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Biology

Katheterisierung der Darmschlingen bei Wiederkäuern

Published: June 11, 2009 doi: 10.3791/1301

Summary

Wir beschreiben eine neuartige OP-Methode zur Katheterisierung "Darmschlingen" im Ileum von Schafen. Sobald Tiere haben sich von der Operation erholt haben und gelöscht Antibiotika und Analgetika können mehrere Behandlungen direkt in Schlaufen über den Katheter hinterlegt.

Abstract

Der Darm ist ein komplexes Gebilde, das nicht nur in die Aufnahme von Nährstoffen beteiligt ist, sondern fungiert auch als eine Barriere zwischen dem Individuum und der Außenwelt. Insofern spielt der Darm eine zentrale Rolle in Immunüberwachung und Schutz vor Darm-Erreger. Untersuchung Darm-Physiologie und Immunologie allgemein beschäftigt "Darmschlingen" als ein experimentelles Modell. Die Mehrzahl dieser Schleife Modelle sind Nichtwiedereinziehung operative Eingriffe, die kurzfristig (<24 h) Veränderungen im Darm (1-3) zu studieren. Wir zuvor erstellte eine Erholung Darmschlinge Modell gezielt messen langfristige (<6 Monate) immunologische Veränderungen im Darm der Schafe nach Exposition mit Impfstoffen, Adjuvantien und Viren (4). Dieses Verfahren lokalisiert auf einen speziellen 'Schleife', so dass wir diesen Bereich des Darms Probe. Ein wesentlicher Nachteil dieser Methode ist das einzige Fenster der Gelegenheit, Behandlungen (dh zum Zeitpunkt der Operation) zu verwalten. Darüber hinaus können Proben sowohl der Darmschleimhaut und luminalen Inhalte nur bei Beendigung des Projekts getroffen werden. Sonstige wichtige Einschränkungen der oben genannten Modell, dass die chirurgische Manipulation und erforderliche postoperative Maßnahmen (zB Verabreichung von Antibiotika und Analgetika) kann direkt Einfluss auf die Behandlung selbst und / oder zu verändern Immunfunktion, damit verwirrende Ergebnisse. Deshalb haben wir unsere Darmschlinge Modell, indem Sie langfristige Katheter in die Schlaufen geändert. Sheep vollständig erholen von dem Verfahren und sind unabhängig von den exteriorisierten Kathetern. Insbesondere ermöglicht die Einrichtung von Kathetern in Schlaufen uns mehrere Behandlungen über einen längeren Zeitraum einführen, nach Erholung von der Operation und die Clearance von Medikamenten während der Operation verabreicht und die postoperativen Phase.

Protocol

Versuchsdurchführung:

