Name: Herstellung eines mikrofluidischen Vorrichtung für die Abschottung der Neuron Soma und Axonen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-22T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung einer mikrofluidischen PDMS-Vorrichtung zur Kultivierung von Neuronen mit räumlicher Trennung von Soma und Axonen. Diese Methode ermöglicht gezielte Behandlungen und die Isolierung reiner axonaler Fraktionen für die Neurowissenschaft.

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Teil 1: Vorbereiten des mikrofluidischen Neuron Gerät <ol><li> A 3 &quot;Silizium-Wafer mit einem Muster aus der SU-8 durch Photolithographie hergestellt wird verwendet, um die Polydimethylsiloxan (PDMS) mikrofluidischen gegossen. Wir verweisen auf die SU-8 gemusterten Silizium-Wafer als Master Formen, oder&quot; Meister &quot;. </li><li> PDMS mit Härter bei aw / w-Verhältnis von 10:1 vermischt wird, das heißt, für 10 Gramm PDMS ist 1 Gramm Härter dazugegeben. </li><li> Die PDMS ist dann gut gemischt und gegossen auf den Silizium-Wafer. Die Silizium-Wafer ist in einem 10 cm Polystyrol-Petrischale enthalten. Es dauert etwa 12 g bis 15 g PDMS an den Master mit einer Dicke von ca. 4 mm abdecken. </li><li> Der Meister mit dem PDMS wird dann in einem Vakuumexsikkator mit dem Deckel der Petrischale gelegt, und Vakuum angelegt. Dies geschieht zur Beseitigung von Luftblasen aus der PDMS, dass beim Rühren in der Härter eingeführt wurden. Es dauert etwa 15 Minuten für die Luftblasen zu entfernen. </li><li> Der Meister mit PDMS ist aus dem Exsikkator entfernt. Ein Luftgewehr mit einem 0,45 um Filter verwendet wird, um alle verbleibenden Luftblasen zu entfernen. </li><li> Der Master ist dann auf einer 80 ° C heißen Platte für 1 Stunde zu heilen platziert. </li></ol> Hinweis: Wenn einem Vakuumexsikkator nicht verfügbar ist, kann der Master bei Raumtemperatur für mehrere Stunden verlassen werden. Die Luftblasen verschwinden dann schließlich auf eigene Faust zu zerstreuen. Wenn eine heiße Platte nicht verfügbar ist, wird die PDMS bei Raumtemperatur nach 24 Stunden aushärten. Hinweis: Es ist auch wichtig, um sicherzustellen, dass der Master-Ebene wird während der Aushärtung. Teil 2: Ausschneiden des Neurons Mikrofluidikvorrichtung <ol><li> Sobald die PDMS auf dem Master geheilt ist, ist es zu einer sauberen Haube genommen. </li><li> Mit einem Skalpell wird ein Kreis um den Umfang der Geräte senken. Wenn man fügt die Klinge in den PDMS, ist es wichtig, den Kontakt mit dem Silizium-Wafer zu machen, sondern um nicht zu viel Druck auf den Wafer, sonst wird der Meister zu knacken. </li><li> Mit einem Kreis schneiden den ganzen Weg um die Geräte (es gibt 4 Geräte pro 3 &quot;Silicon Master), wird die PDMS vorsichtig von der Master-gehoben. Das durch vorsichtiges Drehen des Skalpells gestartet werden kann, wie es in den vorherigen Schnitt eingeführt wird . </li><li> Als nächstes werden Reservoirs in das Gerät mit einem 8 mm Gewebebiopsie gestanzt. </li><li> Die Geräte werden dann geviertelt und überschüssiges PDMS getrimmt, so dass das Gerät ordentlich fit zu Corning Deckglas (Nr. 1) 24 mm x 40 mm. Stickstoff Luft wird verwendet, um wegblasen überschüssige Ablagerungen. Hartnäckige Verschmutzungen können auch unter