Name: Hoechst Yan Popülasyon Hücrelerinin Akış Sitometrisi ile Etkili Tespiti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-23T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: Öğrenin, Hoechst 33342 boyası için 375 nm ve 405 nm lazerlerin akış sitometrisinde yan popülasyon hücrelerini tespit etmek üzere uygun alternatifler olduğunu. Bu yöntem, tümör başlatıcı hücrelerin maliyet etkin şekilde araştırılmasını sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'ndan (No. 81800207) J.H.'ye verilen hibelerle desteklenmiştir. Beckman Coulter, Inc.'in akış sitometrisi ve parametre kalibrasyonu için destek sağlamadaki yardımı büyük beğeni topluyor. Sichuan Üniversitesi, Batı Çin Stomatoloji Hastanesi, Devlet Ağız Hastalıkları Laboratuvarı'ndan Jiao Chen'e ve Sichuan Üniversitesi, Batı Çin Hastanesi Rejeneratif Tıp Araştırma Merkezi'nden Yu Qi'ye akış sitometrisi veri toplamadaki yardımları için teşekkür ederiz.

Bu çalışmadaki deneylerde, yaşları 8 ila 12 hafta arasında değişen toplam 10 C57BL / 6 fare kullanılmıştır. Deneysel işlemler, Sichuan Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (#201609309) tarafından onaylanan bir protokole uygun olarak gerçekleştirildi. Bu makalede kullanılan deneysel materyaller ve akış sitometrisi parametreleri Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
1. Fare kemik iliği hücrelerinin izolasyonu ve toplanması
<ol><li>Fareleri kurumsal yönergelere sıkı sıkıya bağlı olarak ötenazi yapın. Farede bilinç kaybına neden olmak için,% 2 izofluran ile başlayan inhalasyon anesteziklerini uygulayın, ardından solunumun kesilmesine kadar% 5 izoflurana dozajda kademeli bir artış yapın.</li>
	<li>Fareleri cerrahi süitte veya Çeker Ocakta inceleyin. Fareleri% 70 etanol ile temizleyin ve sterilize edin.</li>
	<li>Bacağın derisini ve kasını keskin bir makasla tamamen kesin ve uyluk kemiğini inceleyin.</li>
	<li>Femuru bir havanda öğütme çubuğuyla nazikçe ezin ve kemik beyazlaşana kadar kemik iliği hücrelerini DMEM ortamı ile yıkayın.</li>
	<li>Elde edilen kemik iliği hücrelerini 100 μm'lik bir filtre ile 15 mL'lik tüplere süzün. 800 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatan ve lizaz kalıntı kırmızı kan hücrelerini 1 mL kırmızı kan hücresi lizis tamponu ile 4 ° C'de 1 dakika boyunca atın. 800 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra tekrar DMEM ortamı ile yıkayın.</li>
	<li>Hücreleri 2 mL inkübasyon çözeltisinde (DMEM ortamı +% 5 FBS) yeniden süspanse edin, hücreleri otomatik hücre sayacı ile sayın ve hücre konsantrasyonunu inkübasyon çözeltisi ile 1.0 x 106 hücre / mL'ye ayarlayın.</li>
</ol>2. Hücresel lekelenme
<ol><li>Her fareden 2 mL kemik iliği hücresi süspansiyonunu 5 μg / mL Hoechst 33342 ile destekleyin. Başka bir 1 mL alikot'a, negatif kontrol olarak 100 μM verapamil ekleyin.</li>
	<li>37 ° C'de bir su banyosunda 90 dakika boyunca her 30 dakikada bir hafif çalkalama ile inkübe edin.</li>
	<li>İnkübasyondan sonra, hücreleri 5 dakika buz üzerinde soğutun ve ardından 4 ° C'de 5 dakika boyunca 250 x g'da santrifüjleyin. Hücreleri soğuk çalışan bir çözelti içinde (HBSS +% 2 FBS) yeniden süspanse edin. 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın.</li>
	<li>Elde edilen hücre peletini numune başına 500 μL çalışan çözelti içinde yeniden süspanse edin. FCM analizinden önce, hücreleri 2 μg / mL propidyum iyodür (PI) ile destekleyin ve yaklaşık 5 dakika boyunca buzun üzerine koyun.</li>
</ol>3. Akış sitometrisi
NOT: Kullanılan çeşitli sistemlerin ve konfigürasyonların bir özeti için lütfen Tablo 1'e bakın.