  1. Alle Instrumente sind autoklaviert; nicht autoklavierbar Materialien sind in Germex Kaltsterilisation Lösung für ein Minimum von 10 min sterilisiert.
  2. Schafe sind pre-medizinischen mit Acepromazin (0,05 mg / kg), Glycopyrrolat (0,005 mg / kg) und Butorphanoltartrat (0,2 mg / kg) IM, und links für 15-20 min.
  3. Der Hals ist rasiert und die Haut chirurgisch abgetrennt. Sobald die Jugularvene wird visualisiert, 0,1 ml Lidocain injiziert wird SC über die Vene, den Katheter in die Vene eingeführt und an der Haut mit Kennzeichnung von Nutztieren tag Zement und 2 "Krankenhaus-Band. Während der Operation werden die Tiere gegeben 10 ml / kg / h Plasmalyte 148 (durch Schwerkraft).
  4. Diazepam (0,2 mg / kg) verabreicht wird, IV und Anästhesie mit Thiopental-Natrium (10 mg / kg) induziert. Lidocain endotracheale Spray auf die Stimmlippen angewendet wird, wird die Schafe intubiert und instand zu halten Isofluran (1.5-2.5% in 100% O 2 mit einer Rate von 4 L / min) für die Dauer der Operation.
  5. Das Tier ist in Rückenlage auf einem beheizten Matte gelegt, um zur Aufrechterhaltung der Körpertemperatur während der Operation. Eine Magensonde wird in den Pansen eingeführt, um übermäßige Tympanie zu verhindern.
  6. Die ventralen Bauch rasiert und die Haut ist für die Operation mit drei Prepodyne chirurgischen scheuert vorbereitet. Der Bauch ist dann drapiert, dass entsprechende Belichtung des OP-Gebiet (Nabel nach kaudal Abdomen) wird beibehalten.
  7. Ein 15-20 cm Mittellinienschnitt erfolgt mit einem electroscapel, kaudal vom Nabel und der Bauhin-fach in der rechten unteren Quadranten des Bauches entfernt. Der kaudale Ileum und Caecum sind dann exteriorisierten. Während des gesamten Verfahrens ist die Handhabung des Darms minimiert und darauf geachtet wird, um sicherzustellen, das exteriorisierten Darm gehalten wird feucht mit warmem (37-39 ° C) steriler Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS, pH 7,2).
  8. Ein 85 cm Segment Ileum (dh die "Darm-Segment ') wird gemessen und dann gespannt mit Doyen Pinzette (Darmklammern) und große Kelly Pinzette an jedem Ende des Segments. Innerhalb der Darm-Segment wird "Loops" und "Zwischenräume" zwischen den Schleifen hergestellt werden. Doyen Zangen sind auf der Seite des Ileum zu verbindenden (Anastomose) platziert werden, und die Kelly Zange auf die intestinale Segment Seite des Ileum platziert.
  9. Das Ileum ist zwischen den einzelnen Doyen und Kelly ForceP geschnitten und die Darm-Segment for-Schleifen bezeichnet wird sanft zweimal mit 60 ml warmem PBS gespült, um Ingesta zu entfernen.
  10. Ein Cocktail aus Breitspektrum-Antibiotika (200 mg Enrofloxacin und 250 mg Metronidazol in warmen PBS, 60 ml Gesamtvolumen) ist im gesamten Darm-Segment verteilt und links für 30 min.
  11. Die proximalen und distalen geschnittenen Enden des Ileums (mit Ausnahme der intestinalen Segment) verbunden sind, um eine kontinuierliche und funktionale Darm-Trakt bilden. Erstens ist das Ileum von zwei Haltefäden ausgerichtet, platziert an der mesenterialen und antimesenteriale Grenzen des Darms bzw.. Dann wird eine einfache fortlaufende Naht Muster (2-0 Vicryl) auf beiden Seiten des Darms durchgeführt, um den Darm miteinander zu verbinden.
  12. Warm PBS (3-5 ml) wird bei der Anastomose injiziert, um auf Dichtheit und Naht Scheitern zu überprüfen. Dann wird die Spitze des Kelly ForceP gegen die seröse Oberfläche des Darms gedrückt wird, um den Ort der Anastomose zu schließen, und Fortgeschrittene innen an der Anastomose, um sicherzustellen, das Darmlumen ist groß und Patentanmeldungen.
  13. Das Antibiotikum-Cocktail aus dem Darm-Segment entfernt. Durch eine invertierende Naht Muster mit 2-0 Vicryl gefolgt; Jedes Ende des Segments ist mit einer einfachen fortlaufenden Naht Muster (2-0 Vicryl resorbierbares Nahtmaterial) geschlossen.
  14. Die 85 cm langen Darm-Segment ist in drei 15 cm "Schleifen", zwei 15 cm langen "Zwischenräume" zwischen den Schlaufen und zwei 5 cm lange blunt-end Fächer an den Enden der Darm-Segment (Abbildung 1) partitioniert . Die Schleifen sind, indem eine Ligatur um den Darm mit 2-0 Seide angelegt. Es ist bemerkenswert, dass die großen Mesenterialgefäße nicht während dieses Vorgangs unterbunden, da diese notwendig sind, um den Darm mit Blut versorgen, die Aufrechterhaltung Darm Lebensfähigkeit. Auch sind die Ligaturen lang, links wie sie verwendet werden, um den Katheter zu sichern.