Verwendung von 3M Scotch Brand 471 Vinylband werden. </li></ol> Teil 3: Plasma Bindung der Geräte an Glasdeckgläschen. <ol><li> Plasma Cleaner ist zur Bindung A Harrick das Neuron Geräte an die Deckgläser verwendet. Kurz gesagt, werden die Geräte in der Plasma-Reiniger montiert und eine Vakuumpumpe wird verwendet, um Luft aus der Kammer zu evakuieren. </li><li> Nach der Vakuum-Druck 300 milliTorr erreicht hat, ist die Macht an die elektrische Spule eingeschaltet und auf hoch. </li><li> Die elektrische Spule erzeugt Plasma &quot;, ein teilweise ionisiertes Gas aus Elektronen, Ionen und neutralen Atomen oder Molekülen&quot; - <a href="http://www.harrickplasma.com/plasma_physics.php">http://www.harrickplasma.com/plasma_physics.php</a> , aus der restlichen Luftmoleküle in der Kammer links. Das Plasma erzeugt reaktive Spezies auf der Oberfläche des Glases und das Gerät, das bei platziert zusammen eine dauerhafte Verbindung bilden. Das Plasma dreht sich auch die Oberflächen hydrophil, was erleichtert die Zugabe von Flüssigkeiten hilft. Zudem sterilisiert der Plasma-Reiniger der Geräte. Die Oberfläche des PDMS-Gerät, das die Mikrofluidikvorrichtung enthält, ist offen ausgelegt in die Plasma-Reiniger zusammen mit dem Glasträger. Das Plasma behandelten Oberflächen der Glas-und Mikrofluidik-Gerät sind in Kontakt miteinander auf einer sauberen Werkbank montiert, dann in sterile 60 mm Schalen gelegt. Die behandelten Oberflächen bilden einen dichten irreversible Bindung. </li><li> Innerhalb von 10 Minuten von Plasma-Bindung der Geräte an Glas, Poly-L-Lysin (PLL) mit dem Gerät aufgenommen. Nach 10 Minuten wird die Hydrophilie des Gerätes verringern so dass es schwierig für die PLL auf das Gerät gelangen. Hinweis: Es ist wichtig, auf Luftblasen in das Gerät nach der Zugabe von PLL überprüfen. Luftblasen in den Hauptkanal sind unerwünscht, da sie Zellen würden oxidieren. Eine einfache Methode, um alle vorhandenen Luftblasen zu entfernen ist es, ein P200-Pipette mit 150 ul der Flüssigkeit (in diesem Fall PLL) gefüllt verwenden, legen Sie die Spitze direkt an der Eröffnung der Hauptkanal, und drücken Sie den P200 mit Nachdruck. Diese müssen eventuell mehrmals wiederholt werden, aber schließlich die Kraft aus der Pipette wird die Blasen austreiben. </li><li> Die Geräte mit PLL dürfen inkubieren über Nacht in einem Standard-Gewebekultur-Inkubator bei 37 ° C mit 5% CO 2. </li><li> Am nächsten Tag, dem deLaster sind zweimal schnell hintereinander mit autoklaviertem dH2O gespült. Während dieses Prozesses wird die Flüssigkeit nie ganz aus der Hauptkanäle entfernt, nur aus den Reservoirs. Entfernen von Flüssigkeit aus den wichtigsten Kanäle einführen Blasen. Nach 2 schnellen spült, sind die Geräte mit autoklaviertem dH2O gefüllt und wieder in den Inkubator für ein Minimum von 3 Stunden gesetzt, oder über Nacht. </li><li> Am nächsten Tag sind die Geräte wieder 2 mal schnell mit autoklaviert dH2O gespült. Dann wird neuronalen Basalmedien, enthält die notwendigen Ergänzungen B27 und Glutamax zur Kultivierung von primären Ratten-Neuronen, die Geräte hinzugefügt. Die Geräte sind zurück in den Inkubator für die zukünftige Verwendung platziert. Die Geräte sind nun bereit für die Aussaat von Neuronen. </li></ol>

