Prédiction pharmacologique en réseau et validation métabolomique du mécanisme de Fructus phyllanthi contre l’hyperlipidémie

Le présent protocole décrit une stratégie intégrée pour explorer les cibles et mécanismes clés de Fructus Phyllanthi contre l’hyperlipidémie basée sur la prédiction pharmacologique en réseau et la vérification métabolomique.

Notre recherche comprend une technique expérimentale en série et le protocole contient ces détails qui sont nécessaires pour que les lecteurs comprennent nos méthodes. Notre méthode intégrée compense l’inconvénient de la pharmacologie de réseau et de la métabolomique, et peut être utilisée pour la méta-analyse thérapeutique de la médecine naturelle. Cette méthode est utilisée pour filtrer le composé actif de l’ingrédient de l’entreprise et la combinaison pour les joggeurs à composition chimique massive, comme un médicament traditionnel chinois.

Pour commencer, sélectionnez les ingrédients actifs et les cibles clés en recherchant le mot-clé phyllanthi fructus dans la base de données pharmacologique des systèmes de médecine traditionnelle chinoise. Pour obtenir la liste des ingrédients actifs candidats et des cibles du fructus phyllanthi, ou PF, recherchez le mot-clé hyperlipidémie dans la base de données des cartes génétiques, la base de données en ligne Mendelian Inheritance in Man et la base de données des cibles thérapeutiques pour obtenir les cibles candidates respectives de l’hyperlipidémie. Téléchargez les feuilles de calcul des cibles de la maladie et enregistrez-les dans un dossier et supprimez les cibles répétées pour obtenir la liste des cibles d’hyperlipidémie.

Copiez ensuite les listes des ingrédients actifs de la PF, des cibles de la PF et des cibles d’hyperlipidémie dans une nouvelle feuille de calcul. Utilisez la fonction d’identification des doublons de données dans la barre d’outils pour obtenir des cibles d’intersection. Importez la liste des cibles d’intersection dans la base de connaissances UniProt pour normaliser les noms des gènes et des protéines.

Pour construire un réseau d’interaction protéique, collez la liste des cibles d’intersection de FP contre l’hyperlipidémie dans la boîte de dialogue de liste de noms de la base de données de chaînes 11.5. Sélectionner l’homo sapiens dans les organismes. Cliquez sur Rechercher, puis sur Continuer.

Une fois les résultats disponibles, activez les nœuds fortement déconnectés du réseau dans les paramètres avancés. Définissez la confiance la plus élevée à 0,900 dans le score d’interaction minimum requis. Cliquez ensuite sur le bouton de mise à jour.

Cliquez sur les exportations dans la barre de titre et téléchargez le court texte tabulaire du réseau d’interaction protéique au format PNG et TSV. Pour construire un réseau cible de maladie composant médicamenteux, ouvrez Cytoscape 3.9.1 et importez le fichier au format TSV. Optimisez la couleur, la police et le côté des nœuds réseau via la barre de style du panneau de configuration.

À l’aide de la fonction d’analyse de réseau pour l’analyse de la topologie du réseau, obtenez des gènes de hub dans CytoHubba dans Cytoscape et établissez le réseau de maladies cibles des ingrédients médicamenteux. Pour effectuer une analyse d’enrichissement GO et KEGG, ouvrez les ressources bioinformatiques David. Cliquez sur démarrer l’analyse et collez la liste des cibles dans la boîte de dialogue de gauche.

Sélectionnez le symbole officiel du gène dans l’identificateur de sélection et l’homo sapiens dans certaines espèces. Ensuite, activez la liste des gènes dans le type de liste et cliquez sur soumettre la liste. Ensuite, cliquez sur clustering d’annotations fonctionnelles sous analyser la liste de gènes ci-dessus avec l’un des outils David.

Activez le terme GO BP direct, le terme GO CC direct, le terme GO MF direct et l’ontologie génétique pour l’analyse de l’enrichissement de la fonction GO. Activez la voie KEGG dans les voies pour l’analyse de l’enrichissement de la voie KEGG. Cliquez sur le tableau d’annotation fonctionnel pour afficher les résultats.

Utilisez le logiciel SIMCA P pour l’analyse statistique multivariée des valeurs intégrales obtenues à partir des résultats LCMS. Utiliser l’analyse discriminante des moindres carrés partiels orthogonaux, ou OPLSDA, pour les données du centre moyen et la modélisation des classes d’échantillons. Après le test OPLSDA, considérer les métabolites ayant une importance variable intégrale dans la projection, ou valeurs VIP, supérieures à un et une valeur P inférieure à 0,05 du test T de l’élève comme métabolites différentiels potentiels.