  15. Katheter (dh Silastic Schläuche) sind einzeln gekennzeichnet mit einem Permanent-Marker. Ein Silizium-Kugel (5 mm Durchmesser) umschließt den Katheter wird 4-5 cm aus dem Katheter Ende gesetzt, um zu verhindern den Katheter ein Herausrutschen aus dem Darm (Abbildung 1). Nach der Sterilisation im Autoklaven, ist ein nicht-antibiotischen Salbe (Orbeseal) aseptisch in den Katheter Ende (3-5 mm) eingesetzt, dies sorgt dafür, dass der Katheter-Patent bleibt (dh es wird nicht angeschlossen, indem abgestoßen Schleimhaut innerhalb der Schleife).
  16. Durch einen kleinen Schnitt an der kranialen Aspekt eines jeden der drei Schleifen gelegt. Jedes Loch ist mit einem Katheter Einführhilfe (dh "Gefäßdilatator") erweitert, und eine 6-8 cm Segment des Katheters ist nach kaudal in eingefügtdie Schleife, bis der Ball geht Silcone in das Lumen (Abb. 1).
  17. Die Darmwand ist rund um die Katheter mit einer Tabaksbeutelnaht (2-0 Vicryl) gesichert. Der Katheter wird weiter in den Darm durch das Binden der Katheter mit der Ligatur Seide, die den kranialen Ende der Schleife abgegrenzt gesichert.
  18. Ampicillin (5 ml, 100 mg / ml in warmen PBS) ist in jeder Schleife und Zwischenraum eingespritzt, und der Darm wieder in den Bauchraum platziert. Cefazolin (8 ml, 100 mg / ml in warmen PBS) in die Bauchhöhle durch den Bauchschnitt injiziert.
  19. Eine einzige kleine Stichinzision wird durch die Bauchdecke direkt neben der Mittellinie Schnitt gemacht, und der Katheter sind über diese Website exteriorisierten.
  20. Die Position und die Spannung der Katheter wird in die Bauchhöhle angepasst. Bauchmuskeln werden mit einem einfachen Knopfnaht Muster (resorbierbares Nahtmaterial, Catgut Nr. 3) geschlossen, und die Haut wird mit einer unterbrochenen horizontalen Matratzen-Muster (nicht-resorbierbares Nahtmaterial; Supramid # 1) geschlossen.
  21. Eine gekrümmte hohle Rohr aus rostfreiem Stahl (7 mm ID, 10 mm OD, 65 cm lang) wird unter die Haut in der Nähe der Bauchschnitt eingesetzt, getunnelt unter die Haut, um eine Exit-Seite nur caudal bis zum Hals und zwischen den Schultern. Die Katheter werden in das Rohr eingeführt und vorangetrieben mindestens 50% der Rohrlänge. Das Rohr mit dem Katheter wird dann von der Haut an der Austrittsstelle gezogen, Freilegung der Katheter.
  22. Die Spannung der Katheter an der Stichinzision Ort angepasst, und die Haut wird mit Supramid # 1 geschlossen.
  23. Individual-Katheter sind identifiziert und in einen Verband "Beutel", die die Haut mit Supramid Nr. 1 vernäht. Der Beutel schützt die Katheter aus Folgeschäden.
  24. Post-operativ, sind Schafe IM mit Flunixin (sid) bei einer anfänglichen Dosis injiziert 2,2 mg / kg, gefolgt von einer Erhaltungsdosis von 1,1 mg / kg sid für 3 Tage. Schafe sind auch IM mit Hemostam (3 ml) und Enrofloxacin (2,5 mg / kg) injiziert sid für 3 und 5 Tagen, jeweils. Die Tiere sind auf intravenösen Plasmalyte 148 mit 5% Dextrose-Lösung kontinuierlich mit einer peristaltischen Pumpe verabreicht, um das Flow (145 ml / h) weiterhin unabhängig von der Körperhaltung beibehalten wird. Sie dürfen ad libitum trinken, aber füttern beschränkt ist, bis die normale Pansen-und Darmfunktion wiederhergestellt werden. Die Nahrungsaufnahme, Wasserverbrauch, Körpertemperatur, Passage von Kot und Urin, Darm Geräusche, Bauchbeschwerden, Benehmen und Blutzuckerkonzentration eng überwacht werden (bid); wenn nötig, Glucose-Konzentrationen in der intravenösen Flüssigkeiten sind so eingestellt, Blutzucker-Konzentrationen zu erhalten im normalen Bereich. Blut Chemie und Hämatologie (dh Albumin, alkalische Phosphatase, Alanin-Aminotransferase, Amylase, Calcium, Cholesterin, Kreatinin, Glucose, anorganischem Phosphat, Gesamt-Bilirubin, Gesamt-Protein, Harnstoff, Globulin, Natrium, Kalium, Chlorid, Partialdruck Sauerstoff, pH, teilweise Druck Kohlendioxid, Bicarbonat und insgesamt Kohlendioxid, rote und weiße Blutkörperchen, Hämatokrit, Hämoglobin, Differential Anzahl der weißen Blutkörperchen und Blutplättchen) werden vor und unmittelbar nach der Operation überwacht und jeden zweiten Tag danach. Sobald eine normale Darmfunktion beginnt, intravenöse Flüssigkeitszufuhr die Therapie beendet ist und die Tiere auf Weiden übertragen (dh 5-7 Tage nach der Operation). Die Tiere sind in den einzelnen Stifte (in Sichtweite von anderen Tieren), wodurch Stress und die Chance, Schaden zu nehmen, um ihre Katheter Beutel (z. B. Kauen von einem penmate) gepflegt.
  25. Um injizieren Behandlungen in einzelnen Schleifen, 5 ml der Behandlung in den Katheter mit einer sterilen Spritze mit einer 18-Gauge-, stumpf-Nadel ausgestattet injiziert. Um sicherzustellen, dass die Ablagerung von allen der Behandlung in der Schleife wird der Katheter dann mit 3 ml PBS injiziert.