<ol><li>Park, J. W., Vahidi, B., , A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research.%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> Nat Protoc. 1, 2128-2136 (2006).</li>
<li>Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury%2C+regeneration+and+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nat Methods. 2, 599-605 (2005).</li>
</ol>

In diesem Video haben wir gezeigt, wie man und bereiten eine PDMS Mikrofluidik-Gerät, das wir verwenden, um Kultur Neuronen in. Das Gerät ermöglicht es uns, eine reine axonalen Fraktion durch Mikrorillen aus dem Fach mit einer Mischung aus Zellkörper, Dendriten und Axone getrennt zu erhalten . Diese Geräte ermöglichen dem Forscher die Auswirkungen der verschiedenen Behandlungen Studie sowie eine Plattform für die Durchführung des Körpers auf die Axone und beobachten, welche Auswirkungen diese Behandlungen sind auf die Neuronen. Das Gerät bietet auch ein Niveau von um Kultivierung Neuronen, erleichtern den Transport Studien hilft. Darüber hinaus ermöglicht die Mikrorillen, die die Zellkultur-Fach getrennt von der Axon-Fach, für fluidische Trennung zwischen den beiden Kammern macht es möglich, eine Seite des Geräts, ohne die andere Seite des Geräts direkt mit der Behandlung zu behandeln. Diese Eigenschaft erlaubt es dem Forscher, um Effekte wie Signaltransduktion und Transport, die sich aus der Behandlung zu untersuchen.

<table><tbody><tr><td>PDMS</td><td>Reagenz</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>Sylgard 184 mit Härter. Bitte wenden Sie sich an Dow Corning, um einen Händler in Ihrer Nähe zu finden</td></tr><tr><td>Plasma-Reiniger</td><td>Werkzeug</td><td>Harrick Scientific Products, Inc.</td><td></td><td>http://www.harrickplasma.com/</td></tr><tr><td>Neuronales Basalmedium</td><td>Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td>Das neuronale Basalmedium wird von Invitrogen im Rahmen ihrer Gibco-Reihe von Zellkultur-Reagenzien bezogen.</td></tr><tr><td>B27</td><td>Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>B27 ist ein proprietäres Supplement, das über Invitrogen im Rahmen ihrer Gibco-Reihe von Zellkultur-Reagenzien erhältlich ist.</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td>Glutamax ist über Invitrogen im Rahmen ihrer Gibco-Reihe von Zellkultur-Reagenzien erhältlich.</td></tr><tr><td>Cornig No. 1 Deckglas</td><td>Deckglas</td><td>Corning</td><td>Corning No. X2935 244</td><td>Erhältlich über Fisher Scientific, Fisch-Katalognummer 12-531D</td></tr><tr><td>60-mm-Petri-Schale</td><td>Werkzeug</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-13A</td><td>60-mm-Polystyrol-Steril-Petri-Schalen dienen zur Aufnahme der an Glas gebundenen Vorrichtung.</td></tr><tr><td>BD Falcon 50-ml-Röhrchen</td><td>Werkzeug</td><td>BD Biosciences</td><td>Falcon No. 352098</td><td>Erhältlich über Fisher Scientific, Katalognummer 14-959-49A</td></tr><tr><td>BD Falcon 15-ml-Röhrchen</td><td>Werkzeug</td><td>BD Biosciences</td><td>Falcon No. 352097</td><td>Erhältlich über Fisher Scientific, Katalognummer 14-959-70C</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-1274</td><td></td></tr><tr><td>Neuer Artikel</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

herstellung eines mikrofluidischen vorrichtung für die abschottung der neuron soma und axonen

Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons

In diesem Video zeigen wir die Technik der weichen Lithographie mit Polydimethylsiloxan (PDMS), die wir verwenden, um eine Mikrofluidikvorrichtung zur Kultivierung von Neuronen herzustellen. Zuvor war ein Silizium-Wafer mit dem Entwurf für das Neuron Mikrofluidikvorrichtung mit SU-8 und Photolithographie zu einem Master-Werkzeug zu schaffen, oder das, was wir uns einfach als &quot;Master&quot;-Muster. Anschließend gießen wir das Silizium-Polymer PDMS auf der Oberseite des Meisters, die dann durch Erhitzen des PDMS zu 80 ° C für 1 Stunde ausgehärtet. Die PDMS bildet eine Negativform des Gerätes. Das PDMS wird dann sorgfältig geschnitten und weg von der Master-gehoben. Löcher gestanzt werden, wo die Lagerstätten werden und der überschüssige PDMS getrimmt vom Gerät weg. Stickstoff wird verwendet, um wegblasen überschüssige Ablagerungen aus dem Gerät. An diesem Punkt sind die Geräte jetzt einsatzbereit und kann entweder nach Corning Nr. 1 Deckglas mit einem Plasma-Sterilisator / Reiniger oder reversibel an das Deckglas, indem Sie einfach das Gerät auf der Oberseite des Deckglases gebunden gebunden. Die reversible Bindung des Gerätes an Glas wird in einem separaten Video abgedeckt und erfordert zunächst, dass das Gerät entweder mit 70% Ethanol oder durch Autoklavieren sterilisiert werden. Plasma Behandlung sterilisiert die Geräte, so dass keine weitere Behandlung notwendig ist. Es ist jedoch wichtig, wenn Plasma-Behandlung der Geräte, um die Flüssigkeit hinzufügen, um die Geräte innerhalb von 10 Minuten die Plasma-Behandlung, während die Oberflächen noch hydrophil sind. Warten länger als 10 Minuten, um Flüssigkeit hinzufügen, um das Gerät macht es schwierig für die Flüssigkeit auf das Gerät gelangen. Das Neuron-Geräte sind typischerweise Plasma-bound auf Glas und 0,5 mg / ml Poly-L-Lysin (PLL) in pH 8,5 Boratpuffer Abdeckung wird sofort an das Gerät hinzugefügt. Nach mindestens 3 Stunden Inkubation mit PLL, sind die Geräte mit dH2O Wasser mindestens 3-mal mit mindestens 15 Minuten zwischen jeder Wäsche gewaschen. Als nächstes wird das Wasser entfernt und frisches Medium ist, um das Gerät hinzugefügt. An dieser Stelle ist das Gerät einsatzbereit. Es ist wichtig, an dieser Stelle daran erinnern, niemals entfernen Sie alle Medien aus dem Gerät. Lassen Sie immer Medien in den Hauptkanal.

In diesem Video zeigen wir die Technik der weichen Lithographie mit Polydimethylsiloxan (PDMS), die wir verwenden, um eine Mikrofluidikvorrichtung zur Kultivierung von Neuronen farbricate.

Herstellung eines mikrofluidischen Vorrichtung für die Abschottung der Neuron Soma und Axonen

In diesem Video demonstrieren wir die Technik der Soft-Lithografie mit Polydimethylsiloxan (PDMS), die wir zur Herstellung eines mikrofluidischen Bauteils für ... verwenden.

