Extraction et purification des polyphénols à partir de la poudre de baies lyophilisée pour le traitement des cellules musculaires lisses vasculaires In Vitro

L’objectif global de ce protocole est de fournir une méthode simple et reproductible pour l’extraction et la purification des polyphénols végétaux qui pourraient être utilisés pour traiter les cellules à l’avenir. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant le rôle de la fonction des aliments dans la santé et la maladie humaines. Cette extraction de polyphénols à base d’éthanol et assistée par ultrasons est une méthode facile et reproductible qui permet d’obtenir un rendement en polyphénols plus élevé.

L’utilisation du chloroforme permet l’élimination des sucres, des acides gras, des protéines et d’autres molécules tandis que l’acétate d’éthyle permet le fractionnement des polyphénols. Ces extraits concentrés de polyphénols peuvent ensuite être utilisés in vitro et in vivo pour étudier les effets des polyphénols ainsi que leurs mécanismes d’action sur divers tissus, dont le système cardiovasculaire, comme décrit ici. Pour commencer cette procédure, préparez les réactifs comme indiqué dans le protocole texte.

Ensuite, pesez 10 grammes de poudre de mûre lyophilisée. Ajoutez la poudre de baies dans une fiole à fond rond d’un litre contenant 100 millilitres d’éthanol aqueux à 80 %. Placez le ballon dans un bain à ultrasons à 25 degrés Celsius.

Dans le cadre d’une purge continue à l’azote sous une lumière tamisée, sonicez le mélange pendant 20 minutes à 42 kilohertz et 135 watts. Après cela, utilisez un entonnoir Buchner réfrigéré avec aspiration sous vide pour filtrer le mélange à travers un papier filtre numéro deux. Rincez le gâteau de filtration avec 50 millilitres d’éthanol à 100 %.

Conservez le filtrat et ajoutez le gâteau de filtration dans une fiole à fond rond d’un litre contenant 100 millilitres d’éthanol aqueux à 80 %. Ensuite, répétez le processus d’extraction en sonisant, filtrant et lavant le mélange. Mélanger les deux filtrats dans une fiole à fond rond contenant 50 millilitres d’éthanol aqueux à 80 %.

À l’aide d’un évaporateur rotatif à 62 degrés Celsius et 50 tr/min, évaporez le solvant. Continuez ainsi jusqu’à ce que l’éthanol ne s’évapore plus. Ensuite, transférez l’échantillon dans un tube conique de 50 millilitres.

Injectez de l’azote gazeux en haut du tube pendant 10 minutes pour évaporer l’éthanol restant. Congelez l’échantillon à moins 80 degrés Celsius pendant au moins 24 heures. Ensuite, lyophilisez l’échantillon à moins 50 degrés Celsius pendant environ huit heures.

Conservez les échantillons à moins 20 degrés Celsius jusqu’au moment de l’utiliser. Pour commencer, pesez les échantillons extraits lyophilisés. Ajoutez environ 20 millilitres de chloroforme dans un bécher de 100 millilitres avec l’échantillon.

À l’aide d’une plaque à mélanger, mélangez la solution pendant cinq minutes. Ensuite, versez le mélange dans un entonnoir de séparation. Laissez l’extrait brut décanter pendant une heure à température ambiante.

Après cela, jetez la couche inférieure et récupérez la couche aqueuse dans un bécher propre. Ajoutez deux volumes d’acétate d’éthyle dans le bécher. À l’aide d’un barreau magnétique, remuez le mélange pendant cinq minutes à température ambiante.

Ensuite, utilisez un entonnoir Buchner réfrigéré avec aspiration sous vide pour filtrer le mélange à travers le papier filtre numéro deux. Transférez l’échantillon filtré dans une fiole à fond rond. À l’aide d’un évaporateur rotatif à 62 degrés Celsius et 50 tr/min, évaporez l’acétate d’éthyle pendant 30 minutes.

Après cela, lyophilisez l’échantillon à moins 50 degrés Celsius pendant huit heures. Transférez l’échantillon dans un tube conique de 50 millilitres et conservez-le à moins 20 degrés Celsius jusqu’au moment de l’utiliser. Après la culture des cellules musculaires lisses vasculaires, jetez le milieu de culture et lavez les cellules deux fois avec une solution saline tamponnée au phosphate.

Ensuite, ajoutez quatre millilitres de PBS et deux millilitres de 0,25 % de trypsine-EDTA. Incuber dans un incubateur de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Après cela, transférez les cellules dans un tube à centrifuger de 15 millilitres contenant deux millilitres de milieu complet.

Centrifuger à 1, 100 fois g pendant cinq minutes. Jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire avec un millilitre de PBS. À l’aide d’un hémocytomètre, comptez les cellules.

