr><tr><td>Hidrofilik Polietersülfon Şırınga Filtreleri, (Supor membranı), Steril - 0.2 ve mikro; m, 25 mm&nbsp;</td><td>Pall</td><td>4612</td><td></td></tr><tr><td>İnsülin-Transferin-Selenyum, 100x</td><td>Gibco</td><td>41400-045</td><td></td></tr><tr><td>ITR astar ileri: GGAACCCCTAGTGATGGAGTT</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>özel</td><td></td></tr><tr><td>ITR astar tersi: CGGCCTCAGTGAGCGA</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>özel</td><td></td></tr><tr><td>Laminer akış biyogüvenlik kabini</td><td>The Baker Company</td><td>SG403A</td><td>veya benzeri</td></tr><tr><td>Büyük manyetik tükenme (LD) Sütunu</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-901</td><td></td></tr><tr><td>Macentik ayırıcı (MidiMACS ayırıcı ve çoklu stand)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-329</td><td></td></tr><tr><td>Manyetik karıştırma çubuğu</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-512-127</td><td>veya benzeri</td></tr><tr><td>Manyetik streptavidin boncukları (Streptavidin Mikro Boncuklar)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-101</td><td></td></tr><tr><td>Maxiprep kiti</td><td>Machery-Nagel</td><td>740414.5</td><td>veya benzeri</td></tr><tr><td>Medya Şişeleri 2L kapaklı</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-34514-26</td><td>veya benzeri</td></tr><tr><td>MegaCD40L</td><td>Enzo</td><td>ALX-522-110-C010</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optik 384 kuyulu Reaksiyon Plakası</td><td>Fisher Scientific</td><td>4309849</td> MicroAmp Optik Yapışkan Film Fisher Scientific 4311971 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj 5424 R</td><td>Eppendorf</td><td>5404000014</td><td>veya 1,5 mL tüpler için başka herhangi bir masa üstü santrifüj Mikrodalga</td></tr><tr><td>fırın</td><td>Panasonic</td><td>NN-SD987SA</td><td>veya benzeri</td></tr><tr><td>Nikon TMS Ters Faz Kontrast Mikroskobu</td><td>Nikon</td><td>TMS</td><td>veya başka herhangi bir Hücre kültürü için ters faz kontrast mikroskobu</td></tr><tr><td>Esansiyel olmayan amino asitler, 100x</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Nükleaz içermeyen Dubleks tampon</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>11-01-03-01</td><td></td></tr><tr><td>Nükleaz İçermeyen Su</td><td>Qiagen</td><td>129115</td><td></td></tr><tr><td>pH metre</td><td>Mettler Toledo</td><td>30019028</td><td>veya benzeri</td></tr><tr><td>Pipetman Classic Başlangıç Kiti, 4 Pipet Kiti, P2, P20, P200, P1000 ve uçlar</td><td>Gilson</td><td>F167380</td><td>veya benzeri pipet ve uç seti</td></tr><tr><td>Pluronic F-68 %</td><td>10Gibco</td><td>24040-032</td><td></td></tr><tr><td>Polietilen Glikol 8000</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP233-1</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenimin, Doğrusal, MW 25000, Transfeksiyon Sınıfı (PEI 25K</td><td>Polysciences</td><td>23966-100</td><td></td></tr><tr><td>Hassas Terazi</td><td>Mettler Toledo</td><td>ME4001TE</td><td>veya benzeri</td></tr><tr><td>Ön Ayırma Filtreleri (30 & mikro; m)</td> <td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex cam beher 2 L</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-34502-13</td><td>veya benzeri</td></tr><tr><td>Pyrex cam beher 250 mL</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS1000250</td><td>veya benzeri</td></tr><tr><td>qPCR Enstrüman</td><td>Fisher Scientific</td><td>4485691</td><td>veya benzeri</td></tr><tr><td>RC1 antijeni rastgele biyotinile edilmiş</td><td>Bjorkman laboratuvarı, CalTech</td><td>evde</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>S.p. Cas9 Nükleaz</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>1081059</td><td></td></tr><tr><td>Scientific 1203 Su Banyosu</td><td>VWR</td><td>24118</td><td>veya 37 &°C'ye ayarlanmış herhangi bir su banyosu; C</td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Piruvat 100 mM</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>PES Membranlı Steril Tek Kullanımlık Filtre Üniteleri</td><td>Termo&nbsp; Bilimsel Nalgene&nbsp;</td><td>567-0020&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-PE</td><td>BD Biosciences</td><td>554061</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green Master Mix&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A25742</td><td></td></tr><tr><td>Tetrasiklin özellikli, kendi kendini susturan adenoviral vektör RepCap6&nbsp;</td><td>Oxgene</td><td>TESSA-RepCap6</td><td></td></tr><tr><td>Tripan Mavi Çözeltisi, %0.4</td> <td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (%0.05), fenol kırmızısı</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Su Arıtma Sistemi</td><td>Millipore Sigma</td><td>ZEQ7000TR</td><td>veya benzeri</td></tr><tr><td>Zombie-NIR</td><td>Biolegend</td><td>423106</td><td></td></tr></tbody></table>

