Een oncogene hepatocyte-geïnduceerde Orthotopic muis model van hepatocellulaire kanker ontstaan in de setting van leverontsteking en fibrose

Met behulp van slechts een model om een hepatocellulaire kanker massa model te ontwikkelen kan mensen helpen hun tumor-geïnduceerde immunotolerantie en specifieke behandeling-geïnduceerde, elke tumor immunoresponses. De orthotopische tumor die zich ontwikkelt met de leverfibrose techniek bootst de klinische kenmerken van menselijke leverkanker na. Deze methode kan een nuttig hulpmiddel bieden in hepatocellulaire kanker immunologische studie.

Visuele demonstratie van deze methode kan illustreren de meer technisch uitdagende stappen, zoals de intrasplenic injectie, die essentieel zijn voor een succesvolle uitvoering van dit protocol. Vervolgens handmatig beperken een mannetje, zes tot acht weken oude C57 zwarte 6 muis dorsal-side omhoog. Gebruik alternatieve 70% ethanol en Betadine scrubs om de injectieplaats drie keer schoon te maken.

Lever vervolgens 160 microliter koolstoftetrachloride aan de muis door intraperitoneale injectie en breng het dier terug naar zijn kooi thuis. Na bevestiging van een gebrek aan respons op teen knijpen, in een vijf maanden oude simian virus 40 T antigeen transgene muis, plaats de muis in de supine positie en zet de ledematen met tape. Maak een midline laparotomie incisie langs de lengte van de linea alba, groot genoeg om een adequate blootstelling van de lever te bieden, en verdringen de darmen naar links.

Ontleden boven de lever aan blootstelling aan de inferieure vena cava. Induceer een slagaderklem om het vat te binden. Gebruik een vlindernaald om intraveneuze toegang tot de poortader te krijgen en de katheter handmatig vast te stellen.

Zorgvuldig schakelen spuiten voor elke oplossing, met succes leveren 15 milliliter oplossing een, 15 milliliter van 0,75%collagenase oplossing twee, en 15 milliliter oplossing twee zonder collagenase via katheter, bij een geschatte 8,9 milliliter oplossing per minuut stroomsnelheid. Aan het einde van de perfusie, oogst de tumormassa in een 50-milliliter conische buis met 10 tot 15 milliliter PBS. Accijns de tumor van de volgende MTD2 muis zoals net aangetoond.

Gebruik een schaar om de levers in kleinere stukken te snijden. Breng de weefsels in een nieuwe container van verse PBS om de rest van het bloed uit het weefsel te verwijderen voordat u de weefselstukken in een 50-milliliter conische buis met vijf milliliter van volledige RPMI medium. Hak de gewassen levermonsters tot de stukken gemakkelijk door de punt van een pijp van vijf milliliter kunnen passen.

Voeg voldoende medium aan de buis om een uiteindelijk volume van 30 milliliter te bereiken. Gebruik een pipet van vijf milliliter om de weefselfragmenten te tritureren, voordat u de oplossing door een zeef van 70 micrometer in een nieuwe buis van 50 milliliter filtert. Was de zeef meerdere malen met compleet medium.

Pas het uiteindelijke volume aan op 50 milliliter met extra compleet medium. Draai de vering snel door centrifugeren tot maximaal 50 keer g voordat u de centrifuge stopt en de supernatant decanteert. Dan resuspend de pellet in 20 milliliter pbs voor het tellen.

Voor intrasplenic injectie van de MTD2 hepatocyten, laad een een-milliliter spuit uitgerust met een 27-gauge naald per elk ontvanger dier met 220 microliters van hepatocyten per muis. Bevestig een gebrek aan respons op teenknijpen in een verdoofd, met koolstoftetrachloride behandeld dier. Begin net onder de wervelkolom spier, vervolgens, maak een een-centimeter incisie op de linkerflank parallel aan de dertiende rib van de dorsale extreme en gebruik botte-puntige tangen om de milt exterioriseren.

Knip de milt met twee middelgrote titaniumclips tussen de miltslagader en ader en lever 200 microliter cellen in de inferieure pool van de milt. Knip de inferieure tak van de pedicle met één middelgrote clip en snijd de milt tussen de twee in eerste instantie geplaatste clips. Verwijder de inferieure pool van de milt die direct werd geïnjecteerd met tumorcellen en gebruik 3-0 polyglactine 910 onderbroken hechten om de binnenste spierlaag te sluiten.

Gebruik vervolgens gesteriliseerde stalen wondclips om de buitenste huidlaag te sluiten en onderhuids vijf milligram per kilogram carprofen toe te dienen. Na isolatie van T-antigeentransgene muizen zoals aangetoond, kunnen zowel hepatocyten als tumorinfiltrerende cellen worden waargenomen. De cellen tonen meestal een bijna 100% levensvatbaarheid na verwerking.

Na intrasplenische inenting in in het wild-type koolstoftetrachloride-behandelde dieren, de getransplanteerde hepatocyten met succes en betrouwbaar groeien orthopedische hepatocellulaire carcinoom tumoren die de tumor-specifieke simian virus 40 T antigeen uitdrukken. De voorbereiding van onze levensvatbare en zuivere populatie hepatocyten uit MTD2 massa en nauwkeurige toediening van de intrasplenic injectie zijn belangrijk voor het succes van de procedure. Hoewel ons team hepatocyte-inenting in ontvangende muizen heeft getest via intravasculaire en intraperitoneale injectie, waren deze andere methoden niet in staat om orthopedisch hepatocellulair carcinoom te induceren.

Dit model biedt een uniek platform dat het onderzoek mogelijk maakt voor immuunbewaking en de tolerantie in de vroege en latere stadia van tumorprogressie. Wees voorzichtig bij het gebruik van de koolstoftetrachloride, want het is giftig.