Büyük, yeniden kapatılabilir kranial pencere için cerrahi protokol, fare varsayılan modu ağının uzunlaması, çok modlu elektrofizyoloji kayıtlarını mümkün kılan

Varsayılan Mod Ağı veya DMN, depresyon gibi çeşitli bilişsel işlevler ve nöropsikiyatrik bozukluklarla ilişkilendirilen, çok önemli ve geniş ölçekli bir ağdır. DMN'nin hayvan modellerinde karmaşık dinamiklerini incelemek, hem sağlıklı hem de patolojik durumlarda işlevi hakkında paha biçilmez bilgiler sağlar. Ancak, önemli bir zorluk, uyanık ve davranışlı farelerden birden fazla derin ve dağıtık düğüm olan DMN'den stabil, uzun vadeli ve büyük ölçekli elektrofizyolojik kayıtlar yapmak olmuştur.

Burada, Eero Castren laboratuvarında geliştirilen yeni iki fazlı cerrahi protokolü sunuyoruz. Bu teknik, aynı anda 1.000'den fazla elektrot kanalından tekrarlanan boylamasına kayıtların yapılmasını sağlayan büyük, dayanıklı ve yeniden kapatılabilir bir kranial pencere oluşturur. Bu, yüzey düzeyindeki mikro-elektrokortikografi, mikro-ECoG ile iki Neuropixels probu birleştirilerek Varsayılan Mod Ağı'na eşi benzeri görülmemiş erişim sağlanır.

Bu video, hayvan hazırlığı ve başlık plakası implantasyonundan kronik kraniyal pencerenin oluşturulmasına kadar bu sağlam cerrahi prosedüre adım adım bir rehber sunacak ve ağ sinirbilimi araştırmaları için yüksek kaliteli ve uzun vadeli veri toplama sağlanmasını sağlayacak. Gösterilen tüm prosedürler Finlandiya'daki Ulusal Deney Kurulu tarafından onaylanmış ve bilimsel amaçlarla kullanılan hayvanların korunmasına ilişkin Avrupa direktifine uygundur. Aşama 1, Hayvan Hazırlığı ve Baş Plakası Implantasyonu.

Bu işlemi gerçekleştirmek için gerekli tüm cerrahi malzemeler ve ekipmanları hazırlamaya başlayın. Fareyi %4 izofluran ile anestezi edin ve anesteziyi %1,5 ila %2,5 arasında tutun ve dakikada 0,5 litre oksijen akışı sağlansın. Başın üstündeki tüyleri tıraş edin ve hayvanı, işlem boyunca vücut sıcaklığını 37 derece Celsius tutacak şekilde kalibre edilmiş dahili sıcaklık sensörüyle donatılmış kontrollü bir ısıtma pedine yerleştirin.

Korneanın kurumasını önlemek için karbonhidrat göz merhemi uygulayın. Fareyi stereotaktik çerçeveye sabitleyin, böylece kafatası düz yatacak ve ameliyat öncesi ağrı aljezikleri ve anti-enflamatuar maddeleri deri altı enjeksiyonlar, Karprofen, Buprenorfin ve Deksametazon ile verin. tıraş edilmiş bölgeyi povidon-iyot çözeltisiyle dezenfekte edin ve saç derisi derisi altına lokal anestezi olarak lidokain-epinefrin solüsyesi enjekte edin.

Kulak hattında küçük bir enine kesi yapın ve kesiyi kademeli olarak büyüterek kafatasının üst kısmını tamamen ortaya çıkarın. Açık kafatasını asetonla dikkatlice temizleyin, tüm görünür periost çıkarıldığında implantın güçlü yapışmasını sağlayın. Aseton yıkamasının tamamen çözmediği kalıntı periost ve bağ dokusu parçalarını çıkarmak için küt, dairesel bir bistüri bıçağı kullanın.

Stereotaktik cihazla, kafatasında bregmaya göre 4 milimetre x 7,6 milimetre dikdörtgen bir alan işaretleyin. Dikdörtgen, bregmadan her iki tarafta yanlara doğru iki milimetre, rostrálisan üç milimetre ve kaudalde 4,6 milimetre uzanmalıdır. Sonra, sağ yarımküredeki iki intrakraniyal prob yerleştirme noktasını işaretleyin.

Rostral prob bölgesini bregmadan 1,66 milimetre ön ve 1,95 milimetre lateral olarak, kaudal prob bölgesini ise bregmadan 2,2 milimetre arka ve 1,9 milimetre lateral olarak işaretleyin. Sonra, belirlenen pencere alanının dışındaki tüm açık kemik yüzeylerine 11 numaralı cerrahi bıçak kullanarak çapraz bir desen kazınır ve yaklaşık 0,2 ila 0,4 milimetre derinliğinde sığ ama belirgin bir oluk oluşturarak yaklaşık bir milimetre karelik tekiz bir ızgara oluşturur. Steril bir 30G iğnesini pamuk çubuğunun ucuna takarak ince bir yapıştırıcı uygulayıcı oluşturun ve iğneyi V şeklinde bükebilirsiniz.