primer rhesus macaque b hücrelerinin gen düzenlemesi

Gene Editing of Primary Rhesus Macaque B Cells

B hücreleri ve soyları, yüksek oranda eksprese edilen antikorların kaynaklarıdır. Yüksek protein ekspresyon yetenekleri, bollukları, periferik kan yoluyla kolay erişilebilirlikleri ve basit evlat edinme transferlerine uygunlukları, onları rekombinant antikorları veya diğer terapötik proteinleri ifade etmek için gen düzenleme yaklaşımları için çekici bir hedef haline getirmiştir. Fare ve insan birincil B hücrelerinin gen düzenlemesi verimlidir ve in vivo çalışmalar için fare modelleri umut vaat etmiştir, ancak daha büyük hayvan modelleri için fizibilite ve ölçeklenebilirlik şu ana kadar gösterilmemiştir. Bu nedenle, bu tür çalışmaları mümkün kılmak için rhesus makak primer B hücrelerini in vitro olarak düzenlemek için bir protokol geliştirdik. CRISPR / Cas9 kullanarak periferik kan mononükleer hücrelerinden veya splenositlerden primer rhesus makak B hücrelerinin in vitro kültürü ve gen düzenlemesi için koşullar bildirilmiştir. Büyük (<4.5 kb) kasetlerin hedeflenen entegrasyonunu sağlamak için, tetrasiklin özellikli kendi kendini susturan adenoviral yardımcı vektör kullanılarak homolojiye yönelik bir onarım şablonu olarak rekombinant adeno ilişkili virüs serotip 6'nın hazırlanması için hızlı ve etkili bir protokol dahil edilmiştir. Bu protokoller, rhesus makaklarında prospektif B hücresi terapötiklerinin incelenmesini sağlar.

B hücre tedavilerinin incelenmesi için CRISPR / Cas9 ve rekombinant adeno ilişkili virüs serotip 6 kullanarak primer rhesus makak B hücrelerinin kültürlenmesi ve gen düzenlenmesi için bir yöntem sunuyoruz.

Primer Rhesus Macaque B Hücrelerinin Gen Düzenlemesi

B cells and their progeny are the sources of highly expressed antibodies. Their high protein expression capabilities together with their abundance, easy ...