<ol><li>FCM'lerde günlük kalite kontrol (QC) florosferlerini kullanarak gerekli kanalların Varyasyon Katsayısı (CV) değerlerini kalibre edin ve kalite kontrolünün başarıyla tamamlanmasını takiben numune testi yapın.<ol><li>Yazılımın masaüstü kısayolunu seçin ve yazılımı başlatın.</li>
		<li>QC deneyine erişmek için QC/Standardization (Kalite Kontrol/ Standartlaştırma) menüsünde Start QC/Standardization (Kalite Kontrolünü Başlat) öğesini seçin.</li>
		<li>QC florosfer numune tüpünü tüp tutucuya yerleştirin.</li>
		<li>Örneği yüklemek ve QC prosedürünü çalıştırmaya başlamak için Başlat'ı seçin. FCM'ler, kalite kontrol geçtikten sonra kullanıma hazırdır.</li>
	</ol></li>
	<li>690/50 nm kanalında Hoechst kırmızısı ve 450/50 nm kanalında Hoechst mavisinin tespiti için aynı numunelerin Hoechst 33342 boyasını sırasıyla 355 nm, 375 nm ve 450 nm lazerle uyarın.<ol><li>Dosya menüsünde Yeni Deneme'yi seçerek yeni bir deneme oluşturun, dosya yolunu belirtin ve denemeyi kaydedin.</li>
		<li>Ayarlar menüsünde Kanal Ayarla'yı seçin. Kanal sinyali onay kutusunu seçin (Y585, V450, V660, NUV450, NUV660, UV450, UV660), ardından Etiket sütununa reaktif adını ekleyin (Y585: PI; V450: Hoechst Mavisi-405 nm; V660: Hoechst kırmızı-405 nm; NUV450: Hoechst Mavisi-375 nm; NUV660: Hoechst Mavisi-375 nm; UV450: Hoechst Mavisi-355nm; UV660: Hoechst Mavisi-355 nm).</li>
		<li>Çizimler oluşturmak için çizim alanındaki Sahte Renk Grafikleri simgelerini tıklatın. Hangi kanalın görüntüleneceğini değiştirmek için bir eksen adı seçin.</li>
		<li>Yeni numune tüpleri oluşturmak ve adlarını değiştirmek için Test Tüpü ekranında Tüp Ekle'ye tıklayın.</li>
		<li>Örneği yüklemek, grafikleri görüntülemek ve geçitleri oluşturmak için Çalıştır'ı seçin. Kazanç ve eşik ayarlarını yapın. Verileri kaydetmek için Kaydet'i seçin.</li>
	</ol></li>
	<li>Kapı ayar mantığını tasarlayın.<ol><li>İlk çizim için, FSC-W'yi seçmek için X eksenine tıklayın ve FSC-A'yı seçmek için Y eksenine tıklayın. Tek tek hücreyi daire içine almak ve bitişik hücreleri dışlamak için A kapısını çizmek için Çokgen Kapısı'nı seçin (Şekil 1A).</li>
		<li>İkinci çizim için, FSC-A'yı seçmek için X eksenine tıklayın ve SSC-A'yı seçmek için Y eksenine tıklayın. Parçalı olmayan hücreleri ayırmak ve hücresel kalıntıları dışlamak için B kapısını çizmek için Çokgen Kapısı'nı seçin (Şekil 1B).</li>
		<li>Üçüncü çizim için, PI-A'yı seçmek için X eksenine tıklayın ve SSC-A'yı seçmek için Y eksenine tıklayın. D kapısını çizmek için Çokgen Kapısını seçin. Negatif PI sergileyen Canlı hücreleri seçin (Şekil 1C) ve canlı hücreler elde etmek için C kapısını çizin.</li>
		<li>Dördüncü iki boyutlu çizim için, Hoechst Red'i seçmek için X eksenine tıklayın ve Hoechst Blue'yu seçmek için Y eksenine tıklayın. Grafiği sağ tıklayın ve açılır menüden Özellik'i seçin. Doğrusal Biçim f'yiveya hem X ekseni hem de Y eksenini seçin. SP hücrelerini almak için SP kapısını çizmek için Çokgen Kapısı'nı seçin (Şekil 1D).</li>
	</ol></li>
	<li>Numune uygunluğunu değerlendirmek için, SP hücresi tespiti için 355 nm spesifik bir akış sitometresi23 kullanın.</li>
	<li>Hem kontrol hücrelerini (verapamil eklenmiş) hem de deney hücrelerini tespit etmek için 355 nm (lazer gücü: 20 mW) ve 405 nm (lazer gücü: 80 mW) lazerleri aynı anda kullanın.</li>
	<li>İki lazere karşılık gelen 690/50 nm ve 450/50 nm kanallarında floresan sinyalleri elde edin. Hoechst 33342 boyasının berrak SP hücreleri ile 355 nm ve 405 nm lazerlerle etkili stimülasyonunu gözlemleyin (Şekil 2B-C).</li>
	<li>Aynı numuneler için, hücre tespiti için 375 nm (lazer gücü: 60 mW) ve 405 nm (lazer gücü: 80 mW) lazerleri kullanın.</li>
</ol>