Siyanoakrilat yapıştırıcıyı tek kullanımlık plastik tartı botuna dağıtın ve aplikatörü yapıştırıcı deposuna batırın. Her açık ve kazılı kemik yüzeyine yapıştırıcı uygulayın; her site başına tek bir depozito uygulamak gerekir, böylece kapsam kapsamlı olur ama asla aşırı olmaz. Yapıştırıcıyı yedi dakika kurutmadan sonra devam edin.

Referans yuvasının implantasyonu için, görünür yüzeysel damarlardan kaçınmak için sol beyincik pozisyonunun üzerindeki delme noktasını seçin. Pilot deliği beş ila on saniyelik patlamalarla 20.000 ila 25.000 mermi hızında yuvarlak çelik burr kullanarak delin, delik daha saydam hale gelene kadar ve açık pembe bir ton ortaya çıkın. Altın kaplamalı referans soketi pilot deliğe yerleştirin, siyanoakrilat yapıştırıcı ile sabitleyin ve bağlantı noktasını UV ile kürlenebilen diş çimentosu ile güçlendirin.

Diş çimentosunu LED kürleme kalem ışığı ile bir dakika boyunca kürleyin. Sonra, açık rostral kemiğin tepesine az miktarda UV ile kürlenebilen diş çimento yerleştirin ve baş plakasını kafatasının altına yerleştirin; böylece bir kenar diş çimento iskelesine dayanır, referans yuvasının etrafında kürlenir, karşı kenar ise taze rostral çimento dalasına dayanır. Baş plakasının ortalanmış ve düz olduğundan emin olun.

Yapıyı güçlendirmek için baş plakasının tabanına diş çimentosu uygulanır ve kazınmış kemik ile referans yuvası çevresinde sürekli ve kapalı bir muhafaza oluşur ve gelecekteki kraniyal pencerenin çevresinde sürekli kapalı bir muhafaza oluşur. Son olarak, diş çimentosunu LED kürleme kalem ışığı ile bir dakika boyunca kürledim. Çimento tamamen kürlendikten sonra, farenin anesteziden uyanmasına izin verin.

İlk aşama artık tamamlandı. Bir sonraki aşamaya geçmeden önce farenin en az 48 saat toparlanmasına izin verin. Aşama 2, Kronik Kranial Pencere Oluşturma.

İkinci aşama, birinci aşama ile aynı aletler ve ilaçları gerektirir, ancak lokal anestezi kullanılır. Ayrıca, bu aşama steril, ince bir PDMS membranı, buzda tutulan soğuk yapay beyin omurilik sıvısı, elastomer silikon sızmazlık maddesi ve özel 3D baskılı koruyucu bir kapağı gerektirir. İlk ameliyattan en az 48 saat sonra, fareyi izofluran ile yeniden anestezi edin, stereotaktik çerçevedeki ısıtma pedine yerleştirin ve ameliyat öncesi ilaçları lidokain-epinefrin lokal anestezi dışında birinci aşamadaki gibi verin.

Diş matkapıyla kemiği inceltmeye başlayın; Phase 1'de işaretlenen dikdörtgen hattı boyunca, delme cihazını kemik yüzeyine göre 90 derece açıyla tutarak dakikada 25.000 tur hızından başlayın ve dikdörtgen kenarları boyunca bir veya iki biraz daha derin geçiş yaparak ilk kesme yivini oluşturun. İki prob yerleştirme koordinatlarında kranial pencerenin bitişiğindeki kemik ve diş çimentosuna sığ oluklar açın. Bu oluklar, kemik flebi çıkarıldıktan sonra da görünür kalan kalıcı görsel işaretler olarak hizmet eder ve sonraki elektrofizyolojik seanslarda intrakraniyal probların tekrar tekrar konumlandırılması için kullanılır.

Sondaj boyunca buz gibi soğuk, steril yapay beyin omurilik sıvısı uygulayarak alttaki kortekste termal hasarı önlemek ve kanamayı en aza indirmek için düzenli olarak kullanın. Kemik inceledikçe matkap hızını dakikada 20.000 mermiye kademeli olarak düşürün. Dikdörtgen çevresi boyunca delme işlemi devam ettirin, ta ki kontur içindeki kemik yaklaşık %90 incelene kadar.

