Pankreas Kanserinin Bir Fare Modelinde Tümör İnfiltre Eden Lenfositlerin Flow Sitometri Tabanlı İzolasyonu ve Terapötik Değerlendirmesi

Bir pankreas kanseri modelinde tümör infiltre eden lenfositleri, TIL'leri izole etmek ve evlat edinerek transfer etmek için bir yöntem geliştirmeye odaklanıyoruz. TIL'lerin alt kümelerinin in vivo olarak pankreas tümörlerini etkili bir şekilde hedefleyip öldüremeyeceğini ve T hücrelerinin gelecekteki klinik çalışmalar için nasıl optimize edilebileceğini cevaplamaya çalışıyoruz. TIL izolasyonu ve ekspresyon tekniklerinin arttırılması, hedeflemelerini iyileştirmek için TIL'lerin nazikçe modifiye edilmesi ve TIL tedavisinin kontrol noktası inhibitörleri veya gelişmiş antitümör etkinliği için hedefe yönelik tedaviler gibi diğer immünoterapilerle birleştirilmesi dahil olmak üzere evlat edinen hücre terapisindeki son gelişmeler.

Pankreas kanseri fare modelinden tümör reaktif TIL'leri izole etmek ve genişletmek için sağlam bir yöntem oluşturduk. Evlat edinerek transfer edilen tümör-reaktif T hücrelerinin anti-tümör etkinliğinin arttığını gösterdik. Protokolümüz, diğer daha az spesifik yöntemlere kıyasla tümöre özgü TIL'lerin izolasyonunu ve seçimini sağlayarak adoptif hücre tedavisine daha hedefli bir yaklaşım sunar.

Ayrıca noninvaziv tümör monitörizasyonu için biyolüminesan görüntüleme ile kullanılır. Bulgularımız, pankreas kanseri için T hücresi alt kümelerinin tedavi parametrelerini optimize etmek ve TIL tedavisinin etkinliğini değerlendirmek için standartlaştırılmış bir klinik öncesi model sağlayarak alanı ilerletecektir. Farelerde ortotopik bir pankreas tümörünü indüklemek için bir KPC-Luciferase hücre süspansiyonu hazırlamak için, KPC-Luciferase hücre hattını 37 santigrat derecede bir dakika boyunca tripsinize edin.

Tripsinizasyondan sonra, PBS ekleyin, hücreleri aktarın ve ardından hücre süspansiyonunu santrifüjleyin. Hücreleri sayın ve %30 bazal membran matrisi içeren PBS'de mililitrede 6 hücre gücüne 1 çarpı 10 konsantrasyonda yeniden süspanse edin. Anestezi uygulanmış fareyi bir işletim platformuna yerleştirin.

0,5 ila 1 santimetre sol karın kesisi yaptıktan sonra forseps kullanarak dalağı tutun ve pankreası ortaya çıkarın. KPC-Luciferase hücrelerini ve bazal membran matris karışımını hazırladıktan sonra, 29 gauge iğne kullanarak pankreasa 50.000 hücre içeren 50 mikrolitre hücre süspansiyonu enjekte edin. Pankreası karın boşluğuna geri koyun.

Periton ve cildi sırayla dikin. Farenin tamamen uyanana kadar ılık bir ped üzerinde iyileşmesine izin verin. Yedi gün sonra, canlı görüntüleme için fareye intraperitoneal olarak 60 mikrolitre D-Luciferin potasyum tuzu çözeltisi enjekte edin.

Anesteziyi takiben, fareyi biyolüminesans tespiti için in vivo görüntüleme sistemine yerleştirin. Görüntülemeden sonra, fareyi sistemden çıkarın ve anesteziden doğal olarak iyileşmesine izin verin. Başlamak için, donör ötenazi faresini bir işletim platformuna yerleştirin.

Tüm vücudu% 75 etanol ile sterilize edin. Steril bir başlıkta, karın boşluğunu açmak için makas ve forseps kullanın. Tümörü çıkarın ve buz üzerinde PBS'ye yerleştirin.

Tümör boyutunu Vernier kalibreli bir kalibre ile ölçün. Ardından, ekrandaki formülü kullanarak tümör hacmini hesaplayın. RPMI 1640'ta kollajenaz, Dispas II ve DNAse I kullanarak 1X sindirim çözeltisini hazırladıktan sonra, 12 oyuklu bir plakada oyuk başına bir ila iki mililitre çözelti ekleyin.

Tümörleri makas kullanarak küçük parçalar halinde doğrayın. Tümör parçalarını 12 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna aktarın ve 30 dakika boyunca 70 RPM'de çalkalarken 37 santigrat derecede sindirin. Sindirimi sonlandırmak için, bir ila iki mililitre% 10 fetal sığır serumu ekleyin ve hücre süspansiyonunu bir toplama tüpüne aktarın.

Kalan hücreleri toplamak için 12 oyuklu bir plakanın kuyularını PBS ile iki kez yıkayın. Hücre süspansiyonunu 70 mikrometrelik bir hücre süzgecinden süzün, bir şırınga pistonunun düz ucunu kullanarak tek hücreleri serbest bırakmak için doku parçalarını kıyın ve ezin. Süzüntüyü 400 G'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin ve akış sitometrisi boyaması için peleti% 5 sığır serum albümini içinde yeniden süspanse edin.

Başlamak için, tümör taşıyan fareden izole edilen hücreleri, tümör taşımayan fareden alınan dalak veya periferik kan mononükleer hücreleri ile birlikte çalışan bir platforma yerleştirin. Hücreleri FC blokerleri ve akış antikorları ile 1 ila 100 seyreltmede boyayın. Tüpleri karanlıkta 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, hücreleri PBS'de% 1 sığır serum albümini içinde yeniden süspanse etmeden önce santrifüjleme ile PBS'de iki kez yıkayın. Bir akış sitometresinde, CD45 + CD3 + hücrelerini sıralamak için, P1 kapısı oluşturmak için FSC-A ve SSC-A'ya dayalı canlı hücreleri geçit edin. Ardından, P2 kapısını oluşturmak için FSC-A ve FSC-H'ye dayalı olarak P1'den tek hücreleri geçitleyin. CD45 ve CD3 kapısını kullanarak CD45 + CD3 + hücrelerini P2'den sıralayın. Sıralanan hücreleri toplama tüplerine toplayın.

Santrifüj, CD45 + CD3 + hücrelerini 400 G'de dört santigrat derecede beş dakika boyunca sıraladı. Fare serumundaki hücreleri, mililitre başına 6 hücre gücüne 1 kez 10 konsantrasyonda yeniden süspanse edin ve buz üzerine yerleştirin. Tümörün neden olduğu alıcı fareyi bir işletim platformuna yerleştirin.

29 gauge 1/2 inçlik bir insülin şırıngası kullanarak, sıralanmış bağışıklık hücrelerini intraperitoneal olarak enjekte edin. Ardından, interlökin-2'yi art arda üç gün boyunca intraperitoneal olarak uygulayın.