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JoVE Science Education Les techniques générales de laboratoire Introduction au Spectrophotomètre

Introduction au Spectrophotomètre

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Le spectrophotomètre est un instrument utilisé de façon ubiquitaire dans la recherche biologique, chimique, clinique et environnementale.

La spectrophotométrie est la mesure de la quantite de lumière qu’une substance chimique peut absorber, en faisant passer un faisceau de lumière à travers un échantillon dans un spectrophotomètre.

En mesurant l’intensité de lumière détectée, cette méthode peut être utilisée pour déterminer la concentration de soluté dans l’échantillon.

Le faisceau de lumière qui est envoyé vers l’échantillon est fait d’un faisceau de photons.

Lorsque les photons rencontrent les molécules dans l’échantillon, les molécules peuvent absorber certains d’entre eux, réduisant le nombre de photons dans le faisceau de lumière et diminuant l’intensité du signal détecté.

La transmission est la portion de lumière qui passe à travers l’échantillon. Elle est définie comme l’intensité de lumière passant à travers l’échantillon sur l’intensité de lumière incidente.

L’absorbance est l’opposé du logarithme de la transmission et correspond à la quantité que le spectrophotomètre va mesurer.

A partir de l’absorbance, la concentration dans l’échantillon de solution peut être déterminée à partir de la loi de Beer-Lambert, qui stipule qu’il y a une relation linéaire entre l’absorbance et la concentration de l’échantillon. Selon la loi de Beer-Lambert, l’absorbance est le produit du coefficient d’absorption, une mesure de la quantité de lumière absorbée par un soluté à une longueur d’onde donnée, avec la distance que la lumière parcourt à travers l’échantillon, ou distance parcourue, et la concentration du soluté. Souvent, l’objectif en mesurant l’absorbance est de mesurer la concentration de l’échantillon.

Chaque spectrophotomètre contient une source de lumière, un collimateur (une lentille ou un dispositif de focalisation qui transmet un faisceau de lumière intense et droit), un monochromateur pour séparer le faisceau de lumière en ses différentes longueurs d’ondes, et un sélecteur de longueur d’onde, ou fente, pour la sélection de la longueur d’onde désirée. Les longueurs d’ondes de lumière utilisées dans les spectrophotomètres presentés dans cette vidéo sont dans la gamme de l’ultraviolet et du visible. Le spectrophotomètre contient aussi un porte-échantillon, un détecteur photoélectrique et un écran pour afficher le résultat du détecteur.

Les spectrophotomètres récents sont directement couplés à un ordinateur, où les paramètres d’expérimentation peuvent être contrôlés et les résultats sont affichés.

Lors de la réalisation d’une spectrophotométrie, assurez-vous de prendre les précautions appropriées, comme le port de gants, selon le type de solutions biologique ou chimique avec lesquelles vous travaillez.

Avant de mesurer le spectre UV-visible de l’échantillon, allumez l’appareil et laissez les lampes et composants électroniques chauffer.

Préparez un échantillon vierge de la même solution, ayant le même pH et une force ionique similaire, mais sans le composant analysé; l’analyse de cet échantillon est une étape nécessaire vu que la cuvette et le solvant peuvent disperser la lumière.

Les porte-échantillons de spectrophotomètre traditionnel sont conçus pour accueillir des cuvettes en plastique et en quartz. Pipetez la solution vierge dans la cuvette.

Après avoir essuyé toute empreinte de doigts et éclaboussures sur l’extérieur de la cuvette, insérez correctement la cuvette dans le porte-échantillon et fermez la porte du compartiment à cuvettes.

N’oubliez jamais de fermer la porte, car la radiation UV émise depuis un spectrophotomètre ouvert peut endommager les yeux et la peau.

Programmez la longueur d’onde désirée ou la gamme de longueurs d’onde qui sera transmise à l’échantillon. Celle-ci va dépendre de la longueur d’onde optimale que le composant analysé peut absorber. Ensuite, mettez la machine à zéro en prenant une mesure de l’échantillon vierge, ce qui permettra de soustraire l’absorbance de fond due au tampon de l’échantillon.

En fonction du type d’expérience spectrophotométrique que vous réalisez, il peut être nécessaire de générer une courbe standard avant la mesure des échantillons, à partir de laquelle la concentration du composé analysé dans vos échantillons pourra finalement être déterminée.

Laissez l’échantillon atteindre la température appropriée et mélangez le doucement, de manière à ne pas introduire de bulles. L’échantillon peut alors être ajouté directement à la cuvette, à l’intérieur de la machine, et une lecture peut etre réalisée.

Après la réalisation de la mesure d’absorbance sur l’échantillon, procédez au calcul approprié pour votre expérience ; par exemple la détermination de la concentration ou du taux d’activité enzymatique.

Le spectrophotomètre est utilisé quotidiennement dans beaucoup de laboratoires de recherche biologique.