Kolay yan popülasyon hücresi tespiti için alternatif lazer uyarma yöntemi

<ol><li>Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).</li>
<li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ABC+transporter+Bcrp1%2FABCG2+is+expressed+in+a+wide+variety+of+stem+cells+and+is+a+molecular+determinant+of+the+side-population+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype.</a> Nat Med. 7 (9), 1028-1034 (2001).</li>
<li>Camargo, F. D., Chambers, S. M., Drew, E., McNagny, K. M., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cells+do+not+engraft+with+absolute+efficiencies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cells do not engraft with absolute efficiencies.</a> Blood. 107 (2), 501-507 (2006).</li>
<li>Challen, G. A., Boles, N. C., Chambers, S. M., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+hematopoietic+stem+cell+subtypes+are+differentially+regulated+by+TGF-beta1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct hematopoietic stem cell subtypes are differentially regulated by TGF-beta1.</a> Cell Stem Cell. 6 (3), 265-278 (2010).</li>
<li>Asakura, A., Seale, P., Girgis-Gabardo, A., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenic+specification+of+side+population+cells+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Myogenic specification of side population cells in skeletal muscle.</a> J Cell Biol. 159 (1), 123-134 (2002).</li>
<li>Terrace, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Side+population+cells+in+developing+human+liver+are+primarily+haematopoietic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Side population cells in developing human liver are primarily haematopoietic progenitor cells.</a> Exp Cell Res. 315 (13), 2141-2153 (2009).</li>
<li>Martin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+lung+side+population+cells+have+mesenchymal+stem+cell+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Adult lung side population cells have mesenchymal stem cell potential.</a> Cytotherapy. 10 (2), 140-151 (2008).</li>
<li>Challen, G. A., Bertoncello, I., Deane, J. A., Ricardo, S. D., Little, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+side+population+reveals+multilineage+potential+and+renal+functional+capacity+but+also+cellular+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Kidney side population reveals multilineage potential and renal functional capacity but also cellular heterogeneity.</a> J Am Soc Nephrol. 17 (7), 1896-1912 (2006).</li>
<li>Mouthon, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+from+mouse+forebrain+are+contained+in+a+population+distinct+from+the+%27side+population%27%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells from mouse forebrain are contained in a population distinct from the 'side population'.</a> J Neurochem. 99 (3), 807-817 (2006).</li>
<li>Cordon-Cardo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells.</a> Ann Oncol. 21 (Suppl 7), 93-94 (2010).</li>
<li>Lapidot, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+initiating+human+acute+myeloid+leukaemia+after+transplantation+into+SCID+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice.</a> Nature. 367 (6464), 645-648 (1994).</li>
<li>Yun, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cancer+stem+cells+in+castration-resistant+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Targeting cancer stem cells in castration-resistant prostate cancer.</a> Clin Cancer Res. 22 (3), 670-679 (2016).</li>
<li>Lupia, M., Cavallaro, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+cancer+stem+cells%3A+still+an+elusive+entity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Ovarian cancer stem cells: still an elusive entity.</a> Mol Cancer. 16 (1), 64(2017).</li>
<li>Zhao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AQP5+complements+LGR5+to+determine+the+fates+of+gastric+cancer+stem+cells+through+regulating+ULK1+ubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">AQP5 complements LGR5 to determine the fates of gastric cancer stem cells through regulating ULK1 ubiquitination.</a> J Exp Clin Cancer Res. 41 (1), 322(2022).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+lncRNA+ROPM-mediated+lipid+metabolism+governs+breast+cancer+stem+cell+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">A novel lncRNA ROPM-mediated lipid metabolism governs breast cancer stem cell properties.</a> J Hematol Oncol. 14 (1), 178(2021).</li>
<li>Ho, M. M., Ng, A. V., Lam, S., Hung, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Side+population+in+human+lung+cancer+cell+lines+and+tumors+is+enriched+with+stem-like+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Side population in human lung cancer cell lines and tumors is enriched with stem-like cancer cells.</a> Cancer Res. 67 (10), 4827-4833 (2007).</li>
<li>Chiba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Side+population+purified+from+hepatocellular+carcinoma+cells+harbors+cancer+stem+cell-like+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Side population purified from hepatocellular carcinoma cells harbors cancer stem cell-like properties.</a> Hepatology. 44 (1), 240-251 (2006).</li>
<li>Haraguchi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+side+population+of+cancer+cells+from+human+gastrointestinal+system%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Characterization of a side population of cancer cells from human gastrointestinal system.</a> Stem Cells. 24 (3), 506-513 (2006).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+PTEN%2FmTOR%2FSTAT3+pathway+in+breast+cancer+stem-like+cells+is+required+for+viability+and+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Activation of the PTEN/mTOR/STAT3 pathway in breast cancer stem-like cells is required for viability and maintenance.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (41), 16158-16163 (2007).</li>
<li>Ota, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADAM23+is+downregulated+in+side+population+and+suppresses+lung+metastasis+of+lung+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Sci%22%5BJournal%5D)">ADAM23 is downregulated in side population and suppresses lung metastasis of lung carcinoma cells.</a> Cancer Sci. 107 (4), 433-443 (2016).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALCAM+regulates+multiple+myeloma+chemoresistant+side+population%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">ALCAM regulates multiple myeloma chemoresistant side population.</a> Cell Death Dis. 13 (2), 136(2022).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homoharringtonine+synergizes+with+quizartinib+in+FLT3-ITD+acute+myeloid+leukemia+by+targeting+FLT3-AKT-c-Myc+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Homoharringtonine synergizes with quizartinib in FLT3-ITD acute myeloid leukemia by targeting FLT3-AKT-c-Myc pathway.</a> Biochem Pharmacol. 188, 114538(2021).</li>
<li>Dong, X. L., Wei, Y. Y., Xu, T., Tan, X. Y., Li, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+side+population+in+solid+tumor+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of side population in solid tumor cell lines.</a> J Vis Exp. (168), e60658(2021).</li>
<li>Bhowmick, D., Sheridan, R. T. C., Bushnell, T. P., Spalding, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+guidelines+for+optimization+and+characterization+of+the+Beckman+Coulter+CytoFLEX+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Cytom+Part+A%22%5BJournal%5D)">Practical guidelines for optimization and characterization of the Beckman Coulter CytoFLEX platform.</a> Cytom Part A. 97 (8), 800-810 (2020).</li>
</ol>

Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmedi.

Her biri 3-4 fare içeren ve toplam 10 fare ile sonuçlanan üç deney yapmak için açıklanan protokolü kullandık. SP hücrelerinin oranı %0.05 ile %0.76 arasında değişmektedir. Fareler arasında bireysel farklılıkların gözlendiğine dikkat etmek önemlidir. Hoechst örneklerini analiz etmek için dört akış sitometresi kullandık. Akış sitometrisinin yeni versiyonunda 20 mW 355 nm'lik bir lazerle Hoechst boyasının uyarılmasının, eski moda akış sitometrisindeki 100 mW 355 nm'lik bir lazere eşdeğer olduğu gözlenmiştir. Bu fenomen, her iki sistemde de kullanılan lazer tiplerindeki varyasyona bağlanabilir. 375 nm ve 405 nm lazerlerin gözlemlenen etkisinin potansiyel nedeni, çığ fotodiyot (APD) dedektörünün kullanılmasıyla bağlantılı olarak her iki lazerin önemli güç çıkışına bağlanabilir. Hoechst Red-A kanalı, fotoçoğaltıcı tüpün (PMT) fotoelektrik dönüşüm verimliliğinin nispeten düşük olduğu 690 nm'lik kırmızıya yakın uzun dalga boyunu yakaladı. Bununla birlikte, APD, PMT 24'ünkinden yaklaşık on kat daha yüksek bir fotoelektrik dönüşüm verimliliği gösterdi. Bu nedenle, yüksek güçlü 375 nm ve 405 nm lazerlerle birleştirildiğinde, APD dedektörleri SP hücrelerini verimli bir şekilde ayırt eder. 405 nm lazer sadece SP hücrelerini etkili bir şekilde tespit etmekle kalmaz, aynı zamanda 355 nm lazere kıyasla zayıf Hoechst Red pozitif popülasyonlarının bir alt kümesini ayırt etmede üstün yetenek sergiler.
Protokolün kritik adımı, 690/50 nm (Hoechst-kırmızı) ve 450/50 nm (Hoechst-mavisi) kanallı hücreleri tespit etmek için 375 nm lazer veya 455 nm lazer ile akış sitometrisi kullanmaktır. Teknik, FCM'lerde daha sık görülen 355 nm lazer (SP hücrelerini analiz etmek için geleneksel lazer1) yerine 375 nm ve 405 nm lazerlerle SP hücrelerini tespit ederken, yüksek güçlü 375 nm ve 405 nm lazerlere ihtiyaç duyulmaktadır. Bu, bu teknolojinin sınırlamalarına yol açar. Yöntemin önemi, Hoechst boyalarını tespit etmek için kullanılan lazer yelpazesini genişletmektir, böylece SP hücre tespiti için diğer akış sitometrisi modelleri kullanılabilir.

