İmmünkompetan Fareleri İntratrakeal Olarak Aşılamak için Agar Boncuğu Gömülü Mycobacterium abscessus'un Hazırlanması

Klinik öncesi çalışmalarda antibiyotik etkinliğini test etmek için kronik mikobakteri apsesi akciğer enfeksiyonunun bir fare modelini geliştiriyoruz. İlk zorluk, farelerin mikobakteri apselerine karşı içsel direncinin üstesinden gelmektir. İkinci zorluk, intratrakeal enfeksiyon için tekrarlanabilir agar beat gömülü bakteri partisi oluşturmaktır. Farelerde yeni ilaçları test etmek için diğer laboratuvarlar tarafından kolayca uygulanabilecek ayrıntılı bir agar beat hazırlama ve enfeksiyon protokolünü paylaşmak istiyoruz.

Agar ile enfekte olmak, serbest bakteriler yerine gömülü bakterileri yener, kısmen immünokompetan farelerin enfeksiyonu kendiliğinden temizleme yeteneğinin üstesinden gelir. Bu model, mycobacterium abscessus'a karşı yeni antibiyotiklerin değerlendirilmesi için sağlam bir klinik öncesi araç sağlar ve pulmoner enfeksiyonlara karşı çok ihtiyaç duyulan antibiyotiklerin keşfini ve geliştirilmesini kolaylaştırır.

[Öğretim Görevlisi] Başlamak için, 30'luk bir optik yoğunluğa ayarlanmış, katlanarak büyüyen mycobacterium abscessus süspansiyon kültürleri elde edin. 50 santigrat derecede önceden dengelenmiş 27 mililitre erimiş triptik soya burgusunu üç mililitre bakteri süspansiyonu içeren bir tüpe aktarın. Süspansiyonu pipetleyerek karıştırın. Bakteri burgu karışımını bir şişede 60 mililitre mineral yağ içeren bir şişeye dikkatlice pipetleyin. Şişeyi ikincil bir kaba koyun ve hemen manyetik bir karıştırma çubuğu kullanarak manyetik bir karıştırma üzerinde orta hızda karıştırmaya başlayın. Yağ burgu karışımında görünür bir girdap oluştuğundan emin olun ve oda sıcaklığında altı dakika boyunca karıştırmaya devam edin. Süspansiyonun soğumasını sağlamak için ikincil kaba buz koyun. Daha sonra bulamaç karışımını 250 mililitrelik santrifüj tüplerine aktarın. Süspansiyonu ilk beş döngü için dört santigrat derecede altı dakika boyunca 3.700 G'de santrifüjleyin ve burgu boncuk peletini DPBS ile yeniden süspanse edin. Ayrıca, bir huni hücresi süzgeci, bağlantı halkası ve 50 mililitrelik bir tüpü tek bir üniteye monte edin. 10. yıkamadan sonra peleti tekrar süspanse edin ve boncuk süspansiyonunu dört kez seyreltin. Boncuk süspansiyonunu filtrelemek için seyreltilmiş numune materyalini süzgecin üzerine ekleyin. Emme oluşturmak ve filtrelemeyi geliştirmek için konektör halkasına bağlı 30 mililitrelik bir şırınganın pistonunu yavaşça çekin. Daha sonra seyreltilmiş süspansiyonu konsantre etmek için 1000 G'de iki dakika santrifüjleyin. Boncuk peletlerini 50 mililitrelik bir tüpe çektikten sonra, bir haftaya kadar dört santigrat derecede saklayın, ancak her deney grubu için taze boncuklar hazırlayın. Başlamak için, özel olarak tasarlanmış üç boyutlu, baskılı-eğimli bir stand kullanarak sedasyonlu CD bir fareyi kısıtlayın. Standın orta çubuğuna bağlı bir dikiş ipi kullanarak fareyi kesici dişlerinden sabitleyin. Fareyi başı kaldırılmış olarak ventral yaslanmış bir pozisyonda konumlandırmak. Mycobacterium abscessus burgu boncuk süspansiyonu ile doldurulmuş bir cam şırıngaya metal bir 24 gauge hayvan besleme iğnesi takın. Fare başına 50 mikrolitrelik kontrollü bir aşı hacmi sağlamak için pistonun üzerine naylon klipsler veya tıpalar yerleştirin. Şimdi, metal gavaj iğnesini farenin üzerine dikey olarak yerleştirin. İğneyi dikkatlice üst kısma yerleştirin ve trakeanın içine daha da aşağı kaydırın. Naylon klipsi veya tıpayı çıkarın ve 50 mikrolitre mycobacterium abscessus burgu boncuğu süspansiyonunu yavaşça akciğerlere dağıtın. Fareyi beş dakika dinlendirin. Daha sonra, tam aşının akciğerlere derin ve tekrarlanabilir bir şekilde birikmesini sağlamak için aşılama prosedürünü ikinci kez tekrarlayın. Mycobacterium abscessus içeren burgu boncukları, mCherry kırmızısı floresan proteinini eksprese etti ve boyutları yaklaşık 70 ila 250 mikrometre arasında değişiyordu. Altı bağımsız boncuk preparatındaki bakteri yükü, yüksek tekrarlanabilirlik gösterdi. Cam şırıngadan geçmeden önce ve sonra bakteri sayımı, bakteri yükünde önemli bir kayıp göstermedi. İnter-trakeal aşılama yöntemi, enfeksiyondan 24 saat sonra akciğer CFU sayımları ile gösterildiği gibi üç bağımsız boncuk preparatı arasında tekrarlanabilirdi. Enfeksiyondan 24 saat sonra akciğer CFU sayıları tüm gruplarda tutarlı kaldığından, üç bağımsız operatör arasındaki enfeksiyon tekrarlanabilirliği doğrulandı.