Willkommen im Labor von Dr. Newly John. Das John-Labor ist auf die Entwicklung mikrofluidischer Plattformen für biologische Anwendungen spezialisiert. In diesem Video demonstrieren wir die Herstellung und Anwendung eines mikrofluidischen Geräts, das zur Kompartimentierung und Kultivierung von primären Neuronen konzipiert ist.Die Neuronenvorrichtung wurde erstmals im August 2005 in Nature Methods veröffentlicht. Seit ihrer Einführung wurde die Neuronenvorrichtung weltweit von zahlreichen Kooperationspartnern umfassend genutzt. Die Neuronenvorrichtung besteht aus einem Stück PDMS, das auf einem Siliziumwafer abgegossen wurde, der ein mittels Photolithographie zuvor erzeugtes SUA-Muster der Vorrichtung enthält.Die Vorrichtung weist drei Hauptmerkmale auf: vier Reservoire mit einem Durchmesser von acht Millimetern, zwei Hauptkanäle, die jeweils 1,5 Millimeter breit, sieben Millimeter lang und hundert Mikrometer hoch sind, sowie Mikrorillen, die 10 Mikrometer breit und drei Mikrometer hoch sind und die beiden Hauptkanäle verbinden. Die Mikrorillen können in ihrer Länge zwischen 150 Mikrometern und 900 Mikrometern variieren, wobei die übliche Standardlänge 450 Mikrometer beträgt. Betrachtet man die Vorrichtung so, dass die Hauptkanäle und die Mikrorillen vertikal ausgerichtet sind, erkennt man, dass die Reservoire auf der linken Seite der Rillen über die Hauptkanäle miteinander verbunden sind, ebenso wie die Reservoire auf der rechten Seite.Dank dieser Eigenschaft kann Flüssigkeit durch den Hauptkanal fließen, was eine wichtige Funktion darstellt und das Beladen von Zellen sowie das Wechseln des Kulturmediums ermöglicht. Die Neuronenvorrichtung weist drei wesentliche Vorteile gegenüber herkömmlichen Zellkultursystemen auf. Erstens ermöglicht sie die kompartimentale Trennung von Zellkörpern oder Soma und den Axonen. Mit der Neuronenvorrichtung ist es möglich, reine axonale Fraktionen zu gewinnen.Die Größe und Länge der Mikrorillen ermöglichen es, dass Axone durch den anderen Hauptkanal hindurchtreten, während gleichzeitig verhindert wird, dass die Soma-Seiten übertreten. Zweitens lässt sich aufgrund des Gerätedesigns und der Nutzung des hydrostatischen Drucks entweder die Zellseite und/oder die Axonseite des Geräts getrennt behandeln, indem einfach das Volumen und die Reservoire auf einer Seite des Geräts höher gehalten werden als auf der anderen. Und drittens kann der rein axonale Anteil des Geräts durch Vakuumabsaugung abgetrennt werden, wodurch der Forscher die axonale Regeneration untersuchen und beobachten kann.Die Forscherin Hina Lee wird nun die Vorbereitung des mikrofluidischen Neuronengeräts demonstrieren. Ein drei Zoll großer Siliziumwafer mit einem durch Fotolithografie erzeugten Muster aus SU-8 dient zum Gießen der polydimethylsiloxanbasierten (PDMS) mikrofluidischen Form. Wir bezeichnen den mit SU-8 strukturierten Siliziumwafer als Urformen oder einfach als Master.PDMS wird mit dem Härter im Gewichtsverhältnis von 10 zu 1 gemischt. Das bedeutet beispielsweise 15 Gramm PDMS pro 1,5 Gramm Härter. Anschließend wird das PDMS gründlich vermischt und auf den Siliziumwafer gegossen.Der Siliziumwafer befindet sich in einer 10 cm großen Polystyrol-Petrischale. Um die MA mit einer Dicke von etwa vier Millimetern zu bedecken, werden ungefähr 12 bis 15 Gramm PDMS benötigt. Das Master mit dem PDMS wird dann in einen Vakuumexsikkator gestellt, wobei der Deckel der Petrischale abgenommen wird, und Vakuum angelegt.Dies dient