Dorsal Kök Gangliyon Kültürünün İn Vitro Modellerinin Oluşturulması: Kanser-Sinir Karışmasının Araştırılmasında Tamamlayıcı Yaklaşımlar

Araştırmamız, nöro-kılavuzlu tümör göçünü ölçmek ve etkileşimlerini sınırlamak için moleküler stratejileri test etmek için 3D dorsal kök gangliyonları veya DRG eksplantları ve 2D ayrışmış kültürler kullanarak kanser-sinir karışmasına odaklanmaktadır. Bu protokol ile tamamlayıcı 3D ve 2D DRG kültürleri oluşturduk, nörit büyümesini optimize ettik ve nörit uzantıları boyunca kanser hücresi invazyonunda bir artış gösterdik. Tek bir fareden tamamlayıcı 2D ve 3D DRG kültürleri oluşturarak hem karmaşık hücre düzeyindeki etkileşimleri hem de bozulmamış sinir mimarisini yakalayan tekrarlanabilir modellerin eksikliğini giderdik.

Protokolümüz, tek bir fareden eşleştirilmiş 3D eksplantlar ve 2D nöron kültürleri üreterek açısal dokuyu korur, yüksek içerikli görüntülemeyi mümkün kılar, hayvan kullanımını azaltır ve tek bir deneyde doku düzeyinde ve tek hücreli veriler elde etmemizi sağlar. Modelimiz, DRG tarafından oluşturulan hangi faktörlerin invazyonu tetiklediği, nöron aktivitesinin, yaşın ve genotipin onu nasıl şekillendirdiği ve nörotrofik faktör reseptörlerini hedeflemenin nörit kılavuzluğunda kanser yayılımını azaltıp azaltamayacağı konusunda sorular açtı. Başlamak için, ötenazi yapılmış bir fareyi karnına koyun.

Sırt yüzeyini ortaya çıkarmak için omurganın üzerindeki alana odaklanarak kürkü tıraş edin. Hayvanın sırtına %70 etanol püskürtün. Kağıt havlu kullanarak, gevşek tüyleri çıkarmak ve diseksiyon sırasında kontaminasyonu önlemek için kuyruktan kafatasına kadar silin.

Sterilize edilmiş bir makasla, kuyruktan kafatasına kadar sırt orta hattı boyunca düz bir kesi yapın. Künt forseps kullanarak, omurgayı ortaya çıkarmak için insizyonun her iki tarafındaki cildi geri çekin. Şimdi, kontaminasyonu önlemek için yeni bir makas ve forseps kullanın ve omurganın kuyruk ucunda yatay bir kesi yapın.

Ardından, serbest bırakmak için omurganın her iki tarafında iki paralel uzunlamasına kesi yapın. Omurgayı nazikçe kaldırmak ve çevresindeki bağ dokusunu çıkarmak için forseps kullanın. Omurgayı tamamen serbest bırakmak için, omurganın üst kısmında kafatasına yakın bir kesi yapın.

Omurgayı, buz üzerinde tutulan penisilin streptomisin içeren HBSS içeren önceden soğutulmuş 10 santimetrelik bir plakaya aktarın. Ardından, omurgadan kalan bağ dokusunu çıkarmak ve omurları ortaya çıkarmak için yaylı makas kullanın. Kesilen omurgayı bir mikroskop aşamasına aktarın.

Yaylı makas kullanarak sütunu sagital düzlem boyunca dikkatlice ayırın. İnce uçlu forseps kullanarak, omurilik sinirlerinin kökleri boyunca dorsal kök gangliyonlarını ortaya çıkarmak için omuriliği kolondan çıkarın. Yaylı makas kullanarak omurilik sinirlerini kesin.

Ardından dorsal kök gangliyonlarından çevredeki bağ dokusunu çıkarın. İnce uçlu forseps kullanarak, dorsal kök gangliyonlarını dorsal köklerden nazikçe çıkarın. Tam montajlı kültür için, DRG'leri buz üzerinde tutulan penisilin streptomisin ile HBSS içeren üç santimetrelik bir plakaya yerleştirin.

Buz üzerinde 10 santimetrelik bir plakanın içine yerleştirilmiş sekiz oyuklu cam tabanlı bir sürgünün her bir kuyucuğuna iki mikrolitre soğutulmuş Matrigel'i dağıtmak için önceden soğutulmuş pipet uçları kullanın. Erken polimerizasyonu önlemek için bir seferde yalnızca bir damlacık pipetleyin. Ardından, bir dorsal kök ganglionunu kuru bir plakaya yerleştirmek için ince uçlu forseps kullanın.

Fazla HBSS'yi çıkarmak için hafifçe döndürün. Ardından temiz dorsal kök ganglionunu Matrigel damlacığına aktarın. Tüm ganglionları damlacıklara aktardıktan sonra, Matrigel'in polimerize olmasını sağlamak için cam tabanlı slaytı nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 santigrat derecede beş dakika inkübe edin.

Ardından, her bir oyuğa dikkatlice 200 mikrolitre ılık takviyeli kültür ortamı ekleyin. Slaytı 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile inkübe edin. Nöronal büyüme ve canlılık için dorsal kök gangliyonlarını günlük olarak izlemek için parlak alan mikroskobu kullanın.

Havuzlanmış dorsal kök gangliyonları içeren 15 mililitrelik konik bir tüpü oda sıcaklığında beş dakika boyunca 200G'de santrifüjleyin. HBSS'yi pipetledikten sonra, gangliyonları önceden ısıtılmış takviyeli ortamla durulayın ve hafifçe vurun. Ardından, DRG'leri peletlemek için tüpü 200G'de beş dakika santrifüjleyin.