Kritische Punkte:

Verfahren von entscheidender Bedeutung für den Erfolg dieser Operation sind: (1) Überprüfung, dass der Darm nicht auf sich selbst vor der Gründung der Anastomose verdreht, (2) Gewährleistung der Integrität und die Durchgängigkeit der Anastomose, (3) angemessener Sicherung des Katheters an die Schleife Wand mit der Ligatur Abgrenzung der kranialen Ende der Schleife, sondern sicherzustellen, dass die Anlage keinen Einfluss auf die Durchgängigkeit des Katheters, (4) Minimierung Darm-Handling und sicherzustellen, dass exteriorisierten Darm gehalten wird feucht; (5) für eine angemessene Katheter Spannung, (6) sicherzustellen, dass die Integrität des Katheters nicht während Muskel und Haut Naht betroffen; (7) verhindert Fressen von Schafen nach der Operation (dh während der Zeit des post-operativen Ileus), die im Pansen Impaktion und Wertminderungen führen kann Pansen-Funktion, und (8) die Gewährleistung, dass die Tiere ausreichend intravenöse Infusionen erhalten für die ersten 3-5 Tage nach der Operation sind, dass der Blutzuckerspiegel sorgfältig überwacht, und Glucose-Konzentrationen in der intravenösen Flüssigkeiten sind adjusTed, wenn notwendig, um einer Unterzuckerung vorzubeugen.

Abbildung 1
Abbildung 1. Eine schematische Darstellung der katheterisiert Ileum Schleifen. Beachten Sie die drei 15 cm lange Katheter "Schleifen", die zwei 15 cm lange nicht katheterisiert "Zwischenräume" zwischen den Schleifen, und die beiden 5 cm langen terminalen Segmenten etabliert, die alle innerhalb einer 85 cm langen "Darm-Segment etabliert "eines Schafes Ileum.

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Discussion

In diesem Verfahren konnten wir erfolgreich etablieren Katheter in Darmschlingen im Ileum von Schafen hergestellt. Durch die Einhaltung strenger post-operative Betreuung, Tiere schnell wieder aus dem Verfahren und wieder normale Aktivität 5-7 Tage nach der Operation. Wir haben festgestellt, dass die Errichtung von Kathetern innerhalb von Schleifen hat keinen Einfluss auf Darmschleimhaut oder Funktion des Immunsystems (Daten nicht gezeigt) und Tiere können für mindestens 8 Wochen nach der Operation zu leben. Dieses Verfahren ermöglicht es uns, mehrere Behandlungen in verschiedene immunologische Fächer einzuführen, über einen längeren Zeitraum, wenn Tiere von der Operation erholt und empirisch zu messen die physiologischen und immunologischen Auswirkungen dieser Behandlungen.