Identifier les métabolites perturbés et les voies métaboliques par des sources de bases de données ouvertes, y compris le métabolome humain, l’encyclopédie Kyoto des gènes et des génomes, et MetaboAnalyst 5.0. Visualisez les vues des résultats par MetaboAnalyst 5.0 et la plateforme Wukong. Téléchargez la structure 3D des ingrédients FP sélectionnés à partir de la base de données pharmacologique des systèmes de médecine traditionnelle chinoise.

Recherchez les noms des ingrédients dans la boîte de recherche des noms chimiques et téléchargez les fichiers de structure 3D correspondants au format MOL two. Ensuite, téléchargez les structures cristallines des cibles clés à partir de la base de données de structure des protéines alpha fold. Recherchez les noms des cibles dans la zone de recherche et téléchargez les fichiers de structure cristalline correspondants au format PDB.

Importez ensuite les ingrédients et les fichiers de structure cible dans le logiciel AutoDock Tools. Cliquez sur modifier et supprimer l’eau pour supprimer les molécules d’eau. Ensuite, cliquez sur modifier les hydrogènes et ajouter pour ajouter des hydrogène.

Définissez les ingrédients comme ligand et effectuez un amarrage aveugle en sélectionnant les cibles entières comme récepteur. Entrez une valeur dans la case derrière le centre et la taille pour ajuster l’espace nouvellement développé, ce qui permet d’englober complètement le ligand et le récepteur. Enregistrez les fichiers de ligand et de récepteur au format PDBQT.

Utilisez AutoDock Vina pour effectuer un amarrage moléculaire. Définissez la barre de récepteur sur le nom du point récepteur PDBQT et la barre de ligand sur le nom du point de ligand PDBQT. Obtenir l’emplacement optimal pour la liaison du ligand au récepteur et enregistrer la valeur de l’énergie de liaison à la position optimale.

Importez les fichiers d’ancrage dans le profileur d’interaction du ligand protéique pour obtenir le modèle visuel du système. Téléchargez les fichiers de modèle au format PSC et importez-les dans le logiciel PyMOL pour construire une visualisation supplémentaire. Grâce à la pharmacologie en réseau, un total de 19 ingrédients et 134 cibles liées aux ingrédients de la PF ont été trouvés.

Après avoir fait correspondre les cibles liées à la PF avec les cibles liées à l’hyperlipidémie, 62 ont été identifiées comme cibles potentielles pour la PF contre l’hyperlipidémie. Le réseau d’interaction protéique a été construit par String et Cytoscape. Les résultats de l’enrichissement GO suggèrent que les processus biologiques et la fonction moléculaire de la PF contre l’hyperlipidémie étaient principalement liés à l’expression génique et à la liaison aux protéines.

L’enrichissement de KEGG a prouvé que la PF pouvait intervenir dans le métabolisme des lipides et l’athérosclérose. L’analyse OPLSDA a été utilisée pour explorer la séparation des métabolites entre les groupes de souris témoins négatives, régime riche en graisses et souris PF à forte dose, ce qui a montré que les mêmes échantillons de groupe étaient regroupés et que différents échantillons de groupe se distinguaient bien. Au total, 16 et six métabolites ont été identifiés comme métabolites différentiels dans la PF affectant les souris HFD dans le plasma et le foie.

Les cartes thermiques tracées par MetaboAnalyst 5.0 ont montré que tous les métabolites différentiels dans le plasma et le foie ont été modifiés dans le groupe de régime riche en graisses et la plupart ont été inversés dans le groupe PF. Le métabolisme du tryptophane a été affecté de manière significative dans le plasma. Le métabolisme de la taurine et de l’hypotaurine a été affecté de manière significative dans le foie.

Les métabolites différentiels ont été importés dans le plug-in MetScape dans Cytoscape et correspondaient aux gènes de moyeu identifiés en pharmacologie de réseau pour collecter les réseaux de gènes enzymatiques de réaction composés. De plus, le réseau de voies de métabolites cibles d’ingrédients a été construit. L’amarrage moléculaire a été utilisé pour analyser leurs interactions avec le site actif du ligand.

Cette technologie est une méthode complète de démarrage des ingrédients génétiques pharmacologiques de la médecine traditionnelle chinoise. Il fournit une nouvelle idée pour la recherche impliquant des médicaments avec des ingrédients complets.