Bioprintable alginat/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro modellsystem framkalla Cell sfäroid bildas

* These authors contributed equally
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vi utvecklade en heterogen bröst cancer modell bestående av förevigade tumör och fibroblast celler inbäddade i en bioprintable alginat/gelatin bioink. Modellen recapitulates den i vivo tumör närmiljön och underlättar bildningen av flercelliga tumör spheroids, ger inblick i drivkrafterna bakom uppkomst.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Jiang, T., Munguia-Lopez, J., Flores-Torres, S., Grant, J., Vijayakumar, S., De Leon-Rodriguez, A., Kinsella, J. M. Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation. J. Vis. Exp. (137), e57826, doi:10.3791/57826 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Den infödda tumör mikromiljö cellulära, biokemiska och biofysiska heterogenitet är inte återgetts av växande förevigade cancer cellinjer med konventionella tvådimensionell (2D) cellodling. Dessa utmaningar kan övervinnas med hjälp av bioprinting tekniker för att bygga heterogena tredimensionella (3D) tumör modeller där olika typer av celler är inbäddade. Alginat och gelatin är två av de vanligaste biomaterial som anställd i bioprinting på grund av deras biokompatibilitet, Biomimetik och mekaniska egenskaper. Genom att kombinera de två polymererna, uppnådde vi en bioprintable sammansatta hydrogel med likheter till mikroskopiska arkitekturen av en infödd tumör stroma. Vi studerade tryckbarhet av sammansatta hydrogel via reologi och fick fönstret för optimal utskrift. Bröstcancerceller och fibroblaster var inbäddade i hydrogels och skrivas ut för att bilda en 3D-modell härma den i vivo mikromiljö. Bioprinted heterogena modellen uppnår en hög lönsamhet för långsiktiga cellkultur (> 30 dagar) och främjar den självmontering av bröstcancerceller i flercelliga tumör spheroids (MCTS). Vi observerade för migration och interaktion av cancer-associerade fibroblast cellerna (CAFs) med MCTS i denna modell. Genom att använda bioprinted cell kultur plattformar som samtidig kultur system, erbjuds här ett unikt verktyg för att studera beroendet av uppkomst på stroma sammansättning. Denna teknik har en hög genomströmning, låg kostnad och hög reproducerbarhet och det kan också ge en alternativ modell till konventionella cellkulturer enskiktslager och djur tumör modeller att studera cancerbiologi.

Introduction

Även om 2D cellkultur används ofta i cancerforskning, finnas begränsningar som cellerna odlas i enskiktslager format med en jämn koncentration av näringsämnen och syre. Dessa kulturer saknar viktig cell-cell och cell-matrix interaktioner finns i den ursprungliga tumören närmiljön (TME). Följaktligen, dessa modeller dåligt recapitulate fysiologiska förhållanden, som leder till avvikande cell beteenden, inklusive onaturliga morfologier, oregelbundna receptor organisation, membran polarisering och avvikande genuttryck, bland annat villkor1,2,3,4. Däremot, erbjuder 3D cellkultur, där cellerna är expanderat i en volymetrisk utrymme som aggregat, spheroids eller organoids, en alternativ teknik för att skapa mer korrekta in vitro- miljöer för att studera grundläggande cellbiologi och fysiologi. 3D cell kultur modeller kan också uppmuntra cell-ECM samspel som är kritiska fysiologiska kännetecken av infödda TME in vitro-1,4,5. Den framväxande 3D bioprinting-tekniken ger möjligheter för att bygga modeller som efterliknar den heterogena TME.

3D bioprinting härleds från prototyper och möjliggör tillverkning av 3D mikrostrukturer som kan härma några av komplexiteten i levande vävnad prover6,7. Den nuvarande bioprinting metoder inkluderar inkjet, extrudering och laser-assisterad utskrift8. Bland dem tillåter metoden extrudering heterogenitet kontrolleras inom de tryckta matriserna genom att exakt Placera olika typer av material på olika ursprungliga platser. Därför är det den bästa metoden att fabricera heterogena i vitro modeller som omfattar flera typer av celler eller matriser. Extrudering bioprinting har framgångsrikt använts för att bygga auricular formade ställningar9, vaskulära strukturer10,11,12, och huden vävnader13, vilket resulterar i hög utskrift trohet och cell lönsamhet. Tekniken har också mångsidig materialval, förmågan att deponera material med celler inbäddade med en känd densitet och hög reproducerbarhet14,15,16,17 . Naturliga och syntetiska hydrogeler används ofta som bioinks för 3D bioprinting på grund av deras biokompatibilitet, bioaktivitet och deras hydrofila nätverk som kan vara konstruerad för att strukturellt likna de ECM7,18 ,19,20,21,22,23. Hydrogeler är också fördelaktigt eftersom de kan innehålla självhäftande platser för celler, strukturella element, permeabilitet för näringsämnen och gaser och lämpliga mekaniska egenskaper att uppmuntra cell utveckling24. Till exempel, erbjuda kollagen hydrogels integrin anchorage platser som celler kan använda för att fästa till matrisen. Gelatin, denaturerat kollagen, behåller liknande cell adhesion webbplatser. Däremot alginat är bioinert men ger mekanisk integritet genom att bilda antipyridinantikropp med tvåvärda joner25,26,27,28.

I detta arbete utvecklat vi en sammansatt hydrogel som en bioink, består av alginat och gelatin, med likheter till mikroskopiska arkitekturen av en infödd tumör stroma. Bröstcancerceller och fibroblaster var inbäddad i hydrogels och skrivas ut via en extrudering-baserade bioprinter för att skapa en 3D-modell som efterliknar den i vivo mikromiljö. Bakåtkompilerade 3D miljön tillåter cancerceller att bilda flercelliga tumör spheroids (MCTS) med en hög lönsamhet under långa perioder av cellkultur (> 30 dagar). Detta protokoll visar metoderna av syntetisera sammansatta hydrogels, karakterisera materialen mikrostruktur och tryckbarhet, bioprinting cellulära heterogena modeller, och observera bildandet av MCTS. Dessa metoder kan tillämpas på andra bioinks i extrudering bioprinting samt om olika designer av heterogen vävnad modeller med potentiella tillämpningar i drogkontroll, cell migration analyser och studier som fokuserar på grundläggande cell fysiologiska funktioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. beredning av material, Hydrogel, och Cell kultur material