Yan popülasyon (SP) hücreleri, Hoechst 33342 boyama ile tanımlanır ve akış sitometrisi (FCM) kullanılarak analiz edilir. SP hücreleri, floresan DNA boyasının ATP bağlayıcı kaset (ABC) taşıyıcıları 1,2 aracılığıyla hücrelerden dışarı pompalanması ile karakterize edilir. Yöntem başlangıçta murin kemik iliği hematopoetik kök hücrelerini (HSC'ler) izole etmek için kurulmuştur1. Kemik iliği SP hücreleri, CD117 + Sca-1 + Lin-Thy1 düşük ekspresyonu 3,4 ile karakterize edilen bir HSC popülasyonu ile zenginleştirildi. Daha sonra yöntem, kalp kası5, karaciğer6, akciğer7, böbrek8 ve ön beyin9 dahil olmak üzere diğer dokulardan kök hücreleri izole etmek ve zenginleştirmek için yaygın olarak kullanıldı. Özellikle, yöntem son on yılda kanser kök hücrelerini (CSC'ler) izole etmek için uygulanmıştır. CSC'ler, tümör başlatma, kendini yenileme, kemoterapiye direnç ve metastatik potansiyel özelliklerine sahip küçük bir hücre popülasyonunu temsil eder10. CSC'ler ilk olarak hematopoetik malignitelerde11 tanımlanmış ve daha sonra prostat12, over13, mide14, meme15 ve akciğer16 karsinomu gibi çeşitli solid tümörlerde gözlenmiştir. CSC tanımlaması için çeşitli tekniklerin mevcut olmasına rağmen, SP tekniği, çeşitli dokular ve hücre hatları boyunca geniş uygulanabilirliği nedeniyle tercih edilen bir seçenek olmaya devam etmektedir. Ayrıca, floresanla aktive edilen hücre sıralama (FACS) kullanarak CSC'leri izole eden değerli bir tekniktir16,17,18. Deneysel bulgular, SP hücrelerinin belirgin tümörjenite sergilediğini ve kök hücre ile ilişkili genlerin yüksek ekspresyon seviyelerini gösterdiğini göstermektedir19,20. Önceki çalışmamız21 ayrıca, multipl miyelomda izole SP hücrelerinin transkriptomik analizinin, kirpi yolu gibi kök hücrelerle ilişkili sinyal yollarının zenginleşmesini ortaya çıkardığını göstermiştir. Bu arada, akut miyeloid lösemi22'nin SP hücrelerinde diferansiyel olarak eksprese edilen genler üzerinde yol zenginleştirme analizleri yaptık. Değiştirilmiş genler, kök hücre ile ilgili yolaklarda (Wnt / β-katenin, TGF-β, Kirpi, Çentik) zenginleştirildi. 1 x 105 SP hücrelerinin BALB / c boş farelerde22 tümör oluşturabildiğini, SP olmayan hücrelerin ise oluşturamadığını bulduk, bu da SP hücrelerinin lösemi kök hücrelerinin özelliklerine sahip olduğunu gösteriyor. CSC'lerin tanımlanmasında Hoechst SP yönteminin etkinliği açıktır.
Hoechst SP protokolü, araştırmanın ilerlemesi yoluyla rafine edilmiş ve geliştirilmiştir. Protokol, boya konsantrasyonunun, hücre yoğunluğunun, inkübasyon sıcaklığının ve süresinin, tampon bileşiminin ve pH değerinin sıkı kontrolünü gerektirir. Bu protokole uygun olarak hazırlanan hücre örnekleri akım sitometrik analize tabi tutuldu. Hoechst boyasının 355 nm'de bir UV lazerle uyarılması ve hem 690/50 nm filtre (Hoechst Red) hem de 450/50 nm filtre (Hoechst Blue) kullanılarak floresan emisyonunun tespit edilmesi nedeniyle, FCM için 350 nm'lik bir lazer gereklidir. Bununla birlikte, 350 nm lazerler, yüksek maliyetleri nedeniyle çoğu FCM'de yaygın olarak donatılmamaktadır. Bu nedenle, SP hücrelerinin akış sitometrisi ile etkili bir şekilde saptanması için boya uyarımı için alternatif bir yaklaşım bulmaya çalıştık. Bu çalışmada, 375 nm ve 405 nm lazerlerin SP hücrelerini tespit etme yeteneği değerlendirildi ve 355 nm lazer ile karşılaştırıldı. Bulgularımız, 355 nm, 375 nm ve 405 nm lazerler tarafından tespit edilen SP hücreleri arasında dikkate değer bir benzerlik olduğunu göstermektedir. Bu sonuçlar, yüksek güçlü 375 nm ve 405 nm lazerlerin, SP hücre tespiti için 355 nm lazere uygun alternatifler olarak hizmet edebileceğini göstermektedir. Hoechst 33342 için ek uyarma ışık kaynaklarının dahil edilmesi, daha fazla akış sitometrisi modelinin kullanılmasını kolaylaştırır.