Une des utilisations habituelles du spectrophotomètre est la mesure de la densité de cellules. La mesure de densité de cellules est utile pour générer des courbes de croissance logarithmique pour les bactéries, à partir desquelles le temps optimal pour l’intégration de protéines recombinantes peut être déterminé.

Le spectrophotomètre peut aussi être utilisé pour mesurer les taux de réaction chimique. Dans cet exemple, l’absorbance est utilisée pour surveiller une réaction enzymatique, par la disparition d’une réaction intermédiaire à 452 nm au cours du temps. Le taux de cette étape enzymatique peut être calculé en assortissant les données à l’équation appropriée.

Récemment, l’introduction de spectrophotomètres pour micro-volume a éliminé le besoin de porte-échantillons. Ces spectrophotomètres utilisent la tension de surface pour tenir l’échantillon.

Les spectrophotomètres pour micro-volume sont optimaux pour mesurer la qualité et la concentration de couteux échantillons de petit volume, tels que les biomolécules, incluant les protéines et acides nucléiques.

L’absorbance d’une protéine à 280 nm dépend du contenu en chaînes latérales aromatiques trouvées dans le tryptophane, la tyrosine, et la phénylalanine, ainsi que l’existence de ponts disulfure entre deux cystéines.

La concentration d’une protéine peut être déterminée à partir de son absorbance à 280 nm et de son coefficient d’absorption, qui est basé sur la composition de l’acide aminé.

L’ADN et l’ARN ont une absorbance maximale à 260 nm, à partir de laquelle leur concentration peut être déterminée. La pureté de l’acide nucléique peut aussi être évaluée à partir du ratio des lectures d’absorbance à des longueurs d’onde spécifiques.

Vous venez de regarder l’introduction de JoVE au spectrophotomètre. Dans cette vidéo nous avons vu quelques principes de base, incluant les concepts de la spectrophotométrie et les composants d’un spectrophotomètre. Nous avons aussi montré le fonctionnement étape par étape du spectrophotomètre, et discuté de ses utilisations en recherche biologique.

Merci de nous avoir regardé!

Summary

Le spectrophotomètre est un instrument utilisé systématiquement en recherche scientifique. La spectrophotométrie est la mesure quantitative de lumière qu’une substance chimique absorbe en faisant passer un faisceau lumineux à travers l’échantillon dans un spectrophotomètre.

Dans cette vidéo, les concepts de base de spectrophotométrie, ce qui inclut la transmission, l’absorbance et la loi de Beer-Lambert sont vus en plus des composants du spectrophotomètre. Ces concepts fournissent une base afin de déterminer la concentration d’un soluté en solution qui est capable d’absorber la lumière dans la gamme de l’ultraviolet et du visible. De plus, une procédure pour faire fonctionner un spectrophotomètre est expliquée, incluant les instructions pour comment réaliser la mise à zéro et comment réaliser la mesure de l’absorbance d’un échantillon à la longueur d’onde désirée. La vidéo explique aussi comment réaliser une courbe standard pour la détermination de la concentration du composant analysé. Plusieurs utilisations du spectrophotomètre en recherche biologique sont discutées, comme la mesure de la densité cellulaire et la détermination de taux de réaction chimique. Finalement, le spectrophotomètre à micro-volume est présenté, ainsi que ses avantages dans la mesure de la qualité et la quantité de protéines et d’acides nucléiques.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Les techniques générales de laboratoire. Introduction au Spectrophotomètre. JoVE, Cambridge, MA, doi: 10.3791/5038 (2014).

Applications

 JoVE Immunology and Infection

Simple et robuste In vivo Et In vitro Démarche pour l'étude de l'assemblage du virus


JoVE 3645 3/01/2012

1Department of Plant Pathology and Microbiology, University of California, Riverside, 2Department of Bioengineering, University of California, Riverside

This video presents a procedure for studying virus assembly in vivo and in vitro. In this procedure, the concentration of brome mosaic virions and capsid protein subunits is determined through ultraviolet spectrophotometry for preparation of in vitro encapsidation.

 JoVE Bioengineering

Suivi des réduction et par oxydation demi-réactions d'une monooxygénase flavine-dépendante à l'aide Stopped-Flow Spectrophotométrie


JoVE 3803 3/18/2012

1Department of Biochemistry, Virginia Polytechnic Institute and State University

This procedure uses a stopped-flow instrument to detect the different spectral forms of a flavin dependent monooxygenase and measure rates. Spectrophotometry is used to measure the absorbance of reaction intermediates over time in order to determine the rate of an enzyme catalyzed reaction.

 JoVE Bioengineering

Hydrophobe sel modifié Nafion pour l'immobilisation d'enzymes et de stabilisation


JoVE 3949 7/11/2012

1Departments of Chemistry and Materials Science and Engineering, University of Utah

This video presents a novel method for the synthesis of a micellar enzyme immobilization membrane that can stabilize enzymes. The video then demonstrates detailed procedures for assaying the activity of several enzymes using a UV-visible spectrophotometer.


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