  1. Material och lösning förberedelse
    1. Tvätta och torka 250 mL och 100 mL glasbägare, magnetisk omrörare, spatlar, 10 mL patroner 25 G cylindriska munstycken med en längd på 0,5 i och en inre diameter av 250 µm. Sterilisera material genom autoklavering dem vid 121 ° C/15 min/1 atm. hålla material under sterila förhållanden fram till användning.
      Obs: Se Tabell av material för leverantörsinformation.
    2. Väga 3 g alginat (3% w/v) och 7 g gelatin (7% w/v) (betecknas som A3G7 nedan).
    3. Sterilisera följande objekt under UV-ljus för minst 4 h: alginat och gelatin pulver, paraffin filma, aluminiumfolie bitar av 5 cm2, och 1 mL och 5 mL sprutor. Sterilisera den gavlar, spets caps och kolvar av doppa dem i 70% etanol för minst 4 h och tvätta dem 2 x med steriliserat ultrarent vatten.
      Obs: Se Tabell av material för leverantörsinformation.
    4. Lös 4 g av agaros med ultrarent vatten och sterilisera den genom autoklavering.
      Obs: Agarens är helt upplöst efter autoklavering processen.
    5. Bered en 100 mM av vattenfri kalciumklorid (CaCl2) i steriliserade ultrarent vatten och ett sterilt filter (med en porstorlek på 0,22 µm) före användning.
    6. För agaros-belagd 6-bra plattor, smälta sterila Agarens i mikrovågsugn att erhålla en flytande lösning. sedan, under en biosäkerhet skåp (BSC) och använder en 1 mL mikropipett, tillsätt 2 mL per brunn och blanda försiktigt för att skapa en enhetlig lager i botten av brunnen. Låt den svalna och täta brunnen med paraffin film. Förvara den i rumstemperatur (RT) fram till användning.
  2. Beredning av A3G7 hydrogel föregångaren
    1. Blanda 3 g alginat och 7 g gelatin pulver i en 250 mL bägare inom en BSC. Lägga till en magnetisk omrörare och 100 mL DPBS. Försegla bägaren med sterilt paraffin film och aluminium folie (5 cm2) att undvika kontaminering.
    2. Lös upp pulver under en ständig agitation i en magnetisk/varm tallrik med 600 rpm vid 60 ° C för 1 h och RT för en extra 2 h.
    3. Värm materialet vid 37 ° C tills gelen genomgår en fasövergång till flytande tillstånd (för 100 mL lager gel lösning, detta tar ca 45 min). Överför lösningen till sterila 50 mL koniskt centrifugrör, täta dem och centrifugera rören vid 834 x g i 5 min för att eliminera eventuella gasbubblor från materialet.
    4. Sug upp hydrogel föregångaren i 10 mL-sprutor. Seal sprutorna med lock och paraffin film. Lagra dem vid 4 ° C fram till användning.
  3. Cellkultur
    Obs: Stegen i detta avsnitt måste utföras under sterila förhållanden.
    1. Förbereda det basala DMEM mediet enligt följande (1 L): i en BSC, blanda 100 mL fetalt bovint serum (FBS) plus 10 mL ett antibiotikum/antimycotic lösning (en 100 x stabiliserad lösning) till en ny steril behållare. Lägg till DMEM medium för att justera blandningen upp till 1 000 mL. Förslut behållaren och hålla det vid 4 ° C.
    2. I ett tidigare värmde vattenbad (37 ° C), Frosta 1 injektionsflaska med MDA-MB-231-GFP (mänskliga bröstcancer cancer cellinje GFP-märkta, nukleära lokalisering) och 1 injektionsflaska med IMR-90-mCherry (cancer-associerade fibroblast cellinjer mCherry-märkt, med cytoplasmiska localization ) celler från flytande kväve lagring genom att flytta dem försiktigt i vattnet. Både cellinjer och plasmidsna för god Jordbrukarsed och mCherry märkning, är kommersiellt tillgängliga.
    3. Överföra 160 µL per brunn cell lösning (3 x 106 cell/mL) i en 6-väl plattan och tillsätt 5 mL uppvärmd (37 ° C) basala DMEM medium. Inkubera plattan på 37 °C/5% CO2 för 24-48 h tills cellerna når 80% sammanflödet.
    4. När cellerna når sammanflödet, kasta medlet och skölj cellerna två gånger med DPBS; Inkubera cellerna med 500 µL av trypsin-EDTA lösning per brunn (0,25%, 1 x, tidigare värmde vid 37 ° C) vid 37 ° C i 6 min. Sedan, inaktivera trypsin genom att lägga till 500 µL av FBS, återvinna cell lösningen och överföra det till T-75 kolvar. Inkubera dem igen vid 37 °C/5% CO2 tills cellerna når 80% sammanflödet.
      Obs: Volymen av trypsin-EDTA lösning kan variera beroende på celltillväxt fartyget.
    5. Upprepa föregående steg för att arbeta med celler på passagen 3-4 som är när celler har mer metabolisk aktivitet och stabilitet.
    6. Räkna de celler som använder en trypan blå assay (0,4%) för att bestämma den ursprungliga koncentrationen av celler för att blandas med hydrogel.

