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JoVE Science Education General Laboratory Techniques Introduction au spectrophotomètre

Introduction au spectrophotomètre

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Le spectrophotomètre est un instrument omniprésent utilisé dans la recherche biologique, chimique, clinique et environnemental.

Spectrophotométrie est la mesure quantitative de la quantité d'une substance chimique absorbant la lumière en faisant passer un faisceau de lumière à travers l'échantillon en utilisant un spectrophotomètre.

En mesurant l'intensité de la lumière détectée, cette méthode peut être utilisée pour déterminer la concentration de soluté dans l'échantillon.

Le faisceau de lumière qui est rayonnée vers l'échantillon est constitué d'un flux de photons.

Lorsque les photons rencontrent molécules dans l'échantillon, les molécules peuvent absorber une partie d'entre eux, ce qui réduit le nombre de photons dans le faisceau de lumière et la diminution de l'intensité du signal détecté.

La transmittance représente la fraction de la lumière qui passe à travers l'échantillon et qui est définie comme l'intensité de la lumière passant à travers l'échantillon au cours de l'intensité de la lumière incidente. Absorbance est le logarithme inverse de Transmittance et la quantité de votre spectrophotomètre mesurer.

De l'absorbance, la concentration de la solution d'échantillon peut être déterminée à partir de la loi de Beer-Lambert, ce qui indique qu'il existe une relation linéaire entre l'absorbance et la concentration d'un échantillon. Selon la loi de Beer-Lambert, DO est le produit du coefficient d'extinction, une mesure de la force avec un soluté absorbe la lumière à une longueur d'onde donnée, la longueur de cette lumière traverse l'échantillon, ou la longueur du trajet, et la concentration de soluté. Souvent, le but de prendre des mesures d'absorbance est de mesurer la concentration d'un échantillon.

Chaque spectrophotomètre comprend une source lumineuse, un collimateur, qui est une lentille ou un dispositif de focalisation qui émet un faisceau intense tout droit de la lumière, un monochromateur pour séparer le faisceau de lumière en ses longueurs d'onde composantes, et un sélecteur de longueur d'onde, ou une fente, pour sélectionner l' longueur d'onde souhaitée. Les longueurs d'onde de la lumièreutilisé dans spectrophotomètres abordés dans cette vidéo sont dans l'ultraviolet et visible. Le spectrophotomètre comprend également une sorte de support d'échantillon, un détecteur photoélectrique, qui détecte la quantité de photons qui sont absorbés, et un écran pour afficher la sortie du détecteur.

Les nouveaux spectrophotomètres sont directement couplés à un ordinateur, où les paramètres d'expérimentation peuvent être contrôlés et les résultats sont affichés.

Lors de l'exécution spectrophotométrie, assurez-vous de prendre les précautions appropriées, telles que le port de gants, selon le type de solutions biologiques ou chimiques avec lesquels vous travaillez.

Avant de mesurer le spectre UV-visible d'un échantillon, tourner sur la machine et permettent aux lampes et d'appareils électroniques pour se réchauffer.

Préparer une ébauche de la même solution, mais sans la substance à analyser, présentant le même pH et de force ionique comparable, une étape nécessaire de la cellule et de solvant peut disperser la lumière.

Spectrophotomètre traditionnel sdétenteurs de vastes sont conçus pour contenir des cuvettes en plastique et de quartz. Passez à la pipette la solution de blanc dans la cuvette.

Après avoir essuyé les empreintes digitales et les déversements au large de l'extérieur de la cuvette, insérer correctement la cuve dans le porte-échantillon et fermer la porte du compartiment de cuvette.

Ne jamais oublier de fermer la porte rayonnement UV émis par un spectrophotomètre ouverte peut endommager les yeux et la peau.

Régler la longueur d'onde désirée ou une plage de longueurs d'onde à transmettre à l'échantillon, qui est fonction de la longueur d'onde optimale de la lumière que l'analyte absorbe. Ensuite, le zéro de l'instrument par la prise d'une lecture de l'ébauche, qui soustrait le fond de votre mémoire tampon d'échantillons.

Selon le type d'expérience spectrophotométrie vous effectuez, il peut être nécessaire de générer une courbe standard avant la mesure de l'échantillon, à partir de laquelle la concentration de l'échantillon analyte peut éventuellement être déterminé.

Laisser l'échantillon pour atteindre la tempéra appropriéure et mélanger doucement, de sorte que les bulles ne sont pas introduits. L'échantillon peut leur être ajouté directement à la cuve, à l'intérieur de l'instrument, et une lecture prise.

Après avoir effectué la mesure de l'absorbance sur votre échantillon, procéder au calcul correspondant à votre expérience, par exemple détermination de la concentration ou le taux d'activité de l'enzyme.

Le spectrophotomètre est utilisé sur une base quotidienne dans de nombreux laboratoires de recherche biologique.