Eine wichtige Überlegung für zukünftige Experimente ist der Ort der intestinalen Segment innerhalb des Dünndarms. In diesem Verfahren haben wir operativ hergestellte der intestinalen Segment innerhalb des "immunologisch funktionellen Ileum", wie oft von Ileum (kontinuierlich) Peyer-Plaques (5,6) definiert. Dieser Bereich kann kranial erstrecken sich bis zu 2 m über Bauhin falten. Obwohl diese Region ist anatomisch wie das Jejunum als im Rahmen der immunologischen Funktion ist es Ileum, Hervorhebung der Bedeutung der Berücksichtigung Funktion bei der Beschreibung von Darm-Regionen.

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Disclosures

Alle Verfahren an Versuchstieren wurden von der Institutional Animal Care Committee genehmigt (Animal Verwenden Protokoll # 0609) und folgten den Richtlinien des Canadian Council of Animal Care setzen.

Wir haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Die Forschung konnte nicht ohne das Engagement und die Bemühungen vieler Personen an der Agriculture and Agri-Food Canada Research Centre, Lethbridge, Alberta, Kanada abgeschlossen haben. In diesem Zusammenhang bedanken wir uns bei: Tara Shelton für Pre-und post-operative Betreuung von Tieren, OP-Vorbereitung und Anästhesie, Analyse von Proben und die Unterstützung mit Video-Bildgebung; Randy Wilde und Estela Costa für pre-und post-operative Versorgung; Jenny Gusse für die Probenanalyse, Byron Lee für den Trokar Bild, und Brian Egland für Schafhaltung. Wir danken auch Brent Selinger (Department of Biological Sciences, University of Lethbridge) für die Bereitstellung von Video-Ausrüstung und Beratung sowie sonstige Unterstützung (dh ausführende Produktion) und die Curriculum Re-Development Centre, University of Lethbridge für die Videografie Know-how. Diese Studie wurde zum Teil durch Zuschüsse aus dem erweiterten Foods und Materialien Network (GDI), das Kanada-Alberta Beef Industry Development Fund (GDI) und Agriculture and Agri-Food Canada (GDI und JPK) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgical gloves Western Drug Distribution Center, Ltd. 103091
Surgical mask Western Drug Distribution Center, Ltd. MAX53013
Surgical gown The Veterinary Medication Distribution Center Inc., St. Hyacinthe, QE 3365
OB Apron Western Drug Distribution Center, Ltd. 900062
Surgical cap Western Drug Distribution Center, Ltd. 903271
EZ Scrub brush Western Drug Distribution Center, Ltd. BDC377479
Anesthetic machine Boyle -
Sodasorb Western Drug Distribution Center, Ltd. 108638
Laryngoscope Western Drug Distribution Center, Ltd. -
Laryngoscope blade (Miller blade #4) Western Drug Distribution Center, Ltd. 902667
Endotracheal tube (7.0 - 8.5 mm) Western Drug Distribution Center, Ltd. -
Lidocaine endotracheal spray Western Drug Distribution Center, Ltd. 103364
Acepromazine Western Drug Distribution Center, Ltd. AUS01020
Glycopyrrolate Western Drug Distribution Center, Ltd. SAB2880
Butorphanol tartrate Western Drug Distribution Center, Ltd. AYE304541
Diazepam Western Drug Distribution Center, Ltd. sab790
Thiopental sodium Western Drug Distribution Center, Ltd. 103508
Epinephrine hydrochloride Western Drug Distribution Center, Ltd. 103856
Doxapram Strathcona Pharmacy -
Isoflurane Western Drug Distribution Center, Ltd. 100339
Hemostam Western Drug Distribution Center, Ltd. 103857
Flunixin Western Drug Distribution Center, Ltd. sch140100
Enrofloxacin Western Drug Distribution Center, Ltd. hll0049
Metronidazole Western Drug Distribution Center, Ltd. 101653
Ampicillin Western Drug Distribution Center, Ltd. NOV67185-6
Cefazolin Western Drug Distribution Center, Ltd. nov69397
Electroscapel Macan MV8
Heating mat Kane PHMD-48
Stomach tube (Nalgene tubing 5/16" ID) Fisher Scientific -
Needle driver Western Drug Distribution Center, Ltd. 108338
Addison brown forcep Western Drug Distribution Center, Ltd. 911075