Kafatasını tamamen delme. İnce kavisli dura kancasına geçin. Ucu ince kemiğin kenarının altına son derece dikkatli bir şekilde yerleştirin ve kancayı pencere çevresi boyunca kaydırın; kemik kapağını çevre kafatası ve alttaki dokudan dikkatlice ayırın.

Başarıyla ayrılan kemik kapağını dura kancası ile dikkatlice arkadan öne doğru kafatası yüzeyinin yaklaşık 35 derece yukarısına kaldırın. Forsepsle kaldırılmış kenarı tutun ve plaka tamamen açılana kadar hafifçe sağa sola ve sağa sallayın. Açık bölgeyi pıhtılaşmış kandan nazikçe temizleyin ve buz gibi ACSF ile tekrar tekrar yıkama yapın.

Döküm geçtikten sonra dural yüzeyin altına doğrudan tek bir steril prekast PDMS membranı yerleştirin. Doğru boyutta olduğunda, pencereyi tam olarak kapatır ve duraya pasif bir şekilde yapışarak beyne yaslar. Kraniotomiyi silikon sızdırmazlık maddesi uygulayarak mühürleyin.

Diş çimento muhafazası ile baş plakanın iç kenarı arasındaki her yarığı doldurun, BDMS membranının kenarlarını tamamen çevreleyip üst üste örtün. Kayıt oturumları arasında pencereyi korumak için başlık plakasına az miktarda siyanoakrilat yapıştırıcı ile özel 3D baskılı koruyucu bir kapak takın. Fare artık iyileşmeye hazır ve implantın hasarını önlemek için bireysel barınma için ev kafesine nakledilmelidir.

Başarılı bir ameliyat, korteks üzerinde net ve şeffaf bir pencere sağlar; görünür damarlar ve minimum iltihap veya enfeksiyon belirtisi bulunur. Bu netlik 21 günden fazla sürdürülebilir ve uzun vadeli uzunlamasına çalışmalar yapılmasını mümkün kılar. Kronik pencereden kaydedilen ham elektrofizyolojik sinyaller, boylamasına zaman çizelgesi boyunca yüksek kaliteyi korudu.

Burada, posterior retrosplenial ızgaradan örneklenen temsil genişbant mikro-ECoG izleri ve yüzeysel kortikal kanaldan alınan eşzamanlı intrakraniyal prob lokal alan potansiyel izleri, ilk kayıt günü ve sonraki 21 gün boyunca yan yana gösterilir. 21. Gün kayıtları, aynı hayvandan alınan Gün 0 kayıtlarına kıyasla benzer sinyal genliği, spektral içerik ve hareket ile gürültü artefaktlarının eksikliği sergiler; bu da ne PDMS membranının ve silikon mühürünün kronik varlığının ne de tekrarlanan dural deliklerin, bozulmanın önce ortaya çıkacağı yüzeysel kortikal katmanlarda yüzey veya intrakraniyal prob sinyal kalitesinde algılanabilir bozulmaya yol açmadığını doğrulamaktadır. Bu tekniğin temel doğrulaması, zaman içinde stabil, yüksek kaliteli çok modlu elektrofizyolojik verilerin elde edilmesidir.

Yeniden kapatılabilir pencere, aynı nöronal popülasyonlardan haftalar boyunca kaydetmek için probların tekrar tekrar yerleştirilmesine olanak tanır. Alfa-bandı boyunca, kaudal yüksek yoğunluklu intrakranial elektrot probu boyunca kanallardan hesaplanan faz kilitleme değer matrisleri, başlangıç ile 21. gün tedavi sonrası seans arasında stabil bir fonksiyonel mimari gösterir. Bu, aynı bireysel nöronların resmi izi yerine aynı kortikal konuma tekrarlanabilir yeniden yerleştirmeyi gösterir.

Şaftın küçük arakesme transleksiyonu aynı birim iddiasını engellese de, alfa-bant etkileşimlerinin toplam laminar ve bölgesel yapısı korunur ve bu da kronik pencerenin aynı fonksiyonel devrenin uzunlamasına örneklemesine izin verdiğini destekler. Kronik pencerenin aynı derin yapıların oturumlar boyunca tekrarlanabilir laminar hedeflenmesini doğrudan desteklediğini doğrulamak için, sondaların LFP kanallarından akım kaynak yoğunluğu veya CSD haritaları hesaplandı. Uyarıcı tarafından uyarılan CSD profilleri, prelimbik korteks ve ön singulat alanı dahil olmak üzere beklenen laminar sink kaynak imzalarının seanslar arasında korunduğunu gösterir.

