EPA Метод 1615. Измерение энтеровирус и Норовирус встречаемости в воде культуры и РТ-КПЦР. II. Итого культивируемых Вирус Анализ

Общая цель данного протокола заключается в измерении уровня инфекционных вирусных частиц в пробе воды. Это достигается за счет использования раствора экстракта на щелочной основе для элюирования отрицательно заряженных вирусных частиц из электроположительного фильтра, который был концентрирован вирусом из питьевой или экологической воды. Сбор вируса на электроположительном картриджном фильтре описан в первой части этой серии.

На втором этапе pH элюата медленно снижается, что приводит к образованию стаи этих белков экстракта и вируса, присутствующего в образце. Затем стадо собирают центрифугированием, растворяют в буфере с фосфатом натрия и стерилизуют фильтром для удаления бактерий и плесени. Затем окончательный концентрированный элюат инокулируется в клетки почек зеленой мартышки буйвола, и за клетками наблюдают цитопатический эффект, или CPE, в течение 14 дней, чтобы обнаружить репликацию вируса.

Для высвобождения любых клеточных вирусных частиц все колбы с клетками замораживают по истечении 14 дней или когда CPE в любой колбе составляет 75% или выше. После второго и третьего проходов для подтверждения того, что CPE вызван репликацией вируса, используется программа для определения наиболее вероятного числа на литр каждого анализируемого образца. В конечном счете, общий культивируемый вирусный кислотный компонент метода EPA 1615 позволяет измерить уровень инфекционных вирусных частиц в пробе воды.

Этот общий анализ вирусов является лишь одним из компонентов метода 1615 EPA. Полный метод измеряет распространенность энтеровирусов и норовирусов в питьевых водах и водах окружающей среды. Любые обнаруженные вирусы затем могут быть использованы в качестве исходных данных для измерения риска от воздействия этих вирусов в питьевой и рекреационной воде.

Основное преимущество этого протокола заключается в том, что он обеспечивает единый стандартизированный подход к измерению вирусов в воде. Этот подход фактически основан на методе правила сбора информации, который был опубликован в 1996 году. Основная проблема, с которой сталкиваются новые люди при использовании этого метода, заключается в том, чтобы сохранить клеточную линию BGM свободной от загрязнения и расшифровки CPE, или цитопатических эффектов.

Мы с Шей Фаутом продемонстрируем процедуры иллюзии и органической флокуляции, а затем технику культивирования клеток. Чтобы выполнить первое элюирование, поместите 500 миллилитров буферного 1,5%-ного говяжьего экстракта комнатной температуры с pH 9,0 в градуированный цилиндр. Затем откройте корпус картриджа фильтра и добавьте достаточное количество говяжьего экстракта, чтобы полностью покрыть электроположительный фильтр.

Поместите оставшийся говяжий экстракт в стакан. Установите на место крышку корпуса фильтра. После минуты контакта с помощью перистальтического насоса и стерильной трубки медленно пропустите раствор говяжьего экстракта в корпусе вместе с раствором, оставшимся в стакане, через фильтр.

Соберите элюат в стерильный стеклянный стакан объемом 2 литра. Повторите эти действия с дополнительными 500 миллилитрами буферизованного 1,5% говяжьего экстракта, за исключением времени контакта 15 минут. Добавьте говяжий экстракт из второго элюирования в 2-литровую стакан, содержащую экстракт первого элюирования, и добавьте в стакан стерильный брусок для перемешивания.

Поместите стакан с элюатом на тарелку для перемешивания. Включите тарелку, и увеличивайте скорость перемешивания до образования вихря. Медленно отрегулируйте pH элюата до 3,5 плюс-минус 0,1 путем капельного добавления 1,2 молярной соляной кислоты, или HCL.

Добавляйте кислоту по каплям, потому что быстрое добавление инактивирует вирус. За это время элюат станет мутным, так как начнет образовываться осадок. Уменьшите скорость перемешивания до медленного перемешивания и продолжайте контролировать и поддерживать pH элюата на уровне 3,5 плюс-минус 0,1 при комнатной температуре в течение 30 минут.

Затем выпавшую в осадок суспензию говяжьего экстракта разлить в одну или несколько бутылок центрифуги и центрифугировать в течение 15 минут при 2,500 г при четырех градусах Цельсия. Извлеките флаконы из центрифуги и медленно сцедите надосадочную жидкость, чтобы предотвратить потерю гранулированного осадка. Надосадочную жидкость можно выбросить.

Для партий говяжьего экстракта, которые растворяются в течение 5 минут, добавьте 30 миллилитров 0,15 молярного фосфата натрия, pH 9,0, в бутылку центрифуги, содержащую осадок. Инструкции по растворению осадков, которые не растворяются в течение пяти минут, см. в текстовом протоколе. Помешивайте в течение 10 минут после того, как осадок полностью растворится.

Затем снимите мешалку и центрифугируйте растворенный осадок в течение 10 минут, при температуре от 4 000 до 10 000 раз больше g и четырех градусах Цельсия. Осторожно вылейте надосадочную жидкость в стеклянный стакан, не потревожив гранулы. Добавьте в стакан мешалку и выбросьте гранулы.