Ensuite, dans des plaques de culture à six puits, ensemencez 50 000 cellules par puits. Cultivez les cellules à 90 % de confluence dans un milieu complet contenant 10 % de sérum fœtal bovin. Préparez le milieu de traitement comme indiqué dans le protocole textuel et conservez-le à quatre degrés Celsius.

Ensuite, ajoutez 10 milligrammes d’extrait brut ou purifié à un millilitre de DMEM ordinaire pour préparer une solution mère de 10 milligrammes par millilitre. Conservez la solution mère dans des aliquotes de 200 microlitres à moins 20 degrés Celsius. Après cela, ajoutez deux millilitres de milieu de traitement, contenant 0,5 % de sérum de veau fœtal et la concentration souhaitée de solution mère dans les cellules.

Incuber pendant trois jours à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié à 5 % de CO2. Ensuite, si vous traitez avec des hormones ou des facteurs de croissance, affamez les cellules pendant au moins 24 heures en les incubant avec un milieu de traitement contenant 0,5 % de sérum de veau fœtal. Après la famine, ajoutez l’hormone souhaitée, en remplaçant le milieu de traitement toutes les 24 heures pendant trois jours, comme détaillé dans le protocole de texte.

Ensuite, lavez les cellules traitées deux fois dans du PBS froid. Lyser les cellules à l’aide de 200 microlitres de tampon de lyse sur glace. À l’aide de grattoirs cellulaires, prélevez le lysat cellulaire et transférez-le dans un tube à microcentrifuger de 1,5 millilitre.

Incuber le lysat recueilli pendant 20 minutes sur de la glace, en tourbillonnant toutes les cinq minutes. Après cela, sonicez les extraits cellulaires avec trois rafales à 125 watts pendant 10 secondes chacune, avec une pause de deux secondes entre chaque rafale. À l’aide d’un réactif de dosage des protéines à 595 nanomètres, mesurez la concentration en protéines.

Mélangez 50 microgrammes de protéines avec un tampon de lyse pour obtenir un volume total maximum de 50 microlitres. Ajouter 16 microlitres d’un tampon d’échantillon 4x Laemmli. Ensuite, chauffez les échantillons pendant cinq minutes à 75 degrés Celsius.

Séparez les échantillons dans des gels SDS-PAGE à 10 % et transférez-les sur des membranes PVDF pour l’analyse par Western blot avec des anticorps spécifiques. Dans cette étude, une extraction à base d’éthanol est utilisée pour identifier les différents niveaux d’acides phénoliques et de flavonoïdes présents dans les extraits de mûres polyphénoliques bruts et purifiés. Bien que le processus de purification n’ait pas modifié de manière significative les niveaux d’acide gallique ou d’acide p-coumarique, il a fait passer les niveaux d’acide 3-O-caféoylquinique de 170,5 à 235,3 ppm et ceux de quercétine de 24,5 à 95 ppm.

En revanche, l’acide férulique et la rutine ont été perdus lors de la purification de l’extrait brut. Après l’extraction, les VSMC ont été incubés dans 50 à 500 microgrammes par millilitre d’extrait de mûre brut ou purifié dans un milieu contenant 0,5 % de sérum de bovin fœtal pendant trois jours. Les deux extraits se sont avérés efficaces pour réduire la phosphorylation basale de ERK.

Cependant, l’extrait purifié est considéré comme fortement régulateur à 100 microgrammes par millilitre, alors que 400 à 500 microgrammes par millilitre d’extrait brut sont nécessaires. Cela suggère que la plus grande efficacité de l’extrait purifié à inhiber la phosphorylation d’ERK est due à ses concentrations plus élevées de composés polyphénoliques. Après cela, les VSMC sont traités pendant 24 heures avec 200 microgrammes par millilitre d’extrait de mûre purifié avant l’ajout de 100 nanomoles d’angiotensine II.As précédemment rapporté, l’extrait de polyphénol de mûre réduit la phosphorylation ERK induite par l’angiotensine II, mais ne démontre aucun effet sur l’expression de la catalase ou de la SOD2.

Une fois maîtrisée, l’extraction des polyphénols peut être préparée en quelques heures. Cette technique peut aider les chercheurs dans le domaine des aliments fonctionnels à explorer le rôle des polyphénols in vitro et dans des modèles animaux. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez être en mesure d’extraire et de purifier les polyphénols des fruits et légumes et d’utiliser les extraits de polyphénols pour traiter les cellules en culture.

Nous avons utilisé cette méthode pour démontrer le rôle des polyphénols de la mûre dans la prévention du vieillissement des cellules musculaires lisses vasculaires aortiques. C’est important, si l’on considère que le vieillissement du système vasculaire est un facteur de risque majeur pour le développement de maladies cardiovasculaires.