2. mätningar av reologiska egenskaper hos hydrogeler

  1. Förbereda alginat/gelatin hydrogel föregångaren som beskrivs i steg 1.2.
    Anmärkning: Sterila förhållanden behövs inte för prover som genereras för mekanisk provning och analys. Alla reologiska tester utförs i tre exemplar.
  2. Ta en spruta med hydrogel föregångaren och värma upp i 37 ° C vattenbad för 1 h.
  3. Slå på reometer och initiera systemet enligt följande steg.
    1. Slå på luftkompressorn ansluten till reometer och låt luftkompressorn kör för 30 min. slå på temperatur styrenheten för reometer, slå på reometer sig och slå på datorn ansluten till reometer.
    2. Öppna programvaran reometer, klicka på initiera på Kontrollpanelen och låt initieringsprocessen finish. Ställa in plattform temperatur till 37 ° C på Kontrollpanelen.
    3. Klicka på fliken mäta uppsättning och navigera till den Starta servicefunktion, Välj Justera driver tröghet i den nedrullningsbara menyn och klicka på Starta justering i popup-fönstret.
    4. Montera en parallell mätverktyg i reometer. Alla de experiment som utförs här använder en platta med 25 mm i diameter med ett 1 mm mellanrum mellan plattorna.
    5. Klicka på Ange noll-gap på Kontrollpanelen och vänta på förfarandet att avsluta. Uppmärksamma normalastyrkan under denna process.
      Obs: Efter detta förfarande, normalastyrkan ska vara 0.
    6. Klicka på fliken mäta uppsättning och navigera till den Starta servicefunktion, Välj Justera övre mäta system tröghetoch klicka på Starta justering i popup-fönstret. En gång gjort, click på triangelknappen på Kontrollpanelen för att tillåta mätverktyget att flytta upp.
  4. Genomföra en amplitud sopa.
    1. Klicka på Start, klicka på Infoga i den övre menyn, Välj vänta från droppa-ned menyn. Dra upp fönstret och ange väntetiden till 2 h.
      Obs: Detta kommer att lägga en väntetider steget innan testerna.
    2. Klicka på Start, sedan klicka på knappen Infoga igen och från den nedrullningsbara menyn, Välj enhet. Dra upp fönstret, Välj temperaturoch göra den till 25 ° C. Avmarkera rutan för vänta tills värdet har nåtts.
    3. Klicka på steget mätning, klicka sedan variabeln svängning stam, dra upp fönstret, ange profil för Ramp logaritmenoch ändra värdet till 0,001% och 100% som den ursprungliga stam och slutliga stam, respektive. Ställa in frekvensen på 0,01 Hz.
    4. Klicka på knappen Lägg till för att lägga till variabeln temperatur . Klicka på variabel temperatur och göra den till 25 ° C. I fönstret pull-up expandera kalkylator, satt punkt densitet till 10 punkter/årtionde.
    5. Ta ut sprutan ur vattenbadet och pressa ca 0,5 mL av föregångaren på reometer plattformen.
    6. Klicka på den nedåt triangel-knappen på Kontrollpanelen. Vänta tills mätverktyget att flytta ner till trimning position.
    7. Använd en spatel att trimma alla överskott prekursorer som rymt vid kanten av mätverktyget och kasta överflödiga materialet.
    8. Pipettera mineralolja på kanten av mätverktyget och vänta tills oljan helt tätar gränsen.
    9. Klicka på Fortsätt på Kontrollpanelen. Klicka på Start -knappen (grön triangel), följt av att klicka på Fortsätt -knappen på den nedre skärmen.
    10. När testningen är klar, släpp mätverktyget och klicka sedan på den uppåt triangel-knappen på Kontrollpanelen. Ta bort mätverktyget och rengör den med 70% etanol. Ren plattformen med 70% etanol.
    11. I det aktuella projektet, klicka på steget mätning och dra upp fönstret. Nu, ange hur ofta till 100 Hz. hålla alla andra parametrar som oförändrad.
    12. Upprepa steg 2.4.5 - 2.4.10.
    13. Klicka på diagrammet. Iaktta kurvan för G', G ” kontra den svängning stammen. Hitta nedböjning pekar av G' för båda frekvenser (0,01 Hz och 100 Hz). Hitta de motsvarande svängning stammarna för både nedböjning poäng.
    14. Välj mindre svängning stammen och 1/10 av denna stam för alla svängning tester utförs efteråt.
      Obs: Uppkomsten av G' nedböjning anses vara den ultimata linjära elastiska stam (Iktlinjer) som inte bör överskridas i uppföljande tester. Förhållandet 1/10 används vanligtvis i iscensätta för säkerhet resonerar. Detta beräknas stam betecknas som gC.
    15. Efter testet är gjort, klicka på tabell, kopiera alla data och klistra in den i en textfil.
  5. Genomföra en temperatur sopa.
    1. Klicka på Mina appar och välj mallen temperatur ramp, oscillerande skjuvning: Gelation.
    2. Namn projektet.
    3. Klicka på steget mätning i arbetsflödet. Klicka på variabeln temperatur, dra upp fönstret och ange den ursprungliga och slutliga temperaturen vara 37 ° C och 25 ° C, respektive.
    4. I fönstret pull-up inställd svängning stam på 0.1%, svängningen frekvens till 1Hz. Ange antalet datapunkter vara 61. Ange data collection frekvensen för 1 Poäng/min. Klicka på kalkylatorn och ange peka densitet till 0,2 ° C/punkt.
      Obs: Detta gör att temperaturen ändra med en hastighet på 0,2 ° C/min.
    5. Ladda provet på reometer plattformen och genomföra testet genom att följa steg 2.4.5 - 2.4.10.
    6. Klicka på diagrammet, Observera G', G ” jämfört med temperaturen. Hitta den crossover punkt av G' och G ”. Hitta temperaturen vid delningspunkten.
      Obs: Detta är sol/gel övergångstemperaturen av hydrogel föregångaren.
    7. Upprepa steg 2.4.15.
  6. Genomföra en isotermiska tid sopa.
    1. Klicka på Mina appar och hitta och klicka på mallen isotermiska tid-temperatur testa. Klicka på steget mätning i arbetsflödet, och klicka sedan på variabeln svängning stam, dra upp inställningsfönstret ange svängning stammen till 0,1% och ange svängning frekvensen 1 Hz. I fönstret pull-up, ange antalet datapunkter till 120. Ange data collection frekvensen till 1 punkt/min.
      Obs: Värdet av denna stam är baserad på resultaten från amplitud svepet.
    2. Klicka på Lägg till -knappen för att lägga till variabeln temperatur . Klicka på variabel temperatur i mellersta fönstret och ange det till 25 ° C.
      1. Högerklicka på steget enhet flyttar till mätpunkt i arbetsflödet, klicka på ta bort. Klicka på steget enhet värdet, avmarkera rutan vänta tills värdet har nåttsoch ange värdet till 25 ° C. Klicka på bilden, prick, knappar på skärmen botten, avmarkerar du kryssrutan Fortsätt. Klicka på steget Starta, namn projektet och spara den.
    3. Ladda provet på reometer plattformen och starta testet genom att följa steg 2.4.5 - 2.4.10.
    4. Observera att G', G ” kontra tiden. Hitta den crossover punkt av G' och G ”. Hitta tid vid delningspunkten. Efter testet är gjort, klicka på tabell, kopiera alla data och klistra in den i en textfil.
      Obs: Detta är sol/gel övergångstiden av hydrogel föregångare vid 25 ° C.
  7. Mäta sträckgräns på olika gelbildande gånger.
    1. Klicka på Mina appar och hitta och klicka på mallen avkastning och flöde stress, Gel-liknande. Namn projektet. Klicka på steget startar i arbetsflödet. Klicka på Infoga i toppmenyn och, i den nedrullningsbara menyn, Välj vänta. Dra upp fönstret och ange väntetiden vara 20 min.
      Obs: Detta kommer att lägga en väntetider steget innan testerna.
    2. Klicka på Start, klicka sedan Infoga igen och, i den nedrullningsbara menyn, Välj enhet. Dra upp fönstret, valde temperatur, och sätta den till 25 ° C. Avmarkera rutan vänta tills värdet har nåtts.
    3. Klicka på steget mätning i arbetsflödet, väljer en variabel skjuvspänning, dra upp fönstret och ange inledande och avslutande skjuvspänningen till 0 och 10 000 Pa, respektive.  Klicka på kalkylator, punkt densitet till 0.2 punkt/Pa. Ställ in 1 Poäng per sekund datapunkter på fliken till vänster.
      Obs: detta kommer att resultera i en stress rampning hastighet av 5 Pa/s.
    4. Klicka på fliken händelse kontroll längst ned i fönstret pull-up och ställa in stop kriteriet: stoppa mätningen om skjuvning Betygsätt > 100 s-1.
      Obs: Detta slutar automatiskt mätning om materialet gav.
    5. Ladda provet på reometer plattformen och starta testet genom att följa steg 2.4.5 - 2.4.10.
    6. Klicka på diagrammet. Observera den stam-stress-kurvan. Hitta deformationen av stammen och dess motsvarande stress. Upprepa steg 2.7.2 - 2.7.6, men ändra väntetiden till 30, 40 och 50 min för varje replikat; Detta kommer att resultera i sträckgräns på olika gelbildande gånger.
      Obs: Denna stress anses uppenbart sträckgräns.
      Obs: programvaran klick kan skilja sig genom reometer modeller och versioner av programvaran. Vi rekommenderar läsare att ta referens av testning parametrar vi tillhandahåller, tag se bruksanvisningen för specifika reometer/programvara i praktisk användning.
       

