Genetik Olarak Yeniden Programlanmış Murin Melanomundan FFPE Örneklerini Analiz Etmek için DNA Barkod Tabanlı Multipleks İmmünofloresan Görüntüleme

Fare FFPE dokularını incelemek için bir multipleks immünofloresan paneli geliştirmek ve doğrulamak için bir protokol sunuyoruz ve plazma DNA'sı sağlayan nanopartiküllerle tedavi edilen bir melanom modelinden alınan örnekleri inceleyerek, tümör mikroçevresini yeniden programlamak için immünolojik sinyalleri kodlayarak faydasını gösteriyoruz. Alanda, fare formaliniyle sabitlenmiş parafine gömülü FFPE dokularıyla uyumlu, titizlikle geliştirilmiş ve doğrulanmış multipleks immünofloresan protokolleri eksikti.

Formalinle sabitlenmiş parafin gömme, doku morfolojisini uzun vadede korur, kullanımı ve saklanması kolaydır ve tek bir slaytta birden fazla numuneyi görüntülemek için doku mikrodizilerinin oluşturulmasını sağlar.

Uzamsal proteomik görüntüleme, karmaşık bir tümör mikro ortamının görselleştirilmesini ve analizini geliştirecek ve sonuçta daha iyi terapötiklerin geliştirilmesine katkıda bulunabilecek bağışıklık tepkilerinin tahmin edilmesine yardımcı olacaktır.

Bu protokolü, daha birçok tümör tipi ve farklı bağışıklık organlarında fare tümör modellerinin gelişmiş uzamsal profilini çıkarmak için kullanacağız.