<table><tbody><tr><td>Otomatik hücre sayacı</td><td>Countstar</td><td>1M1200</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Filtresi (100 & mikro; m)</td> <td>BIOFIL</td><td>CSS-013-100</td><td></td></tr><tr><td>Günlük kalite kontrol florosferleri</td><td>Beckman Coulter</td><td>B5230</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Eagle's Medium'un 4.5 g / L glikoz (DMEM ortamı) ile ModifikasyonuCORNING</td><td></td> <td>10-013-CVRC</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>CORNING</td><td>35-081-CV</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Hidroklon</td><td>SH30030.02</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>Propidyum iyodür (PI)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Kırmızı kan hücresi lizis tamponu</td><td>Beyotime</td><td>C3702</td><td></td></tr><tr><td>Verapamil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V4629</td><td></td></tr></tbody></table>

hoechst yan popülasyon hücrelerinin akış sitometrisi ile etkili tespiti

Effective Detection of Hoechst Side Population Cells by Flow Cytometry

Yan popülasyon (SP) hücreleri, Hoechst 33342 boyama ile tanımlanır ve akış sitometrisi (FCM) kullanılarak analiz edilir. Hoechst SP yöntemi, ATP bağlayıcı kaset (ABC) taşıyıcılarının boya akış özelliklerine dayalı olarak kök hücrelerin izolasyonu için kullanılır. Yöntem başlangıçta hematopoetik kök hücrelerin (HSC'ler) tanımlanması ve izolasyonu için kullanıldı, ancak şimdi öncelikle kanser kök hücrelerinin (CSC'ler) tanımlanması ve izolasyonuna odaklanmak için gelişti. FCM'nin geleneksel algılama yöntemi, SP hücrelerini tespit etmek için boyayı uyarmak için 355 nm'lik bir lazer kullanır. Bu çalışma sayesinde, 355 nm lazer kullanarak SP hücrelerinin tespitinin yerini alabilecek boya uyarımı için alternatif yaklaşımları başarıyla belirledik. Bu, yüksek güçlü 375 nm veya 405 nm lazerlerin kullanılmasıyla elde edilir. Bu, yalnızca 355 nm lazer akış sitometrisi ile sınırlı kalmak yerine, SP hücrelerinin tespitinde gelişmiş seçicilik uygulamamıza izin verir.