dazu, Luftblasen aus dem PDMS zu entfernen, die während des Mischens des Härtemittels eingeführt wurden. Es dauert etwa 15 Minuten, bis die Luftblasen entfernt sind. Der Abgusskörper mit PDMS wird nach 15 Minuten aus dem Vakuum-Exsikkator entnommen.Es befinden sich noch einige verbleibende Blasen auf dem PDMS-Abformkörper. Eine Druckluftpistole mit einem 0,45-Mikron-Filter wird verwendet, um eventuell verbliebene Blasen zu entfernen. Anschließend wird der Abformkörper zur Aushärtung eine Stunde lang auf eine 80 Grad heiße Heizplatte gestellt.Wenn kein Vakuum-Exsikkator verfügbar ist, kann das Gemisch mehrere Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen werden. Die Luftblasen lösen sich schließlich von selbst auf. Wenn kein Heizblock verfügbar ist, härtet das PDMS nach 24 Stunden bei Raumtemperatur aus.Es ist wichtig sicherzustellen, dass der Master während des Aushärtungsprozesses waagerecht steht. Sobald das PDMS auf dem Master ausgehärtet ist, wird es mit einer chirurgischen Klinge in eine saubere Haube gebracht. Ein kreisförmiger Schnitt entlang des Umfangs der Vorrichtungen wird angebracht.Es ist wichtig, dass man die Klinge in das PDMS einführt, um Kontakt mit dem Siliziumwafer herzustellen, aber nicht zu stark auf den Wafer drückt, da sonst der Master mit einem kreisförmigen Schnitt rund um die Bauelemente bricht. Es befinden sich vier Bauelemente auf jedem dreizölligen Silizium-Master. Das PDMS wird vorsichtig vom Master abgehoben.Dies kann durch vorsichtiges Drehen der chirurgischen Klinge eingeleitet werden, während sie in den vorherigen Schnitt eingeführt wird. Bei den PDMS-Vorrichtungen auf der Form ist dies sehr dünn. Nach oben gerichtete Reservoire werden mit einer 8-mm-Gewebebiopsiepunch in das Gerät eingestanzt.Der im Stanzer verbleibende Abfall wird mit einer Stange herausgedrückt. Anschließend werden die Geräte in Viertel zerlegt und überschüssiges PDMS abgeschnitten, damit das Gerät passgenau auf eine Corning-Abdeckung passt. Ein Deckglas Nummer eins der Größe 24 Millimeter mal 40 Millimeter wird mit Druckluft verwendet, um jeglichen überschüssigen Abfall zu entfernen.Störrischer Schmutz kann ebenfalls mit 3M Scotch Brand 4 7 1 Vinylband entfernt werden. Die gereinigten Vorrichtungen sind nun bereit für die Plasmaverbindung. Ein Herrick-Plasmareiniger wird verwendet, um die Neuronenvorrichtungen kurzzeitig mit den Deckgläsern zu verbinden.Die Geräte und die Deckgläser werden auf ein Tablett gestellt, und das Tablett wird anschließend in den Plasmareiniger gegeben, wobei eine Vakuumpumpe verwendet wird, um die Luft aus der Kammer zu evakuieren. Es ist wichtig zu beachten, dass die PDMS-Geräte mit der Oberseite nach oben platziert werden, das heißt, das Design zeigt nach oben, damit es dem Plasmagas ausgesetzt ist.Nachdem der Vakuumdruck 300 Millitorr erreicht hat, wird die Stromzufuhr zur elektrischen Spule eingeschaltet und auf hoch gestellt. Die Tür wird leicht geöffnet, um etwas Luft in die Kammer gelangen zu lassen, was zur Erzeugung des Plasmas beiträgt. Die Vorrichtungen und das Abdeckglas werden zwei Minuten lang einer Plasma-Behandlung unterzogen.Beachten Sie die violette Farbe in der Kammer. Das ist das eigentliche Plasma. Die elektrische Spule erzeugt ein Plasma, das ein teilweise ionisiertes Gas aus Elektronen, Ionen und neutralen Atomen oder Molekülen ist.Das Plasma erzeugt reaktive Spezies auf der Oberfläche des Glases und des Geräts, die zusammen eine dauerhafte Bindung eingehen. Das