Ortamı bir mililitre papain çözeltisi ile değiştirin. Yavaşça karıştırın ve bir doku kültürü inkübatöründe 37 santigrat derecede 20 dakika inkübe edin, her beş dakikada bir hafifçe çalkalayın. Ardından, papaini nötralize etmek için 10 mililitre takviyeli ortam ekleyin ve hafifçe karıştırın.

Dorsal kök gangliyonlarını peletlemek için 400G'de beş dakika santrifüjleyin. Süpernatanı pipetledikten sonra, Dispase II çözeltisine bir mililitre kollajenaz tip IV ekleyin ve tekrar inkübe edin. Enzim çözeltisini nötralize etmek için 4,5 mililitre takviyeli ortam ekleyin, hafifçe karıştırın ve santrifüjleyin.

Süpernatanı pipetledikten sonra, beş mililitre takviyeli ortam ekleyin. Ardından, mililitrede 0.2 miligramlık bir nihai konsantrasyona ulaşmak için Dnase I ekleyin. Dorsal kök gangliyonları şimdi tam sindirimi gösteren gevşek bir küme olarak görünmelidir.

Mekanik ayrışma için, gangliyon çözeltisini dört ila beş kez yukarı ve aşağı pipetleyerek öğütmek için 1.000 mikrolitrelik bir filtre pipet ucu kullanın. 200 mikrolitrelik pipet ucuna geçin ve dört ila beş kez pipetleyerek öğütmeyi tekrarlayın. Elde edilen bulanık süspansiyonu 70 mikrometrelik bir hücre süzgecinden 50 mililitrelik konik bir tüpe süzün.

Ardından, hücrelerin tam transferini sağlamak için süzgeci 10 mililitre ortamla yavaş yavaş durulayın. Hücreleri peletlemek için filtrelenmiş hücre süspansiyonunu 1.000G'de beş dakika santrifüjleyin. Ortamı peletten çıkarın ve hücre peletini 500 mikrolitre takviye edilmiş ortamda yeniden süspanse edin.

Sekiz oyuklu cam tabanlı slaydın kuyucuklarından kalan PBS'yi çıkarın. Ayrışmış dorsal kök gangliyon süspansiyonunu kollajen kaplı kuyucuklara dağıtın ve inkübe edin. Dorsal kök gangliyonlardan türetilen hücreleri günlük olarak izlemek, hücre canlılığını ve nöronal büyümeyi değerlendirmek için parlak alan mikroskobu kullanın Tüm fare gangliyonlarını kanser hücreleriyle birlikte kültürlemek için önce medyayı sekiz oyuklu cam tabanlı slayt üzerinde tüm montajlı DRG kültürlerinden aspire edin.

Bir pipet kullanarak, Matrigel damlacığını ve dorsal kök ganglionlarını içeren kuyucuğa 200 mikrolitre kanser hücresi süspansiyonunu yavaşça ekleyin. Ko-kültür slaytını nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 santigrat derecede %5 karbondioksit ile inkübe edin. Ortamı her gün 200 mikrolitre ısıtılmış takviyeli ortamla bir kez yıkayarak yenileyin ve 300 mikrolitre taze ortam ekleyin.

Ayrışmış gangliyonların ve kanser hücrelerinin birlikte kültürü için, medyayı sekiz oyuklu cam tabanlı slaytta ayrışmış DRG kültürlerinden aspire edin. Daha sonra inkübasyondan önce 200 mikrolitre kanser hücresi süspansiyonunu her bir oyuğa nazikçe dağıtın. DRG'nin kurulması, takviyelerin yokluğunda daha az etkiliydi ve nörit yayılımı belirgin şekilde azaldı.

Yaşlı hayvanlardan alınan tam montajlı DRG'ler, daha az bol ve daha ayırt edilebilir nörit uzantısı ve minimal glial hücreler üreterek sinir kanseri hücresi etkileşimlerinin görselleştirilmesini kolaylaştırdı. DRG nöronlarının iki enzimatik adım kullanılarak ayrışması, daha yüksek nöron iyileşmesi ile sonuçlandı. Kültürden sonraki 24 saat içinde, schwan hücreleri, makrofajlar ve fibroblastlar gibi nöronal olmayan hücreler belirginleşirken, DRG'den türetilen hücrelerden filizlenen nöritler gözlendi ve 72 saat sonra daha da arttı.

Matrigel kaplı transwell eklerine eklenen kanser hücreleri, HEC293 hücrelerine doğru istila etti, ancak 24 saatlik inkübasyondan sonra DRG nöronlarına doğru değil. Bir Matrigel damlacığına daldırılan tam montajlı DRG kültürleri, nöritin matristen çevreye doğru dışarıya doğru uzamasına izin verdi. DRG'nin damlacık içinde merkezi olarak dikkatli bir şekilde konumlandırılmasıyla, sınırları aşırı büyütmeden maksimum nörit uzantısı sağlar.

Kanser hücreleri, DRG'yi içeren Matrigel damlacığının sınırı etrafında 12 saatlik ortak kültürden sonra yerleşti. 72 saatlik ortak kültürden sonra, kanser hücreleri Matrigel'i istila etti ve gangliona doğru hareket etti, dorsal kök ganglion hücre uzantıları ile kanser hücreleri arasında doğrudan etkileşim gözlendi. Ayrışmış DRG'den türetilen hücrelerin kanser hücreleriyle birlikte kültürü, bireysel hücre etkileşimlerinin ayrıntılı olarak görselleştirilmesine izin verdi.