マウスにおける頭蓋内異種移植研究のための簡単​​なガイドスクリュー方式

この手順の目標は、脳腫瘍の頭蓋内移植片を生成して、新しい治療薬の有効性を評価することです。これは、最初にボルトで固定し、ガイドネジを頭蓋骨の所定の位置に固定し、次にガイドネジを介して脳に細胞を注入することによって達成されます。次のステップは、脳内に定着した腫瘍細胞を標的とした治療チャレンジを開始することです。

その後、生存転帰を評価することにより、動物の治療反応を監視します。最終的に、治療薬は、対照群と比較して、治療群の腫瘍の成長と生存に影響を与える可能性があります。この手順は、細胞注入の数日前に行うことができます。

マウスの体重を量り、腹腔内注射によりケタミンとキシラジンの混合物でマウスを麻酔することから始めます。マウスがつま先のつま先に反応しない場合は、ヨウ素で頭皮を準備し、正中線の右側と口腔間線の前方に2〜3ミリメートルの切開を行います。この切開により、頭蓋骨の冠状縫合糸と矢状縫合糸が露出します。

bgma は、これら 2 つの縫合糸の接合部に配置されます。ガイドねじエントリを bgma の 0.2 0.5 mm 横方向、bgma の 1 mm 前方にマークします。この点は、CAUの8つの原子核の真上にあります。

次に、ハンドヘルドツイストドリルを使用して、デュラボルトに1ミリメートルの深さの穴を開けます。滅菌されたガイドネジを穴に差し込み、頭蓋骨の表面と同じ高さになるまで挿入します。ネジが頭蓋骨の表面に触れたらすぐに、ネジを進めるのをやめてください。

ネジが頭蓋骨をへこませると、頭蓋骨が骨折する可能性があります。ガイドネジは、長さ1.6mmの26ゲージの針を支えています。ガイドネジの開口部を閉じるには、ガイドネジまたはネジダミーをガイドに挿入します。

今すぐねじ込みます。鉗子で切った皮膚を一緒に保持し、獣医のボンドの滴で皮膚を接着して傷を閉じ、皮膚の切断端に沿って広げ、皮膚が付着するまで数秒間保持します。最後に、腹腔内注射による逆転鎮痛薬とカルプロフェン鎮痛薬を提供し、マウスが温暖化マットで回復するのを待ちます。

回復には最大 20 分かかる場合があります。この実験例では、U 87 mgの神経膠腫細胞を、D-M-E-M-F 12に5%ウシ胎児血清を添加した大型組織培養フラスコで培養しました。このセクションでは、注射当日にこれらの細胞を注射用に準備する方法について説明します。

最初にフラスコを温かいPBSで2回洗浄して細胞を採取します。次に、0.25%トリプシンと0.05%EDTAを含むPBSを10ミリリットル加え、細胞を摂氏37度で5分間、または細胞が外れるまでインキュベートします。次に、細胞を10ミリリットルの培地に集めます。

細胞をヘモサイトメーターに置き、細胞を追って顕微鏡で細胞をカウントします。10ミリリットルの培養液、培地、細胞が入った50ミリリットルの円錐管をカウントし、Gの300倍で4分間遠心分離します。スピン後、1ミリリットルあたり1000万細胞の濃度で培養培地中の細胞を再懸濁します この濃度では、細胞懸濁液の各5マイクロリットルには50, 000個の細胞が含まれ、これは各頭蓋内注射に使用されます。

氷上に注射するための細胞懸濁液を保管します。ここでは、5マイクロリットルの容量が蒸発しやすく、細胞が破壊されるため、1容量の細胞が懸濁液中に必要です。袖口付きのハミルトン注射器を準備することから始めます。

針の先端に小さなプラスチックリングを取り付けて、針の2ミリメートルだけがガイドスクリュー出口の下に伸びるようにします。これにより、接種ポイントが3.5ミリメートルの深さになり、以前に増強されたマウスに麻酔をかけ、ガイドの上に小さな切開を行います。スタイレットをねじ込んで取り外します。

次に、氷上に保存されたよく混合された細胞の5マイクロリットルをシリンジに充填します。注射器内の気泡は、注射部位から細胞の塞栓症や逆洗を引き起こす可能性があるため、シリンジ内に気泡が入らないように注意してください。シリンジを灌流ポンプに固定し、針をガイドに挿入します。

スクリューは、1時間あたり30マイクロリットルの速度で細胞注入を開始します。この自動装置を使用すると、一度に最大10匹の動物を一定の流量で注入できます。手動注入は、一定の安定したペースで実行すれば実現可能です。

注入が完了したら、シリンジを慎重に取り外し、以前と同様にガイドネジのスタイレットを交換します。獣医のボンドで傷を閉じ、鎮痛剤を提供し、マウスが回復するのを待ちます。回復には最大 20 分かかる場合があります。

U 87 mg細胞接種から4日後、マウスの体重を量り、対照群と治療群に無作為に分けました。対照群には 100 マイクロリットルの PBS 腹腔内注射を、治療群には MG 1 0 2 ip の 100 マイクロリットルあたり 100 マイクログラムを注射しました。注射は14日間にわたって隔日で繰り返され、合計6回の注射が行われました。

最終注射後、マウスを毎日監視し、1日おきに体重を量りました。動物のエンドポイントは、バランス、障害または麻痺、脱水症、10%以上の豊富な性格の体重減少、または死亡などの重大な神経学的機能障害の発症として定義されました。エンドポイント日数は、Kaplan-Meier生存曲線として記録されました。

死亡または通話はエンドポイント、イベントとしてマークされ、1 つとしてスコアリングされました。実験終了時に生き残った動物は非イベントとして記録され、ゼロコントロールとして採点されました。動物は、細胞の最初の接種から23日後に神経障害と体重減少の兆候を示し始めました。

これは、A MG 1 0 2治療群で有意に遅れました。35日目までに、9匹の対照動物のうち7匹が安楽死させられました。9匹の対照動物のうち78匹が安楽死させられたのに対し、8:00 AMのg 1 0 2治療動物のうち3匹だけが安楽死させられました。

脳の組織学的解析により、対照群の9匹の動物すべてが腫瘍を発症したことが確認されたのに対し、8:00 AMのg 1 0 2で治療したマウスはわずか3匹でした。