Rat tooth forcep The Veterinary Medication Distribution Center Inc., St. Hyacinthe, QE 5275
Kelly forcep Western Drug Distribution Center, Ltd. 901133
Mosquito hemostat Western Drug Distribution Center, Ltd. 108471
Carmalt forcep Western Drug Distribution Center, Ltd. 901225
Scalpel handle Western Drug Distribution Center, Ltd. 900285
Scalpel blade #22 Western Drug Distribution Center, Ltd. 900511
Metzenbaum scissor Western Drug Distribution Center, Ltd. 901166
Sharp-sharp scissor Western Drug Distribution Center, Ltd. 108264
Towel clamp Western Drug Distribution Center, Ltd. 901213
Allis tissue forcep Western Drug Distribution Center, Ltd. 901201
Doyen’s forcep Western Drug Distribution Center, Ltd. 904226
Stainless steel bowl Western Drug Distribution Center, Ltd. 903601
Stainless steel trocar (curved) Local Supplier -
Catheter introducer Western Drug Distribution Center, Ltd. 11440
Surgical towel The Veterinary Medication Distribution Center Inc., St. Hyacinthe, QE 7972
Disposable drape Western Drug Distribution Center, Ltd. 900035
Steri drape The Veterinary Medication Distribution Center Inc., St. Hyacinthe, QE 2323
Drape (40 x 40 cm) The Veterinary Medication Distribution Center Inc., St. Hyacinthe, QE 8358
Surgical drape (7" x 11 ¼" opening) The Veterinary Medication Distribution Center Inc., St. Hyacinthe, QE 2694
Vicryl (2-0) Western Drug Distribution Center, Ltd. JJMJ333H
Silk 2-0 Western Drug Distribution Center, Ltd. 105248
Catgut #3 Western Drug Distribution Center, Ltd. CSL547-2070
Supramid #1 Western Drug Distribution Center, Ltd. CSL547-3040
Needles (cutting and non-cutting) Western Drug Distribution Center, Ltd. -
Silastic tubing (0.040" ID, 0.085" OD) Fisher Scientific 11-189-15D
Orbeseal ointment Western Drug Distribution Center, Ltd. 106344
Clear silicone (732 multi-purpose sealant) Local Supplier -
Blunt end needle Western Drug Distribution Center, Ltd. 905035
Marker (permanent industrial) Local Supplier -
Catheter pouch (constructed of Elastoplast 7.5 cm) Western Drug Distribution Center, Ltd. 104094
Hospital tape (2") Western Drug Distribution Center, Ltd. 103842
Hospital tape (1") Western Drug Distribution Center, Ltd. VLMRENF20
Gauze sponge 4x4 Western Drug Distribution Center, Ltd. 107551
Gauze cling Western Drug Distribution Center, Ltd. 107633
Elastoplast 7.5cm Western Drug Distribution Center, Ltd. 104094
Elastoplast rippable bandage Western Drug Distribution Center, Ltd. 104093
Syringe (60 ml) Western Drug Distribution Center, Ltd. 104004
Syringe (10 ml) Western Drug Distribution Center, Ltd. bdc301604
25G Needle Western Drug Distribution Center, Ltd. BDC305122
20G Needle Western Drug Distribution Center, Ltd. BDC305175
18G Needle Western Drug Distribution Center, Ltd. 903353
Intracath IV catheter (16G 8") Western Drug Distribution Center, Ltd. bdc3831621
IV administration set (10 drop) Western Drug Distribution Center, Ltd. 101797
0.9% NaCl solution Western Drug Distribution Center, Ltd. BAXJB1322P
Plasmalyte 148 solution Western Drug Distribution Center, Ltd. BAXJB2534
Dextrose Western Drug Distribution Center, Ltd. MCT60190
Peristaltic pump Cole-Parmer 7524-10
Livestock identification tag cement Local Supplier -
Germex solution Western Drug Distribution Center, Ltd. mtc60270
Isopropyl alcohol Western Drug Distribution Center, Ltd. 104590
Stanhexidine cleanser Western Drug Distribution Center, Ltd. 109248
Prepodyne solution Western Drug Distribution Center, Ltd. 105710
Prepodyne scrub Western Drug Distribution Center, Ltd. 105711

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References

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Uwiera, R. R. E., Kastelic, J. P.,More

Uwiera, R. R. E., Kastelic, J. P., Inglis, G. D. Catheterization of Intestinal Loops in Ruminants. J. Vis. Exp. (28), e1301, doi:10.3791/1301 (2009).

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