Поместите стакан на магнитную мешалку и перемешайте раствор. Добавляйте 1,2 моляра HCL по каплям, регулируйте pH до 7,0-7,5. Фильтр стерилизует надосадочную жидкость путем пропускания через стерилизующий фильтр, содержащий предварительный фильтр, который был предварительно обработан 15 миллилитрами буферизованного 1,5%-ного говяжьего экстракта, pH от 7,0 до 7,5.

В текстовом протоколе указан расчет объема образца анализа, или S, для всех тестовых образцов. Затем рассчитайте объем иноколума, разделив S на 10. Используя эти расчеты, разделите окончательный объем концентрированной пробы, который представляет собой образец, полученный после стерилизации фильтром, на три подпробы, как описано в текстовом протоколе.

Для каждого испытуемого образца инокулируют 10 тестовых сосудов, содержащих монослой BGM-клеток, причем объем первого подобразца равен объему инокулюма, а также общее количество культивируемых вирусных квантовых проб. Для лабораторно обогащенного бланка и матрицы лабораторно обогащенного образца предварительное пяти, 25 и 125-кратное разведение с использованием третьего подобразца и 0,15 молярного фосфата натрия pH от 7,0 до 7,5 в качестве разбавителя. В дополнение к сосудам, инокулированным неразбавленным подобразцом один, инокулируют 10 промытых тестовых пробирок для клеточных культур для каждой серии разведения, используя объем инокулята на каждом испытательном сосуде.

Распределите инокулянт по поверхности монослоев клеток, наклоняя сосуды вперед-назад. Испытуемые сосуды инкубируют при комнатной температуре в течение 80-120 минут на механической качающейся платформе со скоростью от одного до пяти колебаний в минуту или с покачиванием сосудов каждые 15-20 минут, чтобы любой присутствующий вирус мог проникнуть в клетки. Затем добавьте в тестовые сосуды предварительно подогретую техническую среду перед инкубацией при температуре 36,5 плюс-минус один градус Цельсия.

Ищите появление цитопатических эффектов в каждом исследуемом сосуде с помощью микроскопа в течение первых трех дней, а затем исследуйте их каждые два-три дня до 14 дня. Перенесите все тестовые сосуды, которые показывают более 75% цитопатических эффектов, в морозильную камеру, установленную при температуре минус 70 градусов Цельсия или ниже. После осмотра сосудов в последний день заморозьте все оставшиеся культуры, а общий культивируемый вирусный квантовый анализ контролирует на уровне или ниже минус 70 градусов Цельсия.

Затем разморозьте все культуры и отфильтруйте более 15% среды из каждого тестируемого сосуда с положительным результатом CPE через стерилизующий фильтр 0,2 микрона. Следующим шагом является проведение второго прохода всех тестовых сосудов первого прохождения с использованием промытых тестовых сосудов для клеток почек BGM. Для этого новые испытуемые сосуды окультуривают объемом посева, составляющим 10% от талой среды из всех отрицательных тестовых сосудов, а также из отфильтрованной среды положительных сосудов.

Повторите шаги, проделанные для первого прохода, заморозив все тестовые сосуды, которые были отрицательными на первом проходе и положительными на втором. Затем проведите третий пассаж, как описано для второго пассажа, используя только контрольные данные отрицательного анализа и клеточные культуры, которые были отрицательными во время первого пассажа и положительными во втором пассаже. Идентифицируйте отдельные исследуемые сосуды как вирусоположительные, если они проявляют цитопатические эффекты как в первом, так и во втором пассажах, или, в случае, если цитопатический эффект не проявляется до второго пассажа, во втором и третьем пассажах.

Используйте калькулятор наиболее вероятных чисел Агентства по охране окружающей среды США с настройками программы по умолчанию, установленными как в текстовом протоколе, для расчета титров вирусов всех тестовых образцов. Затем используйте значения, полученные для наиболее вероятного числа инфекционных единиц на миллилитр, в дополнение к верхнему и нижнему доверительным пределам на миллилитр, чтобы рассчитать наиболее вероятное количество инфекционных единиц на литр и соответствующие доверительные пределы, как описано в текстовом протоколе. Средний процент восстановления полиовируса показан из проб грунтовой и реагентной воды.

Среднее извлечение полиовируса из проб грунтовых вод составило в среднем 58% с коэффициентом вариации 79% Ни в одном из дубликатов незасеянных полевых проб подземных вод не было обнаружено ни одного культивируемого вируса. Эффективность метода также измерялась с использованием образцов Lab Fortified Blank, модифицированных с использованием двух различных уровней затравки. Двенадцать проб воды с реагентами включали шесть проб с 300 МПН инфекционных единиц и шесть с 1000 МПН инфекционных единиц полиовируса.

Эти меры контроля выполнялись аналогично, со средним восстановлением 111% и коэффициентом вариации 100% При выполнении этой процедуры важно помнить об использовании асептической техники и надлежащих лабораторных методов для предотвращения загрязнения образцов. Также важно помнить, что при работе с вирусными патогенами следует принимать меры предосторожности, такие как использование перчаток, при выполнении этой процедуры. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как разводят вирусы и электроположительные фильтры и выполняют органические флокуляции и анализы клеточных культур.

В дополнение к этой процедуре вы также можете выполнять молекулярные анализы для идентификации и обнаружения дополнительных типов вирусов.