Şekil 2'de, kontrol grubu, Hoechst 33342'nin eliminasyonunu önlemek için kök hücrelerde ABC taşıyıcılarını bloke eden verapamil ile tedavi edildi. Böylece, verapamil olmayan gruptaki kök hücreler Hoechst 33342'yi dışarı atar ve SP hücreleri olarak bilinen negatif bir hücre popülasyonu oluşturur. 355 nm lazer, Hoechst 33342 boyasını etkili bir şekilde uyardı ve kemik iliğinin SP hücrelerinin net bir şekilde gözlemlenmesine neden oldu (Şekil 2A). 355 nm lazer ve 405 nm lazer tarafından tespit edilen aynı örneklerin SP hücrelerinin temelde aynı olduğu bulundu (Şekil 2D).
Şekil 2 ve Şekil 3'ten, geleneksel olmayan akış ölçerlerin diğer modellerinin de SP hücrelerini tanımlayabildiğini gördük. Sonuçlar, hem 375 nm hem de 405 nm lazerlerin, SP hücreleri elde etmek için Hoechst 33342'yi etkili bir şekilde uyardığını göstermektedir (Şekil 3A-B). CSC'leri veya HSC'leri tespit etmek veya izole etmek gerektiğinde, 355nm lazer yerine 375 nm veya 405 nm lazeri tercih edebiliriz.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67012/67012fig01.jpg"> Şekil 1: SP hücrelerini tespit etmek için akış sitometrisi tabanlı kapı ayar mantığı. (A) Yapışık hücreleri dışlamak için FSC-A ve FSC-W kullanıldı. Kapı A, tek hücreli kümeyi temsil eder. (B) FSC-A ve SSC-A parametreleri, hücresel kalıntıların uzaklaştırılması için kullanılmıştır. B Kapısı, parçalı olmayan hücre kümesini temsil eder. (C) Negatif propidyum iyodür (PI) sergileyen canlı hücreler seçildi. C kapısı, canlı hücre kümesini temsil eder. (D) Floresan sinyalleri 690/50 nm (Hoechst-kırmızı) ve 450/50 nm (Hoechst-mavi) kanalları aracılığıyla elde edildi. Gate SP, SP hücre kümesini temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67012/67012fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67012/67012fig02.jpg"> Resim 2: Yüksek güçlü 405 nm lazer, SP hücrelerini 355 nm lazer kadar etkili bir şekilde tespit eder. (A) Hoechst 33342 boyası, kemik iliğinin SP hücrelerini tespit etmek için geleneksel bir akış sitometresinden alınan 355 nm lazer tarafından uyarıldı. (B, C) Kemik iliğinin SP hücreleri, aynı FCM'nin 355 nm ve 405 nm lazerleri ile tanımlandı. (D) 355 nm lazer ve 405 nm lazer tarafından tespit edilen aynı örneklerin SP hücrelerinin temelde aynı olduğu bulundu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67012/67012fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67012/67012fig03.jpg"> Resim 3: Yüksek güçlü 375 nm ve 405 nm lazerler SP hücrelerini tespit edebilir. (A) Yüksek güçlü 375 nm lazer, SP hücrelerini tespit edebilir. (B) Kemik iliğinin SP hücreleri de 405 nm lazerler kullanılarak tespit edilebilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67012/67012fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Lazer tipi</td>
			<td>Lazer dalga boyu (nm)</td>
			<td>Lazer gücü (mW)</td>
			<td>Hoechst kırmızı filtre (nm)</td>
			<td>Hoechst mavi filtre (nm)</td>
		</tr><tr><td>Moflo Astrios EQ</td>
			<td>Argon gazı</td>
			<td>355</td>
			<td>100</td>
			<td>692/75</td>
			<td>448/59</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">SitoESNEK LX</td>
			<td rowspan="2">Yarı iletken</td>
			<td>355</td>
			<td>20</td>
			<td>690/50</td>
			<td>450/50</td>
		</tr><tr><td>405</td>
			<td>80</td>
			<td>690/50</td>
			<td>450/50</td>
		</tr><tr><td>SitoFLEX S</td>
			<td>Yarı iletken</td>
			<td>375</td>
			<td>60</td>
			<td>690/50</td>
			<td>450/50</td>
		</tr><tr><td>SitoFLEX SRT</td>
			<td>Yarı iletken</td>
			<td>405</td>
			<td>80</td>
			<td>690/50</td>
			<td>450/50</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: Akış sitometresi konfigürasyonlarının özeti.

Burada, yüksek güçlü 375 nm ve 405 nm lazerlerin Hoechst 33342'yi etkili bir şekilde uyarabileceğini ve yan popülasyon (SP) hücre tespiti için 355 nm lazere uygun bir alternatif olarak hizmet edebileceğini ve böylece akış sitometrisi uygulamalarında mevcut lazer yelpazesini genişletebileceğini gösteriyoruz.

Hoechst Yan Popülasyon Hücrelerinin Akış Sitometrisi ile Etkili Tespiti

The side population (SP) cells are identified through Hoechst 33342 staining and analyzed using flow cytometry (FCM). The Hoechst SP method is utilized ...

effective-detection-of-hoechst-side-population-cells-by-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Aşağıdaki protokol, kök hücrelerden oluşan T hücreli Akut Lenfoblastik Lösemi (T-ALL) tümör hücrelerinin yan popülasyonunu yetişkin bir Zebra balığından izole etmek için bir yöntemi açıklar. Yan popülasyonda belirgin hücre belirteçleri yoktur ve bu nedenle onları izole etmek için Hoechst 33342 boya akış testi kullanıyoruz.

Yan Popülasyon Testi: Tümör Hücrelerinin Yan Popülasyonunu Zebra Balığından İzole Etmek İçin Bir Yöntem

Bu videoda, floresanla aktive edilen hücre sıralayıcı veya FACS kullanarak baş ve boyun skuamöz karsinom hücre hatlarından kanser kök benzeri hücrelerin bir alt popülasyonunun izolasyonunu açıklıyoruz. İzole edilmiş yan hücre popülasyonu, daha fazla aşağı akış analizi için kullanılabilir.

Kanser Tarafı Popülasyon Ayrımcılığı Deneyi: Hoechst Boya Akıntı Testi Kullanılarak Kanser Kök Benzeri Hücreleri İzole Etmek İçin Bir Yöntem

Bu protokol, zaman içinde belirli bir noktada S fazında olan hücrelerin zamansal izleme izin vermek için bromodeoksiüridin (BrdU) alımından kullanımını tarif eder. DNA boyalar ve antikor etiketleme eklenmesi daha sonraki zamanlarda S fazı hücrelerinin kaderi detaylı analizini kolaylaştırır.