Yöntem nispeten basittir ve rhesus makak B hücrelerinin etkili gen düzenlemesine izin verir. Yöntem, rhesus makaklarında terapötik amaçlar için gen düzenlenmiş B hücrelerinin test edilmesine izin verir. Ayrıca klinik öncesi B hücre tedavisi araştırmaları için de uygundur.Genel yöntem diğer hücre tipleri için uyarlanabilir. Prosedür doğru bir şekilde takip edilirse, mücadele beklenmemelidir. Bununla birlikte, gRNA kesme verimliliği ve rekombinant AAV6 sağlayan şablonun kaliteli bir partisi kritik öneme sahiptir.Başlamak için, B hücre kültürü ortamını 37 santigrat derecelik bir su banyosunda önceden ısıtın. B hücresi uyarıcılarını buz üzerinde çözün. Önceden ısıtılmış bir çözme ortamı içeren uygun boyutta bir tüp hazırlayın.37 santigrat derecelik bir su banyosunda bir ila iki şişe birincil rhesus makak splenositini veya PBMC'yi çözün. Splenositleri, önceden ısıtılmış bir çözme ortamı içeren hazırlanmış tüpe boşaltın. Tüm hücreleri toplamak için kriyotüpleri durulayın.Hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 200 G'de santrifüj edin. Süpernatantı atın ve hücreleri yıkama için 10 mililitre çözme ortamında yeniden askıya alın. Dondurucu ortamı çıkarmak için santrifüjlemeleri üç kez tekrarlayın.Son santrifüjlemeden sonra, hücreleri bir B hücre kültürü ortamında mililitre başına altı hücreye tahmini beş kez 10 ila yeniden askıya alın. 10 mikrolitre hücre süspansiyonunu 10 mikrolitre% 0.4 tripan mavisi ile birleştirin ve bir hemositometredeki hücreleri sayın. Hücre konsantrasyonunu, hücre sayısına göre B hücre kültürü ortamı ile mililitre başına altı hücreye üç kez 10'a ayarlayın.Ardından, B hücresi uyarıcılarını son konsantrasyonlarına ekleyin ve karıştırın. Hücreleri bir hücre kültürü kabına aktarın ve 48 saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin. Yerleştikten sonra, hücreler yoğun bir tek katman oluşturmalıdır ve küçük hücre kümeleri zaten görülebilir.Yaklaşık iki gün sonra, hücreler sağlıklı, düzensiz olmalı ve gözle görülür şekilde daha büyük kümeler oluşturmalıdır. B hücrelerini aktive ettikten sonra, reaktifleri elektroporasyon ve transdüksiyon için hazırlayın. DMSO nükleaz içermeyen dubleks tampon, tampon T ve tampon E veya E2'yi elektroporasyon kitinden oda sıcaklığına önceden ısıtın.rAAV6 homolojiye yönelik onarım şablonunu veya HDRT ve B hücresi uyarıcılarını buz üzerinde çözün. CRISPR Cas9 tek kılavuzlu RNA'yı veya sgRNA'yı dubleks tamponda 100 mikromolar'da yeniden askıya alın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca yeniden oluşturun ve vorteks ve titreşimle karıştırın.Yeniden yapılandırılmış sgRNA'yı kullanılıncaya kadar buz üzerine yerleştirin. 10 mikrolitrelik elektroporasyon için, uyarıcılar ve% 1 DMSO ile 550 mikrolitre B hücre kültürü ortamı hazırlayın. Bu ortamın 50 mikrolitresini antibiyotikli veya antibiyotiksiz olarak 48 delikli bir hücre kültürü plakasına ekleyin.Ardından, kuyulardaki ortama, kuyunun hacminin% 20'sine kadar rAAV6 HDRT ekleyin. Hazırlanan yemeği ve kalan ortamı% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede bir inkübatörde önceden ısıtın. Daha sonra, 10 mikrolitrelik elektroporasyon için, dubleks tamponda 0.4 mikrolitre 61 mikromolar Cas9 ile 0.75 mikrolitre 100 mikromolar sgRNA'yı karıştırarak 1.15 mikrolitre ribonükleoprotein veya RNP hazırlayın.RNP'yi hücrelerle karıştırmadan önce oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, aynı anda birden fazla lokus hedeflenecekse birden fazla RNP birleştirilebilir. Ardından, hücreleri elektroporasyon için hazırlayın.Sıcaklık şoklarını önlemek için hücreleri oda sıcaklığında bırakın. Kuluçkadan sonra, hücreleri uygun bir kaba toplayın. Maksimum hücre sayısını toplamak için kabı DPBS ile durulayın.Hücreleri 200 G'de 10 dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatantı atın ve DPBS'deki hücreleri, kültüre yerleştirilen hücre sayısına bağlı olarak, mililitre başına yaklaşık iki kez 10 ila altı hücreye yeniden askıya alın. Eşit hacimlerde hücre süspansiyonu ve% 0.4 tripan mavisini birleştirin ve bir hemositometre kullanarak sayın.Süpernatanı santrifüj ettikten ve attıktan sonra, hücreleri hücre sayısına bağlı olarak önceden ısıtılmış tampon T'de mililitre başına yedi hücreye 5.55 kez 10'da yeniden askıya alın. Makineyi açıp 1.350 volt, 15 milisaniye ve bir darbeye ayarlayarak transfeksiyon sistemini kurun. Pipet istasyonunu laminer akış davlumbazının içine yerleştirin.Her 10 elektroporasyon seti için, üç mililitre tamponlu bir transfeksiyon tüpü hazırlayın E.Tüpü pipet istasyonuna yerleştirin. 1.15 mikrolitre RNP'yi elektroporasyon başına dokuz mikrolitre hücre ile birleştirin. Kabarcıkları önlemek için en az% 20 daha fazla hazırlayın ve elektroporasyondan önce bir dakika oda sıcaklığında inkübe edin.10 mikrolitre RNP ve hücre karışımını bir elektroporasyon pipeti üzerindeki elektroporasyon ucuna aspire edin. Yüklenen pipeti pipet istasyonuna takın ve elektroporasyonu başlatın. Arklanmayı önlemek için uçların tamamen hava kabarcıklarından arındırılmış olduğundan emin olun.Elektropore edilmiş hücreleri derhal 48 kuyucuğun içinde, rAAV6'lı veya rAAV6'sız hazırlanmış önceden ısıtılmış küçük hacimli ortama çıkarın. Kültür kuyularına transfeksiyon olmadan kontrol numuneleri ekleyin. Hücreleri dört ila altı saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin.İnkübasyonun sonunda, plakaya uyarıcılar, DMSO ve antibiyotikli veya antibiyotiksiz 450 mikrolitre önceden ısıtılmış B hücre kültürü ortamı ekleyin. 24 saat sonra genomik DNA analizi yapın. Homoloji kolunun dışında bir astar ve kesici ucun içinde bir astar kullanarak dijital damlacık polimeraz zincir reaksiyonu veya PCR ile düzenleme verimliliğini ölçün.Ekleme bölgesini yükseltmek için PCR ve doğru düzenlemeyi doğrulamak için Sanger dizilimini gerçekleştirin. Protein seviyelerini analiz etmek için, protein ekspresyonunun değişmesine izin vermek ve akış sitometrisi ile bir analiz yapmak için elektroporasyondan sonra hücreleri 40 ila 48 saat boyunca kültürleyin. Tetrasiklin etkin, kendi kendini susturan adenoviral yardımcı kullanılarak rAAV6 üretimi, mililitre hücre kültürü ortamı başına dört kat 10 ila 10 GC üretimi ile sonuçlandı ve yardımcısız üçlü transfeksiyon kullanarak üretimden 30 ila 40 kat daha iyi performans gösterdi.İsteğe bağlı saflaştırma, CD3 + T hücrelerinin ve CD14 + ve CD16 + miyeloid hücrelerin çoğunun elimine edilmesiyle sonuçlandı ve% 80 ila% 95 CD20 + B hücrelerinin saflıkları rutin olarak elde edildi. Primer rhesus makak B hücrelerinin gen düzenlemesi burada gösterilmiştir. Bu çalışma, yüksek hücre canlılığını korurken, aynı zamanda% 80 B hücrelerindeki hafif zincir ekspresyonunu da siler.B hücrelerinin çoğunluğu hala izotip IgM eksprese etti. Antikor 1485 HDRT'yi kodlayan rAAV6'nın eklenmesi, antikor zincirleri için düzenlenmemiş B hücrelerine göre daha düşük floresan yoğunluğunda olmasına rağmen, B hücrelerinin% 16 ila% 21'inde gen düzenleme ve antikor 1485 yüzey ekspresyonu ile sonuçlandı. %1 DMSO eklenmesi ve rAAV6 HDRT ile genişletilmiş, konsantre inkübasyonlar genellikle düzenleme verimliliğini artırdı.Bu yöntem kullanılarak, bireysel rhesus makakına ve rAAV6 HDRT partisinin kalitesine bağlı olarak tipik olarak %beş ila %20 ve %40'a kadar düzenleme verimliliği elde edildi. Elektroporasyonu gerçekleştirirken, transfeksiyon için yeterli karışıma sahip olduğunuzdan ve uçta kabarcık olmadığından emin olun. Hücreler istenilen herhangi bir yöntemle analiz edilebilir veya donör rhesus makakına otolog transfer yapılabilir.