3. schavotten Design, Cell-lastad Hydrogel och 3D-utskrifter-modeller

  1. SCAFFOLD design
    1. Rita en propeller-liknande modell på papper.
      Obs: Propeller-liknande modell är konstruerad utifrån följande: a det simulerar i vivo scenariot där cancerceller är omgiven av CAFs; (b) det minimerar koncentrationen av stress via användning av cirkulär geometrier; (c) det är flexibel så att fler sektorer kan läggas in i modellen i framtiden utan att ändra de befintliga geometrierna; och (d) det är plant i dess vertikala skalan att underlätta näringsämnen diffusion.
    2. Låt stadens propellern vara ursprunget och använda symbolerna R0, R1och R2 för att representera maximal radien av den inre cirkeln, mellersta sektorer och yttre sektorer, respektive. Använda symboler m och n motsvarar antalet interna bågar och ekrar inuti området sektorn, respektive.
    3. Beräkna koordinaterna för varje nod på propeller-liknande modell och skriv dem i de symboliska uttryck för R0, R1, R2, moch n.
    4. Starta ett program skript, ange R0, R1, R2, moch n som variabler och mata in ett symboliskt uttryck för varje viktig nod.
      Obs: Se Tabell av material för programvaruinformation.
    5. Ordna en väg som förbinder noderna och tilldela en patron för den inre cirkeln, de mellersta sektorerna och de yttersta sektorerna. Ange lager tjocklek vara 150 µm och antalet lager vara 4.
    6. Låt programmet utgång en textfil i G-kod format som känns igen av bioprinter.
    7. Ange R0 = 3,85, R1 = 6,85, R2 = 8,65, m = 2 och n = 5. Kör skriptet och hämta den genererade G-kod-fil. Kopiera och klistra in filen till den bioprinter dedikerad G-kod mapp.
    8. Slå på bioprinter och dess styrprogram. Initiera skrivaren. Öppna G-kod skriptet bara skapade och alla tryck måste nollställas. Återgå till kontroll mjukvaran, klicka på fliken Scaffolder generatoroch klicka på knappen Kör på det nedre högra hörnet. Observera den rörliga sökvägen till skrivaren.
      Obs: Detta kommer att testa precisionen i den genererade G-koden. Se Tabell för material för information relaterad till bioprinter.
    9. Detta steg är valfritt. Bygga en demonstrativ 3D-modell utifrån parametrarna ovan via datorstödd konstruktion (CAD) programvara.
      Obs: Se Tabell av material för programvara leverantörsinformation.
  2. Gör en cell-lastad A3G7 hydrogel föregångare
    Obs: Stegen i detta avsnitt måste utföras under sterila förhållanden. Hålla bioprinter inuti en BSC.
    1. Sterilisera bioprinter genom sprutning 70% etanol grundligt och utsätta den för UV-ljus under natten.
    2. Ta ut en spruta med hydrogel föregångaren (vid 4 ° C) och värma den i vattenbad vid 37 ° C i 1 h.
    3. Ta T-kolven med celler (se steg 1.3) från CO2 inkubator och placera den inuti en BSC. Kassera odlingsmediet och skölj cellerna med DPBS två gånger. Lägga till en värmde trypsin-EDTA-lösning (3,0 mL) och inkubera cellerna vid 37 ° C i 6 min. inaktivera trypsin med samma volym av FBS. Räkna celler med trypan blå-analys.
    4. Ta ut sprutan av hydrogel föregångaren från vattenbadet, rengör och sterilisera den med 70% etanol. Sätta sprutan i BSC.
    5. Pressa ca 3 mL hydrogel föregångare i en 10 mL utskrift patron. Blanda föregångaren med MDA-MB-231-GFP celler på 1 x 106 celler/mL av långsamt pipettering, undvika produktion av bubblor. Täcka patronen med steril slutet och topp caps och försegla det med paraffin film. Centrifugera det 834 x g för 1 min att eliminera eventuella gasbubblor som produceras.
    6. Upprepa steg 3.2.3 - 3.2.5 för IMR-90-mCherry cell-lastad föregångaren och cellfria föregångaren.
    7. Sterilisera alla 3 patroner med 70% etanol och sedan ladda dem in i kamrarna av bioprinter. I skrivarens kontroll mjukvaran, ställa in patronen temperaturen till 25 ° C. Vänta 35 min för att tillåta föregångaren till nå utskrivbara villkor.
      Obs: Denna tid påverkar inte livskraften hos de celler som inbäddade i hydrogel.
  3. 3D-utskrift modeller
    1. I skrivarens kontroll mjukvaran, expandera fliken bearbetar huvudet i skrivarens kontroll mjukvaran, klicka på 1 patron på det grafiska gränssnittet på vänster sida och klicka sedan på knappen åtgärd kort för att mäta positionen för munstycksspetsen. Upprepa detta för övriga 2 patroner.
    2. Placera en klar polystyren mikroplattan, öppna G-code filen och ändra trycket till 200 kPa för alla patroner. Återgå till kontroll mjukvaran, klicka på fliken Scaffolder generator, Välj en punkt att starta utskriften och klicka sedan på knappen Kör på det nedre högra hörnet. Upprepa detta steg för att få 3 fler replikat.
    3. Lägg till en 100 mM CaCl2 lösning att tvärbinda modellerna för 1 min och skölj det efter utskrift alla replikat av propeller modeller, 2 x med DPBS att ta bort överskottet av Ca++ joner.
    4. Noggrant överföra modeller på en agaros-belagd 6-väl tallrik med en spatel. Tillsätt 5 mL av DMEM media till varje brunn. Inkubera plattorna i en inkubator på 37 ° C och 5% CO2.
      Obs: Kontrollera att modellerna är flytande i brunnarna.
    5. Ersätta cellodlingsmedium med färska medium var 3 dagar, kultur det för totalt 30 dagar.

4. bärkraft och sfäroid bildandet experiment på diskar med Hydrogel.

