Yüksek Tuzlu Diyet Koşulları Altında Tuza Duyarlı Sıçanlarda Bağırsak Mikrobiyal Hücre Dışı Veziküllerinin Ayrılması ve Diferansiyel Karakterizasyonu

Bu araştırma, yüksek tuzlu bir diyette tuza duyarlı hipertansif sıçanlarda bağırsak mikrobiyal hücre dışı veziküllerin rolünü araştırıyor, yüksek tuzlu bir diyetin vezikülleri nasıl değiştirdiğini ve hipertansif ve bağışıklık etkileşimlerini nasıl etkilediğini inceliyor. Bu alandaki son gelişmeler arasında bağırsak mikrobiyal hücre dışı veziküllerinin hipertansiyondaki rolünün anlaşılması, yüksek tuzlu diyetlerin mikrobiyal çeşitlilik üzerindeki etkisinin değerlendirilmesi ve metabolik ve bağışıklık düzenlemesinden vezikülleri hedef alan bitki bazlı müdahalelerin uygulanması yer almaktadır. Mevcut deneysel zorluklar arasında yüksek öncelikli hücre dışı veziküllerin izole edilmesi, ayrıca türetilmiş veziküllerin mikrobiyom veziküllerinden ayırt edilmesi, çalışmalar arasında tekrarlanabilirliği sağlamak için standart boyama protokollerinde numune kaybının en aza indirilmesi yer almaktadır. Bu yoğunluk ızgarası ve santrifüjleme protokolü, geleneksel yöntemlere kıyasla gelişmiş bütünlük ve tekrarlanabilirlik ile hücre dışı veziküllere daha yüksek öncelik sağlar ve hipertansiyon çalışmalarında daha güvenilir bağırsak mikrobiyomu hücre dışı vezikül araştırmalarına olanak tanır.

[Ekran Okuyucusu] Başlamak için, beş gram dışkıyı önceden tartılmış 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Tüpe 50 mililitre önceden ısıtılmış 37 santigrat derece endotoksin içermeyen PBS ekleyin ve tüpü 30 dakika döndürün. Yüksek hızlı santrifüjü 4 santigrat dereceye kadar soğutun. Daha sonra numuneyi simetrik olarak santrifüje yerleştirin ve 15 dakika boyunca 8.000G'de döndürün. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı aspire edin ve yeni bir steril santrifüj tüpüne aktarın. 15 dakika boyunca tekrar santrifüjledikten sonra, süpernatanı dikkatlice aspire edin ve daha fazla analiz için kullanın. Steril bir 0.22 mikrometre filtre ünitesini buzun üzerine yerleştirin. Süpernatanı filtrenin üst kısmına aktarın ve filtrelenmiş numuneleri toplamak için vakum pompasını açın. Süzüntüyü 10 kilodalton kesme ve 15 mililitre kapasiteli bir santrifüj filtreye aktarın. Numuneyi en az 1.400 mikrolitreye konsantre etmek için 4 santigrat derece 3000G'de 30 dakika santrifüjleyin. Numuneyi hemen buzun üzerine yerleştirin. Çalışma çözeltisini hazırlamak için bir hacim gradyan tamponu A'yı beş hacim yoğunluk gradyan ortamı ile karıştırın. Bir birim çalışma çözeltisini dört birim tampon B ile karıştırarak% 10'luk bir iyodiksanol çözeltisi hazırlayın. Benzer şekilde, iki birim çalışma çözeltisini% 20'lik bir iyodiksanol çözeltisi için üç birim tampon B ile ve% 40'lık bir iyodiksanol çözeltisi için dört birim çalışma çözeltisini% 40'lık bir iyodiksanol çözeltisi için bir birim tampon B ile karıştırın. Şimdi% 50'lik bir iyodiksanol çözeltisi yapmak için daha önce hazırlanan konsantre numuneyi yedi mililitre yoğunluk gradyan ortamı ile karıştırın. Bir yoğunluk gradyanı hazırlamak için,% 40 ve% 10 iyodiksanol çözeltilerine tripan mavisi çözeltisi ekleyin. Sekiz mililitre% 50 iyodiksanol çözeltisini ince duvarlı bir polipropilen santrifüj tüpünün dibine aktarın. Tüpü 70 dereceye eğin ve sekiz mililitre% 40 iyodiksanol çözeltisini sıvı yüzeyine aktarın. Daha sonra, sekiz mililitre% 20 iyodiksanol çözeltisi, ardından yedi mililitre% 10 iyodiksanol çözeltisi ve iki mililitre endotoksin içermeyen PBS ekleyin. Hazırlanan yoğunluk gradyan tüpünü alın ve önceden soğutulmuş bir ultrasantrifüje yerleştirin. Ultrasantrifüj parametrelerini 100.000G, 20 saat ve 10 santigrat dereceye ayarlayın ve çalıştırmayı başlatın. Koleksiyon için manuel gradyan yoğunluk ayrımı için, yoğunluk gradyanı yaklaşık 34 mililitre sıvıdır. İki mililitre çözelti, sıvı yüzeyinin merkezinden yavaşça çıkarılır ve her iki mililitrelik çözelti bir gradyandır. Böylece yoğunluk gradyan çözümü 17 gradyana bölünür. Son olarak, bir pipet kullanarak yoğunluk fraksiyonlarını steril numune tüplerine aktarın ve hemen buzun üzerine yerleştirin. Nano parçacık izleme analizi, farklı yoğunluk gradyan fraksiyonlarından toplanan hücre dışı veziküllerin boyutunu, dağılımını ve konsantrasyon profillerini ortaya çıkardı. Tüm fraksiyonlardaki hücre dışı veziküllerin çoğu, tipik bir dağılım modelini takiben 30 ila 100 nanometre boyut aralığında konsantre edildi. Hücre dışı veziküllerin konsantrasyonu, dokuzuncu fraksiyonda en yüksek seviyesine ulaştı ve mililitre başına dokuz partikülün gücüne yaklaşık 3.85 çarpı 10'da zirve yaptı. Bir bikinkoninik asit kiti kullanılarak ölçülen protein içeriği, mikrolitre başına 0.417 mikrogram ile dokuzuncu fraksiyonda da en yüksekti. Ek olarak, bir endotoksin tespit kiti kullanılarak belirlenen lipopolisakkarit ekspresyon seviyeleri, dokuzuncu ve 10. fraksiyonlarda önemli ölçüde yükselmiştir. Sodyum dodesil sülfat poli akrilamid jel elektroforez analizi sırasında dokuzuncu fraksiyonda daha fazla miktarda protein de gözlenmiştir. Transmisyon elektron mikroskobu veya TEM görüntüleri, dairesel zar benzeri morfolojiye sahip hücre dışı vezikülleri ortaya çıkardı.