İlaç Taraması için Üç Boyutlu Beyin Tümörü Sferoidlerinin Metabolik Profillemesindeki Gelişmeler

Araştırma, klinik olarak ilgili modelimizde hücre davranışsal metabolik aktivitesine ve ilaç yanıtlarına odaklanarak, Denizatı teknolojisini kullanarak enerji metabolizmasını incelemek için 3 boyutlu hücre hücresi kök oluşumunu optimize etmeyi amaçlıyor. Bu bulgular, beyin tümörlerinin daha doğru bir temsilini sağlayarak, tedavi değerlendirmesini ve daha iyi tedavi stratejileri için metabolik analizi iyileştirerek ilaç döküm modellerini geliştirecektir. Sonuçlar, 3D sferoid modellerde enerji metabolizmasının nasıl değiştiğini, ilaçların metabolik yollar üzerindeki etkilerden nasıl çıktığını ve metabolik değişikliklerin tedaviye tümör direncinin gelişimine katkıda bulunduğu mekanizmaları araştırmanın yolunu açtı.

Toplanan U87 hücrelerini DMEM'de yeniden süspanse ettikten sonra, kullanılmayan ortamı 37 santigrat dereceye kadar önceden ısıtın. Hücre süspansiyonlarını 30 dakika oda sıcaklığında tutun. İlk hücre sayımına dayanarak, hücre süspansiyonunu %10 FBS içeren DMEM ile 20 mililitrelik nihai hacme kadar seyreltin ve yaklaşık 200.000 hücre sağlayın.

Nihai hücre süspansiyonunu tekrar tekrar ters çevirerek iyice karıştırın. Şeffaf yuvarlak tabanlı ultra düşük ataşmanlı 96 oyuklu bir plakaya her bir kuyucuğun kenarı boyunca yavaşça 200 mikrolitre süspansiyon ekleyin, ardından santrifüjleme sırasında sızıntıyı önlemek için plakayı Parafilm ile sıkıca kapatın. Mühürlü plakayı santrifüje yerleştirin ve her bir kuyucuğun dibindeki hücreleri peletlemek için iki dakika boyunca 200 G'de çalıştırın.

Plakayı santrifüjden çıkarın. Parafilmi dikkatlice çıkarın ve plakayı %5 karbondioksit içeren 37 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin. Bir kaplama çözeltisi hazırlamak için, beş miligram Poli-D-Lizin'i 50 mililitre steril suda çözün ve çözeltiyi tamamen eriyene kadar iyice karıştırın.

Metabolik tahlil plakasının her bir oyuğuna 30 mikrolitre kaplama çözeltisi ekleyin. Plakayı hafifçe sallayarak veya fazla çözeltiyi aspire ederek kabarcık olmadığından emin olun. Plakayı kapak açıkken oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin, ardından kaplama solüsyonunu aspire edin ve kuyucukları 200 mikrolitre steril su ile iki kez yıkayın.

Plakayı en az 30 dakika havayla kurutun, ardından kaplamayı stabilize etmek için plakayı karbondioksit olmadan 37 santigrat derecede 30 dakika ısıtın. Daha sonra, her bir kuyucuğa 175 mikrolitre önceden ısıtılmış ortam ekleyin. Plakayı, hücre sferoid transferine hazır olana kadar karbondioksit içermeyen bir inkübatörde 37 santigrat derecede tutun.

Beş günlük kültürden sonra sferoid plakaları yüksek içerikli bir görüntüleme sistemine aktarın. Görüntüleme parametrelerini yapılandırmak için sıcaklığı 37 santigrat dereceye ve karbondioksit seviyesini %5'e ayarlayınSistem ayarlarında plaka tipini, kanalları ve odak aralığını ayarlayın. Ardından, 10 kat objektifli bir konfokal mikroskop ve görüntüleme yazılımı kullanarak küresel görüntüler elde edin, ardından bozulmamış sferoidler içeren kuyucukları belirleyin ve transfer için konumlarını kaydedin.

Bozulmamış sferoidleri, fenofibrat tedavisi için altı kopya kuyucuğuna sahip bir kontrol grubu ve altı kopya kuyucuğuna sahip bir tedavi grubu olmak üzere iki gruba atayın. Fenofibrat çalışma solüsyonunu taze ön ısıtma ortamında optimum konsantrasyonda hazırlayın. Düşük bağlantı plakası içeren sferoidi görüntüleme sisteminden dikkatlice çıkarın ve bir biyogüvenlik kabini içindeki steril bir yüzeye yerleştirin.

Poli-D-Lizin kaplı tahlil plakasını transfer için yanına yerleştirin, ardından hücre sferoidlerinin hasara yol açmadan nazikçe aspire edilmesini sağlamak için 20 mikrolitrelik bir pipetin ucunu kesin. Kesilmiş pipet ucunu kullanarak, her bir sağlam küreyi kuyucuğunun dibinden yavaşça aspire edin. Her bir küreyi kaplanmış plakanın karşılık gelen kuyusuna aktarın ve 20 saniye oturmasına izin verin.

3D küresel tahlil plakalarını yüksek içerikli bir görüntüleme sistemine aktarın. Morfolojik verileri analiz etmek için, görüntü içeriğini doku özelliklerine göre üç kümeye bölerek 3B küreleri arka plandan kabaca ayırmak için doku bölgesi modülünü uygulayın. Hacme dayalı boyut özelliklerini kullanarak önceden izole edilmiş 3D sferoidlerin ayrımını iyileştirmek için görüntü bölgesi bul modülünü uygulayın, safsızlıkların giderilmesini ve bozulmamış sferoidlerin korunmasını sağlayın.

Morfoloji özellikleri modülünü kullanarak 3B sferoidlerin morfolojik parametrelerini ölçün. Yalnızca orijinal 3D hücre sferoidlerini filtrelemek ve saklamak için popülasyon seçme modülünü uygulayın, ardından morfolojik veri sonuçlarını dışa aktarın. Sferoidler, kültürün beşinci gününde gözle görülür şekilde oluştu ve gözlemlenen tüm örneklerde tek tip bir küresel morfoloji korundu.

Beşinci günde yapısal bütünlüğü gözle görülür şekilde bozulmuş parçalanmış bir küresel de gözlendi. Transfer sonrası analiz, hem kontrol hem de fenofibrat ile muamele edilmiş 3D sferoidlerin çoğu durumda bozulmadan kaldığını, ancak fenofibrat ile muamele edilmiş bazı sferoidlerin parçalandığını ortaya koydu. Fenofibrat ile tedavi edilen sferoidlerde oksijen tüketim oranı, kontrol grubuna kıyasla tüm zaman noktalarında önemli ölçüde azaldı.