Senkronizasyon Need for olmadan Akım Sitometri Kullanımı Hücre Döngüsü ilerleme zamansal İzleme

Kanser kök benzeri hücrelerin tümör nüksü ve tedavilere dirençteki rolünü anlamak son on yılda büyük ilgi gören bir konu haline gelmiştir. Bu makale, baş ve boyun skuamöz karsinom hücre hatlarından (HNSCC) kanser kök benzeri hücrelerin alt popülasyonunun izolasyonunu ve karakterizasyonunu açıklamaktadır.

Bir Baş-Boyun Skuamöz Hücre Karsinomu subpopülasyonu olması Kök Hücre Özellikleri İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Maruz kalan normal oküler yüzey kornea ve konjonktivadan oluşur. Konjunktiva içerisinde epitel hücreleri, goblet hücreleri ve immün hücreler bulunur. Burada, non-invaziv bir izlenim sitolojisi yöntemi, konjonktivadaki bağışıklık hücrelerini analiz etmek için bir impresyon sitolojisi cihazı ve akış sitometrisi kullanılarak tarif edilmiştir.

Conjunktiva&#39;dan Hücreleri İzole Etmek ve Fenotip Hedeflemek İçin İnvaziv Olmayan Bir Yöntem

Kök hücre popülasyonlarının biyolojik örneklerden karakterize edilmesine ve izole edilmesine izin veren yöntemler, kanser ve ötesinde kök hücre hedefli tedavilerin ilerletilmesi için kritik önem taşır. Burada, boya tetiklemeli yan popülasyon fenotipini kullanarak kanser kök hücre izolasyonu için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Biyolojik Örneklerden Kanser Kök Hücrelerini Algılamak ve Arıtmak İçin DNA Boya Tarafından Tetiklenen Yan Populasyon Fenotipi Kullanmak

Burada, myc-uyarılan T-hücreli akut lenfoblastik lösemi zebrabalıkları modelinde (T-ALL) yan nüfus hücreleri izole etmek için bir teknik açıklanmaktadır. Bu yan popülasyon deney yüksek oranda hassastır ve zebra balığı, T-ALL için tarif edilen, ancak diğer kötü huylu ve kötü huylu olmayan zebra balığı hücre tiplerine uygulanabilir.

Myc-induced T-cell Akut Lenfoblastik Lösemide Zebra bağıda Side Popülasyonunun İzolasyonu

Bu çalışma, farklı memeli türlerinin testiküler dokusundan saflaştırılmış germ hücresi popülasyonlarının elde edilmesi için bir yöntemin standartlaştırılmasını açıklamaktadır. Mekanik testis ayrışmasını, Hoechst-33342 ve propidyum iyodür ile boyamayı ve FACS sınıflandırmasını birleştiren basit bir protokoldür ve erkek üreme biyolojisi karşılaştırmalı çalışmalarında geniş uygulamalar yapılmıştır.

Memeli Erkek Germ Hücrelerinin Çok Denekli Saflaştırılmasında Standart Bir Yaklaşım, Mekanik Doku Ayrılma ve Akış Sitometrisi ile

Katı tümör hücre hatlarındaki yan popülasyon hücrelerinin oranını ölçmek için uygun, hızlı ve uygun maliyetli bir yöntem sunulmuştur.

Solid Tümör Hücre Hatlarında Yan Popülasyon analizi

Tek çekirdek izolasyonu ayrışma ve hücre zarının deterjan bazlı permeabilizasyonuna, optimizasyona ihtiyaç duyan ve teknik eserlere yatkın adımlara dayanır. Tek çekirdekli RNA-seq (snRNA-Seq) veya ATAC-seq için uygun olan çekirdekleri doğrudan tüm dokudan hızlı bir şekilde izole etmek için deterjan ve enzimsiz bir protokol gösteriyoruz.

Deterjan ve Enzimsiz YöntemLe Tüm Dokudan Çekirdek İzolasyon

Burada sunulan, hücre bölünmelerinin sayısını, yüzey hücresi fenotipini ve hücresel akrabalığı aynı anda ölçmeye izin veren akış sitometrisine dayalı bir tekniktir. Bu özellikler, permütasyon tabanlı bir çerçeve kullanılarak istatistiksel olarak test edilebilir.

Hematopoetik Kök ve Progenitör Hücreler için Akış Sitometrisi ile Akrabalık, Bölünme Sayısı ve Fenotipin Eşzamanlı Değerlendirilmesi

Öğrenin, Hoechst 33342 boyası için 375 nm ve 405 nm lazerlerin akış sitometrisinde yan popülasyon hücrelerini tespit etmek üzere uygun alternatifler olduğunu. Bu yöntem, tümör başlatıcı hücrelerin maliyet etkin şekilde araştırılmasını sağlar.

Hoechst Yan Popülasyon Hücrelerinin Akış Sitometrisi ile Etkili Tespiti

Daha fazla video keşfet