  1. Hydrogel disk förberedelse
    1. Upprepa steg 3.2.1 - 3.2.6.
      Obs: Det är möjligt att ersätta patronen med en liten steril behållare.
    2. Använd en steril graderad 1 mL-spruta och skär munstycket för att skapa ett stort hål i sprutan (hålet har samma diameter som resten av sprutan slangen). Rengör den med 70% etanol och lämna den tills den är torr.
      Obs: Gör i en steril BSC.
    3. Använd en väl-plattan locket, tillsätt 100 mM CaCl2 tills ytan är täckt; ta sedan den cell-lastad hydrogel att fylla sprutan; extrudera 100 µL med hängande släpp-metoden. Låt hydrogel för 1 min och skölj det med överdriven DPBS. Överföra hydrogel diskarna på en agaros-belagda 6-väl plattan, tillsätt 5 mL av basala DMEM och inkubera vid 37 ° C och 5% CO2 dem i upp till 30 dagar. Uppdatera mediet varje 3 dagar.
  2. Cell- och sfäroid livskraft
    1. Använda en MTS-analys för att avgöra cellviabiliteten. Tvätta varje disk med DPBS och skär den i 4 delar med fina sterila blad. Samla delarna av hela disken och överföra dem till en plattan med 96 brunnar. Sedan Tillsätt 100 μL av DMEM plus 20 μL av MTS reagensmedel till varje brunn och inkubera blandningen vid 37 ° C i 2 h.
    2. Efter MTS reaktionen, återställa supernatanten och överföra det till en ren 96-bra platta. Mät absorbansen hos proverna på 490 nm.
  3. Sfäroid bildandet
    1. Ta ut ruvade propeller eller disk modellen från inkubatorn dagar 0, 7, 15, 21 och 30 av kultur och överföra dem till en ren 6-bra platta.
    2. Använd en confocal spinning disk inverterade mikroskopet för att visualisera spheroids och förvärva bilderna med flera positioner och z-stackar. Bild varje propellern, eller disk modellen, längs dess horisontella diameter från vänster till höger med en 500 µm lucka och förvärva en z-stack från botten till topp fokalplanet på varje horisontell position.
      Obs: Se Tabell av material för leverantörsinformation.
    3. Rekonstruera bilden med en maximal stack aritmetiska verktyg, som tillhandahålls av programmet ImageJ, för att skapa 2D bilder används för en sfäroid analys.

5. svepelektronmikroskopi (SEM)

  1. Förbereda den alginat/gelatin hydrogel som beskrivs i steg 1.2.
    Anmärkning: Sterila förhållanden behövs inte.
    FÖRSIKTIGHET: Flytande kväve och paraformaldehyd är farliga och måste hanteras med försiktighet.
  2. Sätta 1 mL hydrogel i en mortel, lägga till flytande kväve och slipa den med en mortelstöt. Fortsätt lägga till flytande kväve för att undvika hydrogel från avfrostning. Överföra pulvret i en 1,5 mL centrifugrör, förslut den och förvara den vid-80 ° C för 2 h. kaseinbanden provet för 24 h.
  3. För sfäroid imaging, tvätta hydrogel försiktigt med DPBS 2 x, fixa cellerna genom nedsänkning i 4% PARAFORMALDEHYD under 30 minuter vid 37 ° C, och sedan skölja dem med DPBS och frysa dem med flytande kväve. Slutligen kaseinbanden provet för 24 h.
  4. Analysera hydrogel/sfäroid struktur och morfologi med ett svepelektronmikroskop (SEM) på 25,0 kV, under 70 Pa (kammare trycket) med en förstoring 40 X upp till 5, 000 X.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Temperatur svepet visar en tydlig skillnad i A3G7 föregångare vid 25 ° C och 37 ° C. Föregångaren är flytande vid 37 ° C och har en komplex viskositet av 1938.1 ± 84,0 mPa x s, som styrks av en större G ”över G'. Som temperaturen sjunker, genomgår föregångaren fysiska gelation på grund av den spontana fysiska sammanflätning av gelatin molekylerna i en tri-helix formation29,30. Båda på G' och G ”öka och konvergerar på 30,6 ° C, vilket indikerar en sol-gel övergång. Moduli fortsätter att öka, med minskad temperatur, når 468.5 ± 34,2 Pa av G' och 140,7 ± 9,3 Pa av G ”vid 25 ° C (figur 1a). Baserat på resultaten av temperatur svepet, valde vi 25 ° C som utskrift temperaturen. Gelation kinetik experimentet simulerar den temperaturförändring som uppstår under provberedning och hantering (dvsta bort provet från 37 ° C vatten bad och placera det i 25 ° C bioprinter kammaren). G', G ”, och | η * | öka med tiden på sänkt temperatur och sol-gel övergången sker på ~ 17 min vid 25 ° C, när G' ≈ G ”≈ 64,3 Pa och förlust faktor lika med 1 (figur 1b och 1 c). Föregångaren fortsätter att stelna och når en utskrift fönster efter 50-90 min gelation. Inom denna utskrift fönster, kan föregångaren vara pressad smidigt med en G25 cylindriska munstycke med trycket 200 kPa. Förekomsten av sträckgräns innebär en solid-liknande beteende av materialet och höjer den strukturella integriteten efter extrudering tål sin egen vikt31. Stress rampen erkänner sträckgränsen vid olika tider på gelation. Resultaten visar att sträckgränsen ökar med ökande gelation tiden. På 50 min av gelation, når sträckgränsen 325.9 Pa, att säkerställa att modellen är stabil efter extrudering.

Den tryckta propeller modellen visas i figur 2a. Konfokalmikroskopi bekräftar de inledande extrudering platserna både i MDA-MB-231-GFP och IMR-90-mCherry cellerna (figur 2b). MDA-MB-231-GFP cellerna börja utveckla spheroids 15 dagar in i kultur perioden, följt av ökad storlek och antal spheroids tills dag 30 (figur 2 c - 2f). Några av IMR-90-mCherry cellerna bildar också tätbebyggelse (figur 2 g - 2j). Märkbart, efter 30 dagar av kultur observeras IMR-90-mCherry celler i regionen initialt upptas av MDA-MB-231-GFP cellerna (figur 2f), vilket innebär möjlig migration händelser i modellen. Jämväl, migrerade MDA-MB-231-GFP celler kan också observeras i regionen IMR-90-mCherry dominerade på dag 30 (figur 2j).

Den disk modellen visas i figur 3a. Konfokalmikroskopi bekräftar homogen cell fördelningen inom disken (figur 3b). MDA-MB-231-GFP celler beter sig på samma sätt i den disk modellen som de gjorde när de skrivs ut som en propeller modell. Representativa bilder visas i figur 3 c - 3f. SEM imaging avslöjar en MDA-MB-231-GFP sfäroid-lastad hydrogel efter 21 dagar av kultur (figur 4a). Generering, och närvaro, sfäroid valideras genom att jämföra SEM bilder med cellfria hydrogels (figur 4b).