Plasma macht die Oberfläche außerdem hydrophil, was die Zugabe von Flüssigkeiten erleichtert. Der Plasma-Reiniger sterilisiert die Geräte ebenfalls.Nach der Plasmabehandlung für zwei Minuten wird die Leistung im Vakuum abgeschaltet und Luft in die Kammer geleitet. Die plasmabehandelten Oberflächen des Glases und der mikrofluidischen Vorrichtung werden in einem Reinraumtisch in Kontakt miteinander zusammengefügt. Die Vorrichtungen werden anschließend in sterile 60-Millimeter-Dishs gegeben.Die plasmabehandelten Oberflächen des Glases und des Geräts bilden eine feste, irreversible Bindung. Innerhalb von 10 Minuten nach der Plasma-Bindung wird dem Gerät Polyol-Lysin zugesetzt. Nach 10 Minuten nimmt die Hydrophilie des Geräts ab.dadurch erschwert sich das Eindringen des PLL in das Gerät. Nach dem Hinzufügen von PLL ist es wichtig, das Gerät auf Luftblasen zu überprüfen. Eine einfache Methode, vorhandene Luftblasen zu entfernen, besteht darin, eine P-200-Pipette zu verwenden, die mit 100 Mikrolitern Flüssigkeit gefüllt ist.In diesem Fall platziert man PLL die Pipettenspitze direkt am Eingang des Hauptkanals und drückt dann den P 200 kräftig nach unten. Dieser Vorgang muss möglicherweise mehrmals wiederholt werden, aber schließlich treibt die Kraft der Pipette die Bläschen heraus. Die Geräte, die PLL enthalten, werden über Nacht in einem standardmäßigen Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad mit 5 % CO2 inkubiert.Nach 24-stündiger Inkubation mit PLL werden die Geräte zweimal kurz mit autoklaviertem deionisiertem Wasser gespült. Dabei wird die Flüssigkeit niemals vollständig aus den Hauptkanälen, sondern nur aus den Reservoirs entfernt. Das Entfernen der Flüssigkeit aus den Hauptkanälen würde Blasen einführen.Nach zwei kurzen Spülgängen werden die Geräte erneut mit autoklaviertem deionisiertem Wasser gefüllt und für mindestens drei Stunden oder über Nacht zurück in den Inkubator gestellt. Am nächsten Tag, nachdem die Geräte über Nacht oder mindestens drei Stunden mit Wasser inkubiert wurden, werden sie erneut in die Biosicherheitswerkbank gebracht und zweimal mit deionisiertem Wasser gespült. Anschließend wird neuronales Basalmedium, das die notwendigen Zusätze B 27 und Glutamat für die Kultivierung primärer Rattenneuronen enthält, zu den Geräten hinzugefügt.Die Geräte werden anschließend wieder in den Inkubator zurückgestellt, um sie später zu verwenden. Die Geräte sind nun bereit, um Neuronen aufzunehmen. In diesem Video haben wir die Technik der weichen Lithografie demonstriert, die wir zur Herstellung unserer Neuronengeräte verwenden.Mit diesen Geräten können Neuronen und andere relevante Zelltypen kultiviert werden. Der Hauptvorteil dieser Geräte liegt in der Möglichkeit, die Kultivierung der neuronalen Zellkörper auf der einen Seite des Geräts von einem reinen axonalen Anteil auf der anderen Seite räumlich zu trennen und zu kompartimentieren. Im nächsten Video zeigen wir Ihnen, wie wir kortikale Neuronen aus E18-fötalem Rattenhirn vorbereiten und wie wir die Zellen in das Gerät einbringen.Das war's also aus dem John-Labor. Vielen Dank fürs Zuschauen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

In diesem Video zeigen wir die Herstellung von E18 Kortikale Rattenneuronen.

Vorbereitung E18 Kortikale Rattenneuronen für Kompartimentierung in einer mikrofluidischen Vorrichtung

BioMEMS: Schmieden Neue Kooperationen zwischen Biologen und Ingenieuren

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