gene-editing-of-primary-rhesus-macaque-b-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Biz toplam bellek altkümelerini rhesus makakların CD4 + ve CD8 + T hücreleri, HIV / AIDS aşısı çalışmaları için ideal bir model gibi ayrıntılı fenotipik ve fonksiyonel karakterizasyonu için çok renkli flow sitometri yararını göstermektedir.

Rhesus Makak maymunlarının Hücresel Bağışıklık Tepkisi Multicolor Sitometrisi Analizleri

Bu genetik olarak non-viral kullanılarak bir transgen ile primer insan T-hücreleri değiştirmek için bir yöntem...

Primer insan T hücrelerinin piggyBac Transposon Sistem Modifikasyon

Burada, AIDS virüsü karşısında Rhesus macaque CD8 + T hücreleri, numaralandırma ve karakterize etmek için optimize edilmiş bir protokol mevcut. Bu makale, HIV immünoloji alanında değil, aynı zamanda CD8 + T hücre yanıtları hastalık sonucunu etkileyebilecek bilinen biyomedikal araştırmanın diğer bölgelerine sadece yararlıdır.

Maymun bağışıklık eksikliği virüsüne özgü CD8 analizi + Peptid MHC-I tetramer boyama ile Rhesus macaque maymunlarının T-hücrelerinin

Preassembled Cas9 kullanan karmaşık Ribonükleoprotein (RNP) kesin, verimli genom düzenleme için güçlü bir yöntemdir. Burada, biz yararını hücreleri ve organizmalar, geniş aralığında birincil insan hücreleri ve her iki klasik de dahil olmak üzere ve model organizmalar gelişmekte olan vurgulayın.

Gelişmiş genom Cas9 Ribonükleoprotein yılında çeşitli ile hücreleri ve organizmaların düzenleme

Bu iletişim kuralının amacı insan dışı primat CD34 izole etmektir+ hücreleri astarlanmalıdır kemik iliği, gen-lentiviral vektörler ile bu hücreleri değiştirme ve otolog ana bilgisayar içine infüzyon için bir ürün hazırlamak için gelen. Toplam iletişim kuralı yaklaşık 48 saat uzunluğudur.

Hazırlık ve Nonhuman primat hematopoetik kök ve progenitör hücrelerin gen modifikasyonu

Burada sunulan verimli CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein aracılı gen düzenleme meme hücrelerinde tüp Elektroporasyon kullanarak bir protokoldür.

CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-boru Elektroporasyon tarafından aracılı hassas gen düzenleme

Hücre etkinliğinin infüzyon çalışmaları için yeterli sayıda ilgi genlerinin mükemmel bir şekilde ifade edilen hücreleri veren rhesus makak periferik kan mononükleer hücrelerinin transdüksiyonu ve genişlemesi için 9 günlük bir protokol özetliyoruz.

Merkezi Bellek Fenotip Bakımı ile Dokuz Günde Primer T Hücrelerinin Transdüksiyonu ve Genişlemesi

Burada, B hücrelerindeki genlerin biyolojik fonksiyonlarını ve B hücre terapötiklerinin gelişimini incelemek için gen nakavt (KO) ve knock-in (KI) için birincil insan B hücrelerinin CRISPR/ Cas9 tabanlı genom mühendisliği için ayrıntılı, adım adım bir protokol sunuyoruz.

CRISPR/Cas9 Kullanarak Birincil İnsan B Hücrelerinin Genom Mühendisliği

Bu protokolün amacı, C. elegans genomunun monte edilmiş ribonikleoprotein kompleksleri ve tarama için dpy-10 co-CRISPR işaretleyicisi kullanılarak sorunsuz CRISPR/Cas9 düzenlemesini sağlamaktır. Bu protokol, C. elegans'ta eklemeler, silmeler, gen değiştirmeleri ve kodon ikameleri de dahil olmak üzere çeşitli genetik değişiklikler yapmak için kullanılabilir.

CRISPR/Cas9 C. elegans rbm-3.2 Geninin dpy-10 Co-CRISPR Tarama İşaretçisi ve Monte Edilmiş Ribonikleoprotein Kompleksleri kullanılarak düzenlenmesi.

Bu protokol, in vitro olarak bir araya getirilen ve elektroporasyon yoluyla iletilen Cas9-sgRNA ribonükleoprotein kompleksleri kullanılarak fare kemik iliği türevi makrofajlarda genom düzenleme prosedürünü açıklar.

Elektropore Cas9-sgRNA Kompleksleri Kullanılarak Primer Kemik İliği Kaynaklı Makrofajlarda Yüksek Verimli Gen Bozulması

Genom editörlerinin RNA olarak sunulması, birincil memeli hücrelerinin ve hücre hatlarının genomlarını değiştirmek için özellikle güçlü bir yöntemdir. Bu protokolün amacı, genom düzenleyicilerini mRNA olarak birincil memeli hücrelerine ve hücre hatlarına göndermek, ardından düzenleme sonuçlarını nicelendirmek için hedefli Illumina dizileme ve analizi yapmaktır.

Birincil memeli hücrelerinde editör RNA'nın elektroporasyonu yoluyla genom düzenlemesi

Keşfedin, primer rhesus makak B hücrelerinde CRISPR/Cas9 ve rAAV6 kullanarak gen düzenleme yöntemini. Bu teknik, B hücre terapileri için preklinik araştırmalarda yüksek verimlilik sağlar.

Primer Rhesus Macaque B Hücrelerinin Gen Düzenlemesi

Daha fazla video keşfet