Cellviabiliteten båda celltyper demonstreras i figur 4 c. MDA-MB-231-GFP celler uttrycker en högre cellviabilitet jämfört IMR-90-mCherry celler. Intressant, uppvisa MDA-MB-231-GFP cellerna en ökad trend av lönsamhet före dag 15, med en tredubbling av antalet livskraftiga celler jämfört med dag 0. Detta följs av en minskning på dag 21, innan återskapa igen på dag 30. Däremot har IMR-90-mCherry cellerna minimala fluktuationer i lönsamhet under hela perioden kultur. Minskande värden lönsamhet av MDA-MB-231-GFP celler vid dag 21 motsvarar en stor MTCSs-formationen, vilken har utvecklat nekrotisk kärnor.

Figure 1
Figur 1: Reologisk karaktärisering av hydrogel föregångaren. (en) A temperatur sopa visar sol-gel övergången vid 30,6 ° C. (b-c) Gelation kineticsen av A3G7 föregångare visar en ökning med G', G ”, och | η*| på tiden av gelation och sol-gel sker övergången vid ca 17 min vid 25 ° C. (d) i denna panel visas sträckgränsen av föregångare kontra tiden av gelation. En ökning med sträckgräns observeras med en längre gelbildande tid. Resultaten visas i medelvärde ± SD, n≥ 3. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: MCTS formation inom en 3D bioprinted in vitro modell bestående av IMR-90-mCherry myofibroblast och MDA-MB-231-GFP bröstcancerceller. (en) dessa fotografier visar bioprinted in vitro- provet (vänster) och CAD-modellen (höger). (b) denna representativa confocal time-lapse bild visar den MDA-MB-231-GFP (grön) och IMR-90-mCherry (röd) celler bioprinted inom modellen. (c - f) Dessa zoom-ins Visa MDA-MB-231-GFP cell regioner (vita prickade rutorna). (g - j) dessa zoom-ins Visa IMR-90-mCherry cell regioner (gula prickade rutor). Skala barerna är 2 mm i panelen 2a, 1 mm i panelen 2boch 500 µm i paneler 2 c - 2j för utvalda områden, och förstoringen är 10 X. Huvudstaden ”D” i bilderna betyder ”dagar av kultur”. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: MCTS formation inom en 3D MDA-MB-231-GFP-lastad hydrogel disk. (en) Detta fotografi visar en hydrogel-disk. (b) denna representativa confocal bild visar MDA-MB-231-GFP celler inbäddade i komposit. (c-f) Dessa zoom-ins Visa MDA-MB-231-GFP cellen regionen (vita prickade rutan i panelen 3b) på (c), 0, (d) 7, (e), 15, och (f), 21 dagar av kultur. Skala barerna är 2 mm i panelen 3a, 1 mm i panelen 3boch 500 µm i paneler 3 c - 3f för utvalda områden, och förstoringen är 10 X. Huvudstaden ”D” i bilderna betyder ”dagar av kultur”. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: morfologi och cell livskraften i MTCSs. (en) Detta SEM-bild visar en MDA-MB-231-GFP MCTS inom gelen efter 21 dagar av kultur, visar små MCTS (pil-pekade). (b), detta SEM bild visar en alginat/gelatin hydrogel utan celler. Förstoringen är 350 X. (c) i denna panel visas cellernas viabilitet av MDA-MB-231-GFP och IMR-90-mCherry under 30 dagar av kultur inom hydrogel. Resultaten analyserades som det medelvärde ± SD och analyseras statistiskt med en tvåvägs ANOVA och en Bonferroni efter provningen. p (*) < 0,05, n ≥ 3. Data var normaliserade till cell densiteten används för att skapa proverna dag 0. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Cell-lastad strukturer kan äventyras om kontaminering (biologisk eller kemisk) sker vid något tillfälle i processen. Vanligt, biologisk förorening ses efter två eller tre dagar av kultur som en färg förändrad kultur media eller bioprinted struktur. Sterilisering (fysisk och kemisk desinfektion) är därför ett viktigt steg för alla cell-relaterade processer. Anmärkningsvärd, autoklavering gelatin ändras dess gelbildande egenskaper, vilket gjorde det gel långsammare i de studier vi genomfört. Därför steriliserade vi alginat och gelatin makt via UV exponering. På grund av den mycket begränsad penetration anlagen av UV-ljus, bör ett mycket tunt lager (< 0.5 mm) användas. Koncentrationen av alginat och gelatin kan godtyckligt ändras för att stämma den mekaniska och biologiska egenskaper32. I detta arbete valde vi A3G7, eftersom det ger önskvärt tryckbarhet under dess utskrift fönster och det tvärbundna hydrogel ger en hög stabilitet genom det 30-dagars experimentet. Värme till 60 ° C medan upplösning pulver i DPBS hjälper till att förbättra liquefication av gelatin, som underlättar omrörningen. Lägre temperatur kan också användas; dock kommer sedan en längre omrörning tid krävas.

Reologiska temperatur svepet ger en sol-gel punkt på 30,6 ° C, som är kompatibel med andra publikationer33. Teoretiskt sett kan alla temperaturer som är högre än 30,6 ° C vätskeform föregångaren. 37 ° C valde vi att förenkla arbetet, eftersom cellodlingsmedium är pre värmde i 37 ° C vattenbad. Baserat på gelation kinetik (innan de föregångare gelerna), finns det ca 17 min för cell blandning; efter denna tid är blanda cellerna och hydrogel föregångaren svårt på grund av ökad viskositet moduli, orsakar en inhomogen cell-lastad bioink. Vi föreslår därför, hantering av cell-blandning arbetet inom de första 10 min av gelbildande. Sträckgränsen anses inte vara en materiell attribut som påverkar tryckbarhet tills nyligen34; Oavsett, har det i stor utsträckning erkänts av polymer forskare som markör för pasty/granulat vätska31,35,36,37. Förekomsten av sträckgräns hjälper till att bygga upp en strukturell integritet att stå emot sin egen vikt. En hög sträckgräns kan också kräva en ökad start tryck i extrudering; Således kan detta resultera i skador i cellerna på grund av överdriven skjuvspänningen32. Modellen trohet kan äventyras om extruderingsprocessen sker utanför fönstret för optimal utskrift. Gemensamma indikatorer för problemet visas i den slutliga bioprinted strukturen: det kommer antingen vara för grovt eller alltför flytande vid kanterna. A3G7 föregångare uppvisar en optimal utskrift fönster under 50-90 min av gelbildande som uppfyller både de strukturella stabiliteten och cellöverlevnad och kan användas som mediet att bygga heterogena tumör modeller14.