Une application courante du spectrophotomètre est la mesure de la densité cellulaire. mesure de la densité cellulaire est utile dans la génération de courbes de croissance logarithmique des bactéries, à partir de laquelle le moment optimal pour l'induction d'une protéine recombinante peut être déterminée.

Le spectrophotomètre peut également être utilisé pour mesurer la vitesse des réactions chimiques. Dans cet exemple, l'absorbance est utilisé pour surveiller une réaction enzymatique par la disparition d'un intermédiaire réactionnel à 452 nm au cours du temps. Le taux de cette étape enzymatique cun être calculée en ajustant les données à l'équation appropriée.

Récemment, l'introduction de spectrophotomètres micro-volumes a éliminé la nécessité pour les détenteurs de l'échantillon. Ces spectrophotomètres utilisent la tension de surface pour contenir l'échantillon.

Spectrophometers micro-volumes sont optimales pour mesurer la qualité et la concentration des échantillons coûteux de volume limité, comme des biomolécules, y compris les protéines et les acides nucléiques.

L'absorbance de la protéine à 280 nm dépend de la teneur en chaînes latérales aromatiques présents dans le tryptophane, la tyrosine, la phénylalanine et, ainsi que l'existence de liaisons disulfure cystéine-cystéine.

La concentration en protéines est déterminée à partir de son absorbance à 280 nm et son coefficient d'extinction, qui est basée sur la composition en acides aminés.

L'ADN et l'ARN ont un maximum d'absorption à 260 nm à partir de laquelle la concentration peut être déterminée. La pureté de l'acide nucléique peut également être évaluée à partir du rapport de l'absorbance lirements aux longueurs d'onde spécifiques.

Vous avez juste regardé l'introduction de Jupiter au spectrophotomètre.

Dans cette vidéo, nous avons examiné quelques principes de base, y compris les concepts de spectrophotométrie et composants du spectrophotomètre. Nous avons également montré étape par étape le fonctionnement du spectrophotomètre et a discuté de son utilisation dans la recherche biologique. Merci de votre attention.

Summary

Le spectrophotomètre est un instrument utilisé couramment dans la recherche scientifique. Spectrophotométrie est la mesure quantitative de la quantité d'une substance chimique absorbant la lumière en faisant passer un faisceau de lumière à travers l'échantillon en utilisant un spectrophotomètre. Dans cette vidéo, les concepts de base en spectrophotométrie, dont la transmittance, absorbance et la loi de Beer-Lambert sont examinées en plus des composantes du spectrophotomètre. Ces concepts constituent une base pour la façon de déterminer la concentration d'un soluté dans une solution qui est capable d'absorber la lumière dans le domaine ultraviolet et visible. En outre, une procédure pour savoir comment utiliser le spectrophotomètre est démontrée, y compris des instructions sur la façon de masquer et de mesurer l'absorbance d'un échantillon à la longueur d'onde désirée. La vidéo explique également comment faire une courbe standard pour la détermination de la concentration de l'analyte. Plusieurs applications du spectrophotomètre dans la recherche biologique sont discutés, tels que la mesure of densité cellulaire et la détermination des taux de réaction chimique. Enfin, le spectrophotomètre microvolume est introduit, ainsi que son avantage dans la mesure de la qualité et de la quantité de protéines et d'acides nucléiques.

Applications

 JoVE Immunology and Infection

Simple et robuste In vivo Et In vitro Démarche pour l'étude de l'assemblage du virus


JoVE 3645 3/01/2012

1Department of Plant Pathology and Microbiology, University of California, Riverside, 2Department of Bioengineering, University of California, Riverside

This video presents a procedure for studying virus assembly in vivo and in vitro. In this procedure, the concentration of brome mosaic virions and capsid protein subunits is determined through ultraviolet spectrophotometry for preparation of in vitro encapsidation.

 JoVE Bioengineering

Suivi des réduction et par oxydation demi-réactions d'une monooxygénase flavine-dépendante à l'aide Stopped-Flow Spectrophotométrie


JoVE 3803 3/18/2012

1Department of Biochemistry, Virginia Polytechnic Institute and State University

This procedure uses a stopped-flow instrument to detect the different spectral forms of a flavin dependent monooxygenase and measure rates. Spectrophotometry is used to measure the absorbance of reaction intermediates over time in order to determine the rate of an enzyme catalyzed reaction.

 JoVE Bioengineering

Hydrophobe sel modifié Nafion pour l'immobilisation d'enzymes et de stabilisation


JoVE 3949 7/11/2012

1Departments of Chemistry and Materials Science and Engineering, University of Utah

This video presents a novel method for the synthesis of a micellar enzyme immobilization membrane that can stabilize enzymes. The video then demonstrates detailed procedures for assaying the activity of several enzymes using a UV-visible spectrophotometer.


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