[Anlatıcı] Başlamak için, FFPE doku slaytlarını gece boyunca 60 santigrat derecede pişirin. Ertesi gün, deparafinizasyon ve rehidrasyona başlamadan önce slaytları oda sıcaklığında 10 dakika soğutun. Daha sonra, parafini çıkarmak için slaytları her biri beş dakika boyunca iki kez ksilen çözeltisi içinde inkübe edin, ardından slaytları her biri beş dakika boyunca iki kez %100 etanol içinde hareket ettirerek dokuyu yeniden sulandırın. Slaytı her biri beş dakika boyunca %90, %70, %50 ve %30 etanol çözeltilerine sırayla yerleştirin. Slaytları damıtılmış suyla beşer dakika boyunca iki kez yıkayın. Antijen alımını gerçekleştirin, ardından antikor boyama yapmadan önce dokuyu 45 dakikalık aralıklarla iki kez ağartmak için taze ağartma solüsyonu kullanın. Ardından, antikor boyamayı gece boyunca plastik bir oda kullanarak dört santigrat derecede gerçekleştirin. Boyamadan sonra plastik hazneyi çıkarın ve önceden uygulanmış antikor kokteylini toplayın. Slaytları boyama tamponunda iki kez iki dakika yıkayın. Slaytları 40 mililitre boyama sonrası sabitleme solüsyonu içeren bir boyama kavanozunda 10 dakika inkübe edin, ardından her biri iki dakika boyunca üç kez PBS ile durulayın. Şimdi slaytları PBS ile durulamadan önce beş dakika buz gibi soğuk metanole aktarın. Bir nem odası altındaki her slayta 200 mikrolitre nihai fiksatif solüsyon uygulayın. Oda sıcaklığında 20 dakikalık bir inkübasyondan sonra, slaytları her biri iki dakikalık üç döngü boyunca PBS'de tekrar yıkayın. Hemen görüntülüyorsanız, tüy bırakmayan bir mendil kullanarak dokunun etrafındaki slaytı silin. Akış hücresi montaj ekipmanını kullanarak akış hücresine 30 saniye basın. Daha sonra görüntüleme yapıyorsanız, slaytı akış hücresini dört santigrat derecede depolama arabelleğinde uygulamadan saklayın. Görüntüye hazır olduğunuzda, akış hücresini uygulamadan önce slaytları 10 dakika boyunca depolama arabelleğinden PBS'ye aktarın. Daha sonra, istenen görüntüleme döngülerine göre alıştırma DMSO tamponlarını hazırlayın. Toplam görüntüleme döngüsü sayısı için gerekli olan raportör stok çözümünü hazırlayın. 250 mikrolitre raportör stok solüsyonunu ve her raportörün beş mikrolitresini etiketli siyah veya kehribar rengi bir mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine pipetleyin. Çözeltiyi 96 oyuklu siyah bir plakaya aktarın ve yapışkan folyo ile kapatın. Şimdi görüntüleme cihazını başlatın ve parametreleri ve pozlama sürelerini ayarlamak için cihaz yöneticisini kullanın. Raportör plakasını cihaza yerleştirin ve ardından görüntülemeye başlamak için lamı mikroskop tutucuya yerleştirin. Lekeli dokuların görüntülerini elde edin. Dijital patoloji analiz yazılımının en son sürümünü yükleyin. Proje Oluştur'a tıklayın ve proje alanı için bir hedef klasör seçin. Ardından, Resim Ekle'ye ve ardından Dosya Seç'e tıklayın. Ardından, multipleks immünofloresan görüntülemeden üretilen QuP TIFF dosyasına gidin. Görüntü türünü floresan olarak ayarlayın, varsayılan ayarları koruyun ve İçe Aktar'ı tıklatın. QuPath kullanıyorsanız, bir çalışma alanı açmak için yeni görüntüye çift tıklayın, ardından proje değişikliklerini izlemek için düzenli aralıklarla Dosya ve Kaydet'e basın. Araç çubuğundaki parlaklık ve kontrast aracını kullanarak işaretçi görünürlüğünü ve görüntüleme ayarlarını değiştirin. Tüm doku bölümünün etrafına bir açıklama çizmek için fırça veya değnek aracını kullanın. Bu açıklamayı, üstteki cildi veya analiz edilmemesi gereken bölgeleri hariç tutarken tam doku olarak tanımlayın. Negatif açıklamalar oluşturmak veya sınırları küçültmek için ALT tuşunu basılı tutun. Şimdi Ek Açıklamalar sekmesini tıklatıp Nesneler'e ve ardından Ek Açıklamalar'a basarak ek açıklamayı seçin, ardından Seçili Ek Açıklamaları Çoğalt'a tıklayın. SOX 10 kanalını açın, ardından ALT + fırça/değnek aracını kullanarak tümör bölgesini tanımlamak için çoğaltılan açıklamayı küçültün. Şimdi tam doku açıklamasını seçin. Ardından Nesneler'e, ardından Ek Açıklamalar'a gidin ve Ek Açıklamaları Genişlet'e gidin. Genişletme yarıçapını bir mikrometre olarak ayarlayın ve Çalıştır'a tıklayın. Bu yeni ek açıklamayı Tam Doku Genişletme olarak yeniden adlandırın. Tümör açıklamasını seçin, sağ tıklayın ve Hiyerarşiye ekle'yi seçin. Tümör açıklamasını yeniden seçin, ardından Nesneler, Ek Açıklamalar'a gidin ve şimdi Ters Yap'a tıklayın. Bu yeni açıklamayı Stroma olarak tanımlayın ve tüm doku kesitleri için tekrarlayın. Hücre segmentasyonunu çalıştırmak için, piksel genişliğini ve görüntü yüksekliğini bulmak için Görüntü sekmesine tıklayın. StarDist uzantısını GitHub'dan indirin. QuPath uzantılı StarDist.jar dosyasını QuPath'e aktarın. Ayrıca StarDist harika komut dosyalarını ve model dosyasını GitHub'dan indirin. Her doku bölümü için hem tümör hem de stroma açıklamalarını seçin. Ayarlar çubuğunda, komut dosyası arayüzünü açmak için Otomatikleştir'e ve ardından Komut Dosyası Düzenleyicisi'ne tıklayın. Görüntü piksel boyutuna karşılık gelen uygun StarDist hücre segmentasyon komut dosyasını açın. İstendiğinde, hücre segmentasyonu için StarDistcellsegmodel.pb öğesini seçin. Hücre segmentasyonundan sonra görüntüyü kaydedin, ardından sırayla Ölç, Ölçümleri Dışa Aktar'a tıklayın, ilgili görüntüleri seçin ve dışa aktarma türünü hücreler ve ayırıcıyı .csv olarak ayarlayın. Bir çıktı dosyası konumu seçin, ardından ilgili metrikleri dahil etmek için Doldur'u tıklayın. Kümeleme veya fenotiplemede kullanılacak her köken işaretçisi için, dışa aktarılacak bir ortalama değer seçin. Proteomik verilerin normalleştirilmesi için, dışa aktarılan CSV dosyasını açın ve yalnızca işaretçi adını korumak için sütun başlıklarını kesin. R & R Studio'nun en son sürümünü yükledikten sonra, GitHub'dan marker normalization .r scriptini indirin ve nükleer boyuta göre hücreleri filtrelemek için çalıştırın. Her işaretçi için minimum/maksimum normalleştirme gerçekleştirin. Tamamlandığında, yeni CSV dosyasını normalleştirilmiş verilerle kaydedin. Antikor DNA barkod konjugasyonu, ağır zincir bölgesinde ek bantlar gösteren protein jel elektroforezi ile doğrulandı. 4-1BBL/IL-12 nanopartikülleri ve sistemik anti-PD1 ile tedavi edilen B16-F10 yan tümörlerinin multipleks immünofloresan görüntülemesi, tümör kesitleri arasında farklı immün belirteç ekspresyonu gösterdi. FlowSOM kümelemesi, Seurat fenotiplemesine kıyasla daha geniş bir belirteç ekspresyon yoğunluğu aralığı tanımladı ve maksimum yoğunluk farkı yaklaşık 0,7'ye karşı 0,5'ti. FlowSOM fenotiplemesi ayrıca daha fazla sayıda makrofajı M1 ve M2 alt tiplerine sınıflandırdı. Makrofaj yoğunluklarının ölçülmesi, FlowSOM'un Seurat'a kıyasla hem M1 hem de M2 makrofajlarının daha yüksek yoğunluklarını tespit ettiğini, Seurat'ın ise daha fazla makrofajı Diğer olarak sınıflandırdığını gösterdi. Uzamsal analiz, M2 makrofajlarının ve doğal öldürücü hücrelerin, tedaviyi takiben en yüksek ortalama minimum mesafelere sahip olduğunu ve M1 makrofajlarının CD8 T hücreleri çevresinde daha yaygın olduğunu ortaya koydu.