Den totala höjden av propeller modellen är 600 µm som genereras från fyra lager 150 µm filament. Denna design tillåter näringsämnen och gas utbyte som cellerna är högst 300 µm från ytan att kontakta media under ruvningen. Högre modeller kan uppnås inom fabrication men är flaskhals vid begränsad spridning distansera av näringsämnen i den hydrogel38, vilket kan resultera i en låg cellöverlevnad i regionen kärna.

Olika strategier har utvecklats till formuläret MCTS i vitro, såsom hängande droppe, mikroflödessystem chip, montering och bioprinting39. Dock kan vissa av dessa metoder förändra cellfysiologi och biokemi, generera olika cell-problem som kan uppstå i normala tumörvävnad. Exempelvis hängande släpp metoden styrkor enda celler för att bo som cellen mängder genom fysisk inneslutning40. Även kan kemiska induktion att bilda MCTS genom en peptid tillägg förändra de spheroids41biokemi. Hydrogel sammansatt beskrivs här tillåter en MCTS formation genom att skapa en biomimetiska miljö utan externa stressfaktorer. (Mer än 6 celler per sfäroid), börjat som enda väl spridda celler, efter 7 dagar av kulturer, celler omorganisera som små MCTS och öka deras storlek och kvantitet under 30 dagar av kultur.

I resultaten av denna forskning fann vi att MDA-MB-231-GFP spheroids minskar cellviabiliteten dag 21, korrelera detta fenomen med bildandet av stora spheroids. En solid tumör består av tre olika lager, whereby det externa lagret presenterar en hög spridning takt jämfört med det mellersta lagret och interna nekrotisk eller senescent kärnan av sfäroid18. Detta kunde förklara livskraft minskningen av resultaten.

Detta begränsningar i detta protokoll är (1) bioink dynamics och (2) cell typ kompatibilitet. Bioink dynamics refererar till de varierande materialegenskaperna under gelation processen, vilket resulterar i en optimal utskrift fönster bortom vilken tryckt strukturen är defekt. Cell typ kompatibilitet refererar till incapacityen av vissa celltyper (cellinje eller primära kultur) att ställa ut en infödd i vivo -beteende.