İki oturum arasındaki laminar güç profili örtüleri seanslar arasında oldukça benzerdir ve Pearson korelasyonu 0.81'dir. İkincil motor kortekste gözlemlenen farklılıklar muhtemelen kayıtlar arasındaki hareket farklılıklarından kaynaklanmaktadır. CSD çizimleri anatomik bilgi taşıdığı için, her probun şu anda hangi beyin bölgelerini örneklediği seans içinde, terminal olmayan bir okuma sağlayabilir; bu da ölüm sonrası doku boyalarından bağımsız olarak hangi beyin bölgelerini örneklediğini gösterebilir.

Seanslar arasında yüzey mikro-ECoG yerleşiminin tekrarlanabilirliği, intrakraniyal CSD okumasından bağımsız olarak nicelendirilir. 0. ve 21. Gün mikro-ECoG ızgarasından hesaplanan bant sınırlı uzamsal güç haritaları üst üste bindirilir ve iki haritanın piksel bazında korelasyonu rostral ve kaudal alt ızgaralar için ayrı ayrı hesaplanır. Alt ızgara profili korelasyonları yüksek kalır ve iki oturumun mekansal barkodları, dizinin hem rostral hem de kaudal yarılarında aynı kortikal güç sıcak noktalarını gözle görülür şekilde aynı yere yerleştirmiştir.

Bu nedenle, saydam ızgaradan görünen sinüzoidal hizalama kuyruğu ve sonda yerleştirme koordinatlarındaki kazıklı kemik olukları, 21 günlük boylamsal aralık boyunca mikro-ECoG yerleşiminin milimetre ölçeğinde tekrarlanabilirliğini destekler. Tekniği daha da doğrulamak için, kraniotomi ameliyatından yaklaşık dört hafta sonra ölüm sonrası beyin dilimlerinde GFAP ve IBA1 için immünohistokimyasal boyamalar yapıldı. GFAP, beyin hasarı veya iltihaplanma gibi reaktif gliozlarda yukarı regüle edilen astrositler tarafından ifade edilir.

IBA1 ise nöroinflamatuar süreçlerde daha aktif olan mikroglia tarafından ifade edilir. Doğrulama kohortu, tam iki aşamalı ameliyatın yapıldığı ve ardından ameliyat sonrası 0, 21 ve 22. günlerde kranial pencerenin üç kez yeniden açıldığı hayvanlardan oluşuyordu. Ancak, bu kohortta mikro-ECoG yerleştirme veya intrakraniyal prob yerleştirme yapılmadı.

Pencere, elektrofizyolojik kayıt sırasında olduğu gibi seanslar arasında yeniden kapatıldı. Bu kohort, kronik pencerenin ve tekrarlanan dural maruziyetin inflamatuar katkısını prob kaynaklı doku hasarından izole eder. Ameliyatsız kontrol grubu ile ameliyat yapılan araç grubu arasında belirteçlerin herhangi birinde anlamlı bir fark gözlemlenmedi.

Bu temsil mikrograflar, pencerenin hemen altındaki bölgede reaktif gliosis veya mikroglial aktivasyonla ilgili niteliksel bir kanıt göstermemektedir. Ancak, prob yörüngesine yakın ve prob yerleştirme yarımküresinde mikroglial ve astrosit aktivasyonunda hafif bir artış gözlemlendi; bu muhtemelen intrakraniyal probun çok yüksek yerleştirme hızından kaynaklanabilir. Başarılı ameliyat, minimal iltihaplanma ile korteks üzerinde net ve şeffaf bir pencere sağlar.

Kronik tedavi sürecinden sonra bazı beyin şişlikleri oluşabilir. Bu durum dikkatli izlenerek ve gerekirse ek analjeziklerin uygulanmasıyla yönetilebilir. Kayıtlar için sadece kapağı ve sızdırmazlık maddesini çıkarın, mikro-ECoG ızgaralarını ve Neuropixels problarını yerleştirin ve uyanık, davranan hayvandan veri toplamaya başlayın.

Özetle, bu iki aşamalı cerrahi protokol, farelerde büyük, kronik bir kranial pencere oluşturmak için güvenilir ve son derece etkili bir yöntem sunar. İşlemin temel avantajları, duraya minimum hasar vermesi ve sağladığı geniş pozuziyetdir; bu da hem yüzeydeki mikro-ECoG ızgaralarının hem de birden fazla derin beyin Neuropiksel probunun eşzamanlı yerleştirilmesi için kritik öneme sahiptir. Bu yöntem, DMN ve diğer büyük ölçekli devrelerde ağ genelinde elektrofizyolojik dinamiklerin eşi benzeri görülmemiş uzunlamasına incelemesini mümkün kılar.

Bu, karmaşık davranışların sinirsel temelleri ve beyin bozukluklarının patofizyolojisi üzerine daha derin araştırmaların kapısını açar ve nihayetinde yeni terapötiklerin geliştirilmesine yardımcı olur.