Den A3G7 hydrogel uppnår en hög stabilitet och cell bärkraft. 3D bioprinting kan användas för att bygga 3D heterogen sjukdomsmodeller med hög genomströmning, låg kostnad och hög reproducerbarhet som ett mer realistiskt alternativ till traditionella cellkultur och små djur tumör modeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Tao Jiang tack Kina stipendium rådet (201403170354) och McGill Engineering forskarutbildning Award (90025) för sin stipendium finansiering. Jose G. Munguía-Lopez tack CONACYT (250279, 290936 och 291168) och FRQNT (258421) för sin stipendium finansiering. Salvador Flores-Torres tack CONACYT för deras stipendium finansiering (751540). Joseph M. Kinsella tack National Science och Engineering Research Council, det kanadensiska Institutet för Innovation, Townshend-Lamarre Family Foundation och McGill University för sin finansiering. Vi vill tacka Allen Ehrlicher för att tillåta oss att använda hans reometer, Dan Nicolau för att tillåta oss att använda hans confocal mikroskopet, och Morag Park för att bevilja oss tillgång till fluorescently märkt cellinjer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium alginate FMC BioPolymer CAS-No: 9005-38-3 Protanal LF 10/60 FT
Gelatin Sigma-Aldrich G9391 Type B gelatin from bovine skin
Dubelcco's phosphate buffered saline (DPBS 1X) Gibco LS14190136 1×, w/o calcium, w/o magnesium
Magnetic hotplate Corning  N/A Stirrer/hot plate model PC-420
50 mL centrifuge tubes Corning 352098 Falcon® 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, Sterile
Centrifuge GMI N/A Sorvall RT6000D, GMI, USA
Calcium chloride anhydrous Sigma-Aldrich C1016
MilliQ water Millipore N/A
Millipore 0.22 µm filters Millipore SLGS033SB Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm, mixed cellulose esters, 33 mm, ethylene oxide sterilized
Oscillation rheometer MCR 302 Anton Paar N/A
Rheometer measuring tool CP25 Anton Paar 79038 Conical plate geometry for rheometer
RheoCompass Anton Paar N/A Software controlling rheometer MCR 302
Scanning electron microscope Hitachi N/A SEM, Hitachi SU-3500 Variable Pressure
Paraformaldehyde, 96%, extra pure Acros Organics 416785000
Dulbecco modified eagle medium (DMEM) Gibco 11965092
Antibiotic/Antimycotic solution (100X) stabilized Sigma A5955
Fetal bovine serum Wisent Bioproducts 080-150
Cell culture T-75 flasks Sigma-Aldrich CLS430641 75 cm2 TC-Treated surface treatment
3D bioprinter BioScaffolder 3.1 GeSiM N/A
GeSim software GeSiM N/A Software controlling BioScaffolder 3.1
10cc cartridge UV resist EFD Nordson 7012126
End cap EFD Nordson 7014472
Tip cap EFD Nordson 7014469
Piston  EFD Nordson 7012182
Stainless nozzle G25 EFD Nordson 7018345
Water bath VWR N/A
Agarose Sigma-Aldrich A9539 Bioreagent, for molecular biology
Costar 6-well plates  Corning 3516 TC-Treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile 
Confocal spinning disk inverted microscope Olympus Life Science N/A Olympus IX83
MTS assay kit Promega G3582 CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay 
Live/Dead viability cytotoxicity kit Molecular Probes,ThermoFisher Scientific L3224
Trypsin 0.25/EDTA 1X Gibco 25200-072
Corning 96-well plate Corning 3595 Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplate, Individually Wrapped, with Low Evaporation Lid, Sterile
Autoclave Tuttnauer Heidolph Brinkmann N/A Heidolph Tuttnauer 2540E Autoclave Sterilizer Electronic Model with 4 Stainless Steel Trays, 23L Capacity
Trypan blue Invitrogen  T10282 0.4% solution
Ethanol Commercial Alcohols P016EA95 Greenfield Speciality Alcohols
CO2 Incubator Panasonic N/A MCO 19AIC-PA
Lyophilizer  SP Scientific N/A Virtis Sentry 2.0
SolidWorks Dassault Systems N/A A CAD software used to build demostrative propeller-like model
MATLAB The MathWorks N/A A programming software used to generate G-code for BioScaffolder 3.1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cui, X., Hartanto, Y., Zhang, H. Advances in multicellular spheroids formation. Journal of the Royal Society Interface. 14, (127), (2017).
  2. Yip, D., Cho, C. H. A multicellular 3D heterospheroid model of liver tumor and stromal cells in collagen gel for anti-cancer drug testing. Biochemical and Biophysical Research Communications. 433, (3), 327-332 (2013).
  3. Breslin, S., O'Driscoll, L. The relevance of using 3D cell cultures, in addition to 2D monolayer cultures, when evaluating breast cancer drug sensitivity and resistance. Oncotarget. 7, (29), 45745-45756 (2016).
  4. Yue, X., Lukowski, J. K., Weaver, E. M., Skube, S. B., Hummon, A. B. Quantitative proteomic and phosphoproteomic comparison of 2D and 3D colon cancer cell culture models. Journal of Proteome Research. 15, (12), 4265-4276 (2016).
  5. Priwitaningrum, D. L., et al. Tumor stroma-containing 3D spheroid arrays: a tool to study nanoparticle penetration. Journal of Controlled Release. 244, (Pt B), 257-268 (2016).
  6. Hong, S., et al. Cellular behavior in micropatterned hydrogels by bioprinting system depended on the cell types and cellular interaction. Journal of Bioscience and Bioengineering. 116, (2), 224-230 (2013).
  7. Dolati, F., et al. In vitro evaluation of carbon-nanotube-reinforced bioprintable vascular conduits. Nanotechnology. 25, (14), 145101 (2014).
  8. Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nature Biotechnology. 32, (8), 773-785 (2014).
  9. Kang, H. W., et al. A 3D bioprinting system to produce human-scale tissue constructs with structural integrity. Nature Biotechnology. 34, (3), 312-319 (2016).
  10. Miller, J. S., et al. Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nature Materials. 11, (9), 768-774 (2012).
  11. Jia, W., et al. Direct 3D bioprinting of perfusable vascular constructs using a blend bioink. Biomaterials. 106, 58-68 (2016).
  12. Kolesky, D. B., Homan, K. A., Skylar-Scott, M. A., Lewis, J. A. Three-dimensional bioprinting of thick vascularized tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, (12), 3179-3184 (2016).
  13. Lee, V., et al. Design and fabrication of human skin by three-dimensional bioprinting. Tissue Engineering Part C: Methods. 20, (6), 473-484 (2014).
  14. Jiang, T., et al. Directing the self-assembly of tumour spheroids by bioprinting cellular heterogeneous models within alginate/gelatin hydrogels. Scientific Reports. 7, (1), 4575 (2017).
  15. Knowlton, S., Onal, S., Yu, C. H., Zhao, J. J., Tasoglu, S. Bioprinting for cancer research. Trends in Biotechnology. 33, (9), 504-513 (2015).
  16. Derby, B. Printing and prototyping of tissues and scaffolds. Science. 338, (6109), 921-926 (2012).
  17. Nair, K., et al. Characterization of cell viability during bioprinting processes. Biotechnology Journal. 4, (8), 1168-1177 (2009).
  18. Costa, E. C., et al. 3D tumor spheroids: an overview on the tools and techniques used for their analysis. Biotechnology Advances. 34, (8), 1427-1441 (2016).
  19. Zhao, Y., et al. Three-dimensional printing of Hela cells for cervical tumor model in vitro. Biofabrication. 6, (3), 035001 (2014).
  20. Ling, K., et al. Bioprinting-based high-throughput fabrication of three-dimensional MCF-7 human breast cancer cellular spheroids. Engineering. 1, (2), 269-274 (2015).
  21. Liang, Y., et al. A cell-instructive hydrogel to regulate malignancy of 3D tumor spheroids with matrix rigidity. Biomaterials. 32, (35), 9308-9315 (2011).
  22. Szot, C. S., Buchanan, C. F., Freeman, J. W., Rylander, M. N. 3D in vitro bioengineered tumors based on collagen I hydrogels. Biomaterials. 32, (31), 7905-7912 (2011).
  23. Carey, S. P., Kraning-Rush, C. M., Williams, R. M., Reinhart-King, C. A. Biophysical control of invasive tumor cell behavior by extracellular matrix microarchitecture. Biomaterials. 33, (16), 4157-4165 (2012).
  24. Hospodiuk, M., Dey, M., Sosnoski, D., Ozbolat, I. T. The bioink: a comprehensive review on bioprintable materials. Biotechnology Advances. 35, (2), 217-239 (2017).
  25. Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13, (5), 405-414 (2016).
  26. Bhutani, U., Laha, A., Mitra, K., Majumdar, S. Sodium alginate and gelatin hydrogels: viscosity effect on hydrophobic drug release. Materials Letters. 164, 76-79 (2016).
  27. Biswal, D., et al. Effect of mechanical and electrical behavior of gelatin hydrogels on drug release and cell proliferation. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 53, 174-186 (2016).
  28. Rowley, J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials. Biomaterials. 20, (1), 45-53 (1999).
  29. Djabourov, M., Leblond, J., Papon, P. Gelation of aqueous gelatin solutions. I. Structural investigation. Journal de Physique (France). 49, (2), 319-332 (1988).
  30. Djabourov, M., Leblond, J., Papon, P. Gelation of aqueous gelatin solutions. II. Rheology of the sol-gel transition. Journal de Physique (France). 49, (2), 333-343 (1988).
  31. Coussot, P. Rheometry of Pastes, Suspensions, and Granular Materials: Applications in Industry and Environment. Wiley-Interscience. Hoboken, NJ. (2005).
  32. Ouyang, L., Yao, R., Zhao, Y., Sun, W. Effect of bioink properties on printability and cell viability for 3D bioplotting of embryonic stem cells. Biofabrication. 8, (3), 035020 (2016).
  33. Michon, C., Cuvelier, G., Launay, B. Concentration dependence of the critical viscoelastic properties of gelatin at the gel point. Rheologica Acta Rheologica Acta: An International Journal of Rheology. 32, (1), 94-103 (1993).
  34. Mouser, V. H., et al. Yield stress determines bioprintability of hydrogels based on gelatin-methacryloyl and gellan gum for cartilage bioprinting. Biofabrication. 8, (3), 035003 (2016).
  35. Benbow, J. J., Oxley, E. W., Bridgwater, J. The extrusion mechanics of pastes-the influence of paste formulation on extrusion parameters. Chemical Engineering Science. 42, (9), 2151-2162 (1987).
  36. Bingham, E. C. Fluidity and plasticity. McGraw-Hill. New York, NY. (1922).
  37. Horrobin, D. J., Nedderman, R. M. Die entry pressure drops in paste extrusion. Chemical Engineering Science. 53, (18), 3215-3225 (1998).
  38. Soman, P., et al. Cancer cell migration within 3D layer-by-layer microfabricated photocrosslinked PEG scaffolds with tunable stiffness. Biomaterials. 33, (29), 7064-7070 (2012).
  39. Asghar, W., et al. Engineering cancer microenvironments for in vitro 3-D tumor models. Materials Today. 18, (10), 539-553 (2015).
  40. Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3, (9-10), 1172-1184 (2008).
  41. Akasov, R., et al. Formation of multicellular tumor spheroids induced by cyclic RGD-peptides and use for anticancer drug testing in vitro. International Journal of Pharmaceutics. 